Xây dựng và đánh giá qui trình phát hiện Acinetobacter baumannii bằng real-time PCR

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> <br /> XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH PHÁT HIỆN<br /> ACINETOBACTER BAUMANNII BẰNG REAL-TIME PCR<br /> Nguyễn Tuấn Anh*, Đào Minh Ý **, Huỳnh Thị Thúy Hạnh**, Hồ Huỳnh Thùy Dương*,***<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Nhiễm khuẩn bệnh viện đang là vấn đề rất được quan tâm vì hầu hết các tác nhân là những vi<br /> khuẩn đa kháng thuốc. Một trong những vi khuẩn hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay là<br /> Acinetobacter baumannii. Vi khuẩn này thường có biểu hiện kiểu hình đa kháng sinh và liên quan đến các trường<br /> hợp nhiễm khuẩn đặc biệt nghiêm trọng ở bệnh viện.<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng qui trình real-time PCR phát hiện A. baumannii.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Qui trình real-time PCR tối ưu cho phản ứng nhân bản gene blaOXA-51 đặc<br /> trưng cho A. baumannii và gene 16S rRNA đặc trưng cho Acinetobacter spp. được xây dựng. Kết quả phát hiện<br /> A. baumannii bằng real-time PCR được so sánh với kết quả định danh A. baumannii bởi hệ thống định danh vi<br /> sinh tự động Phoenix (BD).<br /> Kết quả: Kết quả cho thấy qui trình có thể phát hiện chính xác A. baumannii dựa vào gene blaOXA-51 với độ<br /> nhạy là 11 bản sao/phản ứng và độ đặc hiệu cao. Tỉ lệ phát hiện A. baumannii đạt 90,8%; trong khi phương pháp<br /> vi sinh tự động là 70,8% trên những mẫu khảo sát.<br /> Kết luận: Qui trình real-time PCR phát hiện A. baumannii đã được xây dựng thành công. Qui trình có thể<br /> được sử dụng để phát hiện nhanh các chủng A. baumannii dựa trên gene blaOXA-51 trong môi trường bệnh viện.<br /> Từ khóa: A. baumannii, carbapenemase, blaOXA-51, meronem, real-time PCR.<br /> ABSTRACT<br /> DEVELOPMENT AND EVALUATION OF A REAL-TIME PCR ASSAY FOR THE DETECTION OF<br /> ACINETOBACTER BAUMANNII<br /> Nguyen Tuan Anh, Đao Minh Y, Huynh Thi Thuy Hanh, Ho Huynh Thuy Duong<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 19 - No 5 - 2015: 194 - 199<br /> <br /> Backgrounds: Nosocomial infections are currently serious problems for community health since they are<br /> mostly multidrug resistant bacteria. One of the leading agents causing nosocomial infections is Acinetobacter<br /> baumannii. Early and Accurate detection of these bacteria are of great important due to their frequent multidrug<br /> resistibility.<br /> Objectives: The study aimed to develop a real-time PCR protocol to detect A. baumannii.<br /> Methods: The real-time PCR was optimized to amplify blaOXA-51 and 16S rRNA genes specific to A.<br /> baumanii and Acinetobacter spp. correspondingly. The identification of A. baumannii by real-time PCR was<br /> compared to those obtained with Phoenix bacterial identification system.<br /> Results: The result showed that the real-time PCR protocol correctly detect A. baumaniii based on blaOXA-<br /> 51 gene with the sensitivity of 11 copies/reaction. Detection rate for A. baumannii was 90.8% and 70.8% by real-<br /> time PCR and automatic bacterial detection system respectively.<br /> <br /> **<br /> * Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương Khoa Vi sinh, Bệnh viện Đa khoa Đồng Nai<br /> ***<br /> Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Tuấn Anh ĐT: 0917 010198 Email: ntanhbio@gmail.com<br /> <br /> 194 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Conclusions: The real-time PCR protocol could be used for rapid identification of A. baumannii in hospital<br /> environment.<br /> Keywords: A. baumannii, carbapenemase, blaOXA-51, meronem, real-time PCR<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ 48 giờ, trong khi đối với hệ thống real-time PCR<br /> là 4-6 giờ(4,7). Phương pháp real-time PCR đã<br /> Acinetobacter baumannii (A. baumannii) là vi được ứng dụng để phát hiện rất nhiều vi sinh<br /> khuẩn Gram (-) thuộc họ Moraxellaceae, bao vật gây bệnh nói chung và A. baumannii nói<br /> gồm Acinetobacter baumannii, Acinetobacter pittii, riêng, đặc biệt những chủng kháng thuốc, từ<br /> Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter lwoffii, nhiều nguồn khác nhau(2,4,6,7). Hệ thống real-time<br /> Acinetobacter parvus, Acinetobacter nosocomialis … PCR trong nghiên cứu này sử dụng mẫu dò Taq-<br /> Các loài này đều có khả năng gây bệnh cho Man để nhân bản và phát hiện vùng gene<br /> người, trong đó A. baumannii chiếm hơn 80% blaOXA-51 của A. baumannii. Gene blaOXA-51<br /> <br /> trường hợp nhiễm khuẩn được phát hiện. A. được chọn vì nó hiện diện ở tất cả các chủng A.<br /> baumannii thường cư trú trong đất và nước(3), baumannii, đặc biệt là những chủng có khả năng<br /> nhưng được tìm thấy ngày càng nhiều trong kháng carbapenem. Trình tự mồi và mẫu dò<br /> những trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện, nơi được thiết kế tương ứng với vùng trình tự bảo<br /> mà tình hình kháng kháng sinh ngày càng tăng, tồn của gene blaOXA-51 và các gen giống blaOXA-<br /> và các chủng A. baumannii phân lập từ đây cũng 51 (blaOXA-51 like) ở các chủng A. baumannii. Hệ<br /> cho thấy đa số là các chủng kháng đa thuốc(3,7). Vì thống còn kết hợp thêm một bộ mồi và mẫu dò<br /> thế, A. baumannii là đối tượng rất được quan tâm được thiết kế trên vùng gene 16S rRNA để phát<br /> ở các bệnh viện và đơn vị chăm sóc sức khỏe hiện các chủng vi khuẩn Acinetobacter spp. khác.<br /> cộng đồng ở Việt Nam và trên thế giới(9,10). Vì thế, kết quả của hệ thống real-time PCR này là<br /> Với khả năng sống sót trên nhiều môi khả năng phát hiện A. baumannii nói riêng và các<br /> trường khác nhau, đặc biệt môi trường bề mặt chủng Acinetobacter spp. nói chung.<br /> khô và tĩnh, vi khuẩn có thể tồn tại lâu dài ở<br /> Mục tiêu nghiên cứu<br /> các thiết bị trong bệnh viện, khi đó nhiễm<br /> khuẩn bệnh viện có thể xảy ra khi bệnh nhân Xây dựng và đánh giá qui trình real-time<br /> tiếp xúc với các thiết bị này(3,7). Đặc biệt với các PCR phát hiện nhanh A. baumannii nhằm tiến tới<br /> thiết bị xâm lấn, vi khuẩn càng dễ dàng xâm hoàn thiện một công cụ chẩn đoán phân tử, giúp<br /> nhập vào máu. Ngoài ra, vi khuẩn có thể được kiểm soát sự nhiễm vi khuẩn này ở bệnh nhân<br /> tìm thấy trên da người khỏe mạnh(3), nhất là cũng như trong môi trường bệnh viện.<br /> nhân viên chăm sóc sức khỏe. Vì thế, vi khuẩn PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> có thể lan truyền thông qua tiếp xúc giữa<br /> Vật liệu nghiên cứu<br /> người với người, không chỉ với các bề mặt hay<br /> môi trường bị nhiễm. Cá nhân có hệ miễn dịch Vi khuẩn A. baumannii (ATCC 19606) và các<br /> suy yếu đặc biệt nhạy cảm với vi khuẩn này(7). mẫu vi khuẩn A. baumannii được phân lập từ<br /> Nhiễm khuẩn do A. baumannii gây ra thường bệnh phẩm của bệnh nhân điều trị ở bệnh viện<br /> là nhiễm khuẩn hô hấp và nhiễm khuẩn Đồng Nai trong thời gian từ tháng 01/2013 đến<br /> đường niệu, cũng như các triệu chứng lâm tháng 1/2014.<br /> sàng nguy hiểm khác bao gồm viêm phổi, Thiết kế mẫu dò<br /> nhiễm trùng máu và viêm Các cặp mồi đặc hiệu cho gene blaOXA-51 của<br /> màng não (1,2,5,7) . A. baumannii và gene 16S rRNA của Acinetobacter<br /> Thời gian phát hiện A. baumannii bằng spp. đã được công bố trước đây(10). Chúng tôi<br /> phương pháp nuôi cấy truyền thống mất từ 24- thiết kế thêm cho mỗi vùng gene được nhân bản<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 195<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> một mẫu dò đặc hiệu tương ứng (Bảng 1) bằng dấu màu FAM. Mẫu dò gene 16S rRNA được<br /> các phần mềm sinh học phân tử chuyên dụng đánh dấu màu HEX. Mồi và mẫu dò được đặt<br /> như PrimerQuest, Oligo Analyzer, Annhyb, và tổng hợp tại công ty IDT (Integrated DNA<br /> Blast (NCBI). Mẫu dò gene blaOXA-51 được đánh Technologies, USA).<br /> Bảng 1. Trình tự các mẫu dò được thiết kế<br /> o<br /> Mẫu dò Trình tự mẫu dò (5’ 3’) Kích thước (bp) Tmmẫu dò ( C)<br /> OXA51-P 5’-FAM-CGACTTGGGTACCGATATCTGCATTGC-BHQ1-3’ 27 61.3<br /> 16S rRNA-P 5’-HEX-ACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACG-BHQ1-3’ 25 61.5<br /> <br /> Phương pháp tách chiết DNA của A. real-time PCR tối ưu là hiệu suất phản ứng (E) từ<br /> baumannii 90% - 105% và hệ số tương quan (R2) > 0,980.<br /> Tính đặc hiệu của qui trình được đánh giá qua<br /> Khuẩn lạc đơn, đặc trưng của A. baumannii<br /> khả năng phát hiện đúng DNA của A. baumannii<br /> được thu nhận và tăng sinh trong môi trường<br /> mà không phát hiện nhầm lẫn vật liệu di truyền<br /> LB ở điều kiện 370C trong 16-24 giờ. Sau khi kết<br /> của các vi khuẩn khác. Độ nhạy hay giới hạn<br /> thúc tăng sinh, DNA bộ gene của A. baumannii<br /> phát hiện của qui trình là số bản sao A. baumannii<br /> được tách chiết theo nguyên tắc hấp phụ đặc<br /> tối thiểu mà hệ thống còn cho tín hiệu và kết quả<br /> hiệu lên pha rắn (màng silica) bằng bộ kit tách<br /> dương tính. Phương pháp thống kê mô tả được<br /> chiết “DNA column-based extraction kit”<br /> sử dụng để đánh giá / so sánh khi quy trình<br /> (Khoa Thương). Tất cả mọi thao tác đều được<br /> được áp dụng thử nghiệm.<br /> thực hiện theo đúng hướng dẫn trong bộ kit<br /> của nhà sản xuất. KẾT QUẢ<br /> Thành phần và điều kiện phản ứng real- Tối ưu phản ứng real-time PCR có một cặp<br /> time PCR mồi/mẫu dò<br /> Thành phần hỗn hợp phản ứng real-time Hiệu quả nhân bản của phản ứng real-time<br /> PCR có thành phần gồm 1X AptaTaq Fast DNA PCR có một cặp mồi/mẫu dò<br /> polymerase (Roche), 200 nM cho từng cặp mồi Hiệu quả nhân bản của từng cặp mồi/mẫu<br /> xuôi và ngược (IDT), 100 nM cho từng loại mẫu dò được kiểm tra trên mẫu DNA (1,42x105 bản<br /> dò (IDT), 5μl DNA trong tổng thể tích là 25μl. sao/μl) tách chiết từ vi khuẩn A. baumannii<br /> Chương trình nhiệt cho phản ứng real-time PCR: (ATCC 19606), được pha loãng bậc 10 đến<br /> 40 chu kỳ gồm 15 giây - 95oC và 15 giây - 60oC. nồng độ 1,42x101 bản sao/μl. 5μl DNA được<br /> Tín hiệu được thu nhận với hai màu huỳnh dùng cho mỗi phản ứng với thành phần và<br /> quang đặc trưng là FAM (510-530 nm) và HEX điều kiện phản ứng như trên. Mỗi nồng độ<br /> (560-580 nm). Qui trình có thể được thực hiện được chạy lặp lại 3 lần.<br /> trên các dòng máy luân nhiệt Stratagene<br /> Bảng 2. Giá trị Ct hiệu quả phản ứng real-time PCR<br /> Mx3000P hoặc Mx3005P (Agilent), CFX96 (Bio-<br /> có một cặp mồi/mẫu dò.<br /> Rad), Rotogene (Qiagen), LightCyler (Roche). bla<br /> Mẫu (bản sao/μl) OXA-51 16S rRNA<br /> 5<br /> Phương pháp tối ưu qui trình real-time 1,42x10 17,9±0,2 19,9±0,5<br /> 4<br /> PCR 1,42x10 21,4±1,3 23,6±0,3<br /> 3<br /> 1,42x10 24,3±0,5 27,5±0,3<br /> Qui trình real-time PCR phát hiện A. 1,42x10<br /> 2<br /> 27,3±0,8 30,9±2,2<br /> baumannii được xây dựng qua các bước chính: (1) 1,42x10<br /> 1<br /> 32,3±0,9 36,0±0,5<br /> tối ưu hóa phản ứng có một cặp mồi/mẫu dò, (2) E 94,4 79,7<br /> 2<br /> tối ưu hóa phản ứng có hai cặp mồi/mẫu dò, (3) R 0,981 0,981<br /> đánh giá độ nhạy và tính đặc hiệu và (4) thử Kết quả (Bảng 2) cho thấy phản ứng real-<br /> nghiệm qui trình. Tiêu chí đánh giá phản ứng time PCR phát hiện blaOXA-51 đã đạt điều kiện<br /> <br /> <br /> 196 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> tối ưu (E = 94,4% và R2 = 0,981). Tuy nhiên, phản Bảng 4. Giá trị Ct hiệu quả phản ứng real-time PCR<br /> ứng real-time PCR phát hiện 16S rRNA chưa tối có hai cặp mồi/mẫu dò<br /> ưu (E = 79,9%). Real-Time PCR real-time PCR<br /> Mẫu (bản sao/μl) OXA-51 16S rRNA<br /> Chúng tôi không khảo sát tính đặc hiệu cũng 4<br /> 1,42x10 22,3±0,4 22,4±0,1<br /> như nhiệt độ lai (Ta) tối ưu của từng cặp mồi vì 3<br /> 1,42x10 25,8±0,3 25,8±0,2<br /> đã được chứng minh trong công trình trước(8). 1,42x10<br /> 2<br /> 29,5±0,3 29,5±0,2<br /> Tối ưu phản ứng real-time PCR phát hiện 16S E 90,1 92,0<br /> 2<br /> R 0,992 0,996<br /> rRNA<br /> Kết quả (Bảng 4) cho thấy thành phần phản<br /> Phản ứng real-time PCR phát hiện 16S rRNA<br /> ứng real-time PCR đã đạt điều kiện chuẩn với<br /> được tối ưu với ba nồng độ AptaTaq (Roche) là<br /> hiệu suất phản ứng và hệ số tương quan đối với<br /> 1X, 1,5X và 2X.<br /> blaOXA-51 và 16S rRNA lần lượt là 90,1/0,992 và<br /> Bảng 3. Giá trị Ct phản ứng real-time PCR phát hiện<br /> 92,0/0,996. Tuy nhiên, khi so sánh giá trị Ct trung<br /> 16S rRNA bình của phản ứng real-time PCR một cặp<br /> Mẫu (bản sao/μl) 1X 1,5X 2X<br /> 4 mồi/mẫu dò và hai cặp mồi/mẫu dò trên từng<br /> 1,42x10 24,5±0,9 19,8±1,0 22,6±0,3<br /> 1,42x10<br /> 3<br /> 30,1±0,6 23,2±1,1 26,5±0,9 nồng độ mẫu chuẩn tương ứng thì thấy rằng giá<br /> 1,42x10<br /> 2<br /> 34,8±0,3 26,6±1,2 30,8±0,8 trị Ct của phản ứng hai cặp mồi/mẫu dò cao hơn<br /> E 56,6 95,3 76,0 phản ứng một cặp mồi/mẫu dò. Điều này có<br /> 2<br /> R 0,997 1,000 0,998 nghĩa là hiệu quả nhân bản của phản ứng có hai<br /> Kết quả (Bảng 3) cho thấy thành phần phản cặp mồi/mẫu dò thấp hơn phản ứng có một cặp<br /> ứng với AptaTaq 1,5X là điều kiện tốt nhất, vì mồi/mẫu dò. Để tăng hiệu quả nhân bản của<br /> hiệu suất phản ứng (95,3%) và hệ số tương quan phản ứng real-time PCR có hai cặp mồi/mẫu dò,<br /> (1,000) đạt chuẩn. chúng tôi phải tiếp tục tối ưu hóa phản ứng này.<br /> Tối ưu phản ứng real-time PCR có hai cặp Tối ưu hóa phản ứng real-time PCR phát hiện<br /> mồi/mẫu dò đồng thời blaOXA-51 và 16S rRNA<br /> Hiệu quả phản ứng real-time PCR phát hiện Để tăng tăng hiệu quả nhân bản và đảm bảo<br /> đồng thời blaOXA-51 và 16S rRNA các thông số phản ứng real-time PCR có hai cặp<br /> mồi/mẫu dò đạt chuẩn, thành phần hỗn hợp<br /> Sự kết hợp hai cặp mồi/mẫu dò phát hiện<br /> blaOXA-51 và 16S rRNA trong cùng một phản<br /> enzyme AptaTaq được khảo sát với ba nồng độ<br /> 1,5X, 2X và 2,5X.<br /> ứng cho phép phát hiện A. baumannii và các loài<br /> vi khuẩn Acinetobacter spp. khác.<br /> Bảng 6. Giá trị Ct tối ưu hóa nồng độ enzyme AptaTaq<br /> Real-Time PCR 1,5X 2X 2,5X<br /> Mẫu (bản sao/μl) OXA-51 16S rRNA OXA-51 16S rRNA OXA-51 16S rRNA<br /> 4<br /> 1,42x10 21,9±0,2 21,4±0,7 20,1±0,3 19,3±0,3 20,8±0,1 21,1±0,8<br /> 3<br /> 1,42x10 25,2±0,0 24,8±0,5 23,4±0,3 22,6±0,3 23,9±0,1 24,8±0,2<br /> 2<br /> 1,42x10 28,5±0,1 28,1±0,8 26,6±0,4 25,9±0,1 25,8±1,4 26,3±1,3<br /> E 100,1 100,1 103,5 101,7 148,4 139,1<br /> 2<br /> R 0,998 0,957 0,991 0,995 0,890 0,860<br /> Kết quả (Bảng 6) cho thấy tại nồng độ thức còn lại, và tương đương với giá trị Ct của<br /> AptaTaq 2X, giá trị các thông số real-time PCR phản ứng real-time PCR có một cặp mồi/mẫu dò.<br /> đạt chuẩn trong phản ứng có hai cặp mồi/mẫu Điều này chứng tỏ phản ứng real-time PCR có<br /> dò. Hơn nữa, giá trị Ct của các mẫu thử của hai cặp mồi/mẫu dò đã tối ưu và đạt hiệu quả<br /> nghiệm thức này thấp nhất so với hai nghiệm nhân bản mong muốn.<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 197<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> Độ nhạy và đặc hiệu Độ nhạy của phản ứng real-time PCR có hai<br /> Độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR có cặp mồi/mẫu dò được đánh giá bằng mẫu DNA<br /> hai cặp mồi/mẫu dò vi khuẩn A. baumannii (ATCC 19606) có nồng độ<br /> 2,2x107 bản sao/μl, được pha loãng bậc 10 thành<br /> Độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR có<br /> 7 nồng độ nhỏ hơn. Thành phần real-time PCR<br /> hai cặp mồi/mẫu dò được xác định bằng cách<br /> đã tối ưu bao gồm hỗn hợp enzyme AptaTaq 2X<br /> thực hiện phản ứng trên mẫu DNA có nguồn<br /> (Roche), 200 nM IC-F/R (IDT), 100 nM IC-P<br /> gốc từ chủng A. baumannii (ATCC 19606), đồng<br /> (IDT), 200 nM O51-F/R (IDT), 100 nM O51-P<br /> thời với DNA từ 12 chủng vi khuẩn khác bao<br /> (IDT) và 5.0 μl DNA trong tổng thể tích là 25 μl.<br /> gồm E. coli O157, Salmonella typhimurium,<br /> Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: 40 chu kỳ 10<br /> Salmonella para typhimurium, Staphylococcus<br /> giây – 95oC, 15 giây - 60oC.<br /> aureus, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae,<br /> Vibrio parahaemolyticus, Campylobacter coli, Bảng 7. Giá trị Ct độ nhạy của phản ứng real-time<br /> Campylobacter jejuni, Clostridium botulinum, PCR có hai cặp mồi/mẫu dò<br /> bla<br /> A. baumannii (bản sao/phản ứng) OXA-51 16S rRNA<br /> Shigella boydii và Shigella flexneri. 7<br /> 1,1x10 16,6±0,3 16,7±0,9<br /> 6<br /> 1,1x10 19,8±0,8 20,4±0,9<br /> 5<br /> 1,1x10 23,9±0,3 25,1±0,5<br /> 4<br /> 1,1x10 27,8±0,1 29,3±0,2<br /> 3<br /> 1,1x10 30,3±0,8 32,1±0,9<br /> 2<br /> 1,1x10 32,8±1,0 33,7±0,6<br /> 1<br /> 1,1x10 36,5±0,9 37,2±1,0<br /> 0<br /> 1,1x10 N/A N/A<br /> Kết quả (Bảng 7) cho thấy độ nhạy ổn định<br /> Hình 1: Đường chạy mẫu DNA của A.baumannii và<br /> đạt được của quy trình real-time PCR có hai cặp<br /> các vi khuẩn khác<br /> mồi/mẫu dò là 1,1x101 bản sao/phản ứng.<br /> Kết quả (Hình 1) cho thấy chỉ có DNA của<br /> A. baumannii cho tín hiệu dương tính, với tín<br /> Thử nghiệm qui trình<br /> hiệu (màu vàng) của blaOXA-51 và tín hiệu Qui trình real-time PCR có hai cặp mồi/mẫu<br /> (màu xanh) của 16S rRNA. Các mẫu DNA của dò được áp dụng trên 65 mẫu vi khuẩn thu thập<br /> các vi khuẩn khác không cho tín hiệu dương từ bệnh viện Đồng Nai (2013 - 2014), so sánh với<br /> tính với cả hai gene đích của qui trình. Điều kết quả định danh vi khuẩn bằng hệ thống định<br /> này chứng tỏ qui trình được xây dựng đặc danh tự động Phoenix (BD) đang thực hiện tại<br /> hiệu với A. baumannii. bệnh viện.<br /> <br /> Độ nhạy của phản ứng real-time PCR có hai<br /> cặp mồi/mẫu dò<br /> Bảng 8. Kết quả phát hiện A. baumannii / Acinetobacter spp.<br /> Real-time PCR<br /> bla<br /> Kết quả tương quan 16S rRNA OXA-51<br /> (+) (-) (+) Tổng<br /> A. baumannii 31 4 27 31<br /> Vi sinh A. baumannii/A. baumannii complex 15 0 15 15<br /> tự động Acinetobacter spp. 18 1 17 18<br /> Vi khuẩn khác 1 1 0 1<br /> Tổng 65 6 59 65<br /> Kết quả phát hiện Acinetobacter spp. bởi cho thấy trong số 65 chủng vi khuẩn được khảo<br /> phương pháp vi sinh tự động với real-time PCR sát, phương pháp vi sinh tự động phát hiện tổng<br /> <br /> <br /> 198 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> cộng 98,5% (64/65) chủng Acinetobacter spp., bao hiện nhanh các chủng vi khuẩn này trong môi<br /> gồm cả A. baumannii và A. baumannii complex. trường bệnh viện.<br /> Phương pháp real-time PCR phát hiện 100% TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> (65/65) chủng là Acinetobacter spp. Như vậy, tỉ lệ 1. Azizi et al. (2015). Molecular Detection of Class-D OXA<br /> tương đồng giữa hai phương pháp trong việc Carbapenemase Genes in Biofilm and Non-Biofilm Forming<br /> Clinical Isolates of Acinetobacter baumannii. Jundishapur J<br /> phát hiện Acinetobacter spp. là 98,5% (64/65) các<br /> Microbiol 8(1), p. e21042.<br /> trường hợp khảo sát. 2. De Gregorio et al. (2015). Development of a real-time PCR<br /> assay for the rapid detection of Acinetobacter baumannii from<br /> Để phát hiện A. baumannii / A. baumannii<br /> whole blood samples. New Microbiol 38(2), p. 251-7.<br /> complex, phương pháp vi sinh tự động phát 3. Ecker et al. (2006). Identification of Acinetobacter species and<br /> hiện được 70,8% (46/65) chủng, còn lại là 27,7% genotyping of Acinetobacter baumannii by multilocus PCR<br /> and mass spectrometry. J Clin Microbiol 44(8), p. 2921-32.<br /> (19/65) các chủng Acinetobacter spp. và vi khuẩn 4. Huang et al. (2012). Development and validation of a<br /> khác; phương pháp real-time PCR phát hiện multiplex TaqMan real-time PCR for rapid detection of genes<br /> 90,8% (59/65) chủng, còn lại là 9,2% (6/65) các encoding four types of class D carbapenemase in<br /> Acinetobacter baumannii. J Med Microbiol 61(Pt 11), p. 1532-7.<br /> chủng Acinetobacter spp. khác. Có nhiều chủng 5. Luo et al. (2015). Association of blaOXA-23 and bap with the<br /> (17/65) có kết quả định danh theo phương pháp persistence of Acinetobacter baumannii within a major<br /> healthcare system. Front Microbiol 6, p. 182.<br /> vi sinh là Acinetobacter spp. nhưng lại cho kết quả 6. Martin-Pena et al. (2013). Rapid detection of antibiotic<br /> real-time PCR xác định là A. baumannii. Điều này resistance in Acinetobacter baumannii using quantitative real-<br /> phần lớn do đặc trưng riêng của mỗi phương time PCR. J Antimicrob Chemother 68(7), p. 1572-5.<br /> 7. McConnell et al. (2012). Quantitative real-time PCR for<br /> pháp. Nhiều trường hợp phương pháp vi sinh detection of Acinetobacter baumannii colonization in the<br /> không thể định danh đến A. baumannii vì khả hospital environment. J Clin Microbiol 50(4), p. 1412-4.<br /> 8. Nguyễn Tuấn Anh, Huỳnh Minh Tuấn, Nguyễn Văn Vĩnh<br /> năng thực tế là vi khuẩn tồn tại ở dạng một phức<br /> Châu, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2014). Xây dựng qui trình<br /> hệ vi khuẩn Acinetobacter spp. bao gồm nhiều EvaGreen real-time PCR phát hiện các gen blaOXA ở<br /> chủng vi khuẩn khác nhau nhưng cùng loài, nên Acinetobacter baumannii. Tạp chí Y học Thành Phố 18(5), p.<br /> 197-201.<br /> khó khăn trong việc định danh bằng các phương 9. Trip et al. (2015). Simultaneous Identification of Multiple beta-<br /> pháp sinh hóa thông thường. Điều này cũng nói Lactamases in Acinetobacter baumannii in Relation to<br /> lên được đặc điểm khác biệt của real-time PCR, Carbapenem and Ceftazidime Resistance, Using Liquid<br /> Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. J Clin<br /> chỉ phát hiện chính xác đoạn gene chỉ thị đối Microbiol 53(6), p. 1927-30.<br /> tượng cần phát hiện mà không cho thấy sự hiện 10. Zowawi et al. (2015). Molecular epidemiology of carbapenem-<br /> resistant Acinetobacter baumannii isolates in the Gulf<br /> diện của những chủng vi khuẩn trong phức hệ, Cooperation Council States: dominance of OXA-23-type<br /> trừ phi một qui trình real-time PCR có nhiều hơn producers. J Clin Microbiol 53(3), p. 896-903.<br /> hai cặp mồi/mẫu dò khác được xây dựng và áp<br /> dụng trong trường hợp này.<br /> Ngày nhận bài báo: 28/8/2015<br /> KẾT LUẬN Ngày phản biện nhận xét bài báo: 16/9/2015<br /> Tóm lại, qui trình real-time PCR vừa xây Ngày bài báo được đăng: 20/10/2015<br /> dựng cho phép phát hiện các chủng A. baumannii<br /> đặc hiệu và nhạy, có thể được ứng dụng để phát<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 199<br />