Xây dựng quy trình định lượng dioscin từ hoa thốt nốt (Borassus flabellifer L.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Xây dựng quy trình định lượng dioscin từ hoa thốt nốt (Borassus flabellifer L.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao với mục đích của nghiên cứu này là xây dựng được quy trình định lượng dioscin từ hoa thốt nốt. Một quy trình định tính, định lượng dioscin nhanh chóng, hiệu quả bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng quy trình định lượng dioscin từ hoa thốt nốt (Borassus flabellifer L.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao

QUANTITATIVE ANALYSIS OF DIOSIN IN Borassus flabellifer L. FLOWER BY HPLC Nguyen Pham Tuan1*, Tran Thi Que1, Nguyen Hoang Nam1, and Nguyen Hoang Thai1 1 An Giang Biotechnology center, Chau Thanh district, An Giang province *Corresponding author: ngphamtuan1983@gmail.com Tel: +84.0988.202055 Abstract The study introduced a HPLC method for quantitative analysis of dioscin in Borassus flabellifer flower. A rapid and effective HPLC method is described for the assay of diosin in me 20 µL of dioscin solution was injected onto a C8 reverse phase column (5 µm, 120 Å, 4.6×150 mm). The mobile phase employed was acetonitrile: water (65: 40, v/v) at a flow rate of 0.8 mL/min. The column effluent was monitored within 5 minutes by diot array detection at 209 nm. The retention time of dioscin was found to be 5.02 minutes. In the concentration range of 60 - 300 μg/mL, there was a tight linear correlation between peak area y (mAU.min) and sample concentration x (μg/mL) according to the equation y = 6854.4x + 7144.4 as the squared correlation coefficient R2 was 0.997. The limit of detection and limite of quantification were respectively 2 and 6.6 μg/mL. The method was specific to dioscin with good precision and accuracy. The percentage recovery was ≤ 100 ± 4%, the relative standard deviation of the repeatability was ≤ 1.69% and the relative standard deviation of the intermediate precision was ≤ 1.85%.dicinal plant. Keywords: HPLC, Borassus flabellifer, dioscin, accuracy, precision. 190
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG DIOSCIN TỪ HOA THỐT NỐT (Borassus flabellifer L.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÂNG CAO Nguyễn Phạm Tuấn1*, Trần Thị Quế1, Nguyễn Hoàng Nam1 và Nguyễn Hoàng Thái1 1 Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang, huyện Châu Thành, tỉnh An Giang *Tác giả liên hệ: ngphamtuan1983@gmail.com Số điện thoại: 0988.202055 Tóm tắt Mục đích của nghiên cứu này là xây dựng được quy trình định lượng dioscin từ hoa thốt nốt. Một quy trình định tính, định lượng dioscin nhanh chóng, hiệu quả bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Pha tĩnh được sử dụng là cột sắc ký pha đảo C18 (150 mm x 4,6 mm x 5 µm), pha động là hỗn hợp acetonitril: nước (60:40, v/v), tốc độ dòng 0,8 mL/phút. Mẫu được tiêm với thể tích 20 µL, thời gian sắc ký 5 phút, bước sóng phát hiện 209 nm. Thời gian lưu của dioscin là 5,02 phút. Kết quả thực nghiệm cho thấy trong khoảng nồng độ từ 60 - 300 μg/mL, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic y (mAU.min) và nồng độ dung dịch x (μg/mL) theo phương trình y = 6854,4x + 7144,4 với hệ số xác định R2 = 0,997. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 2 và 6,6 μg/mL. Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với dioscin, có độ đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 4%, độ lệch chuẩn tương đối của độ lặp lại ≤ 1,69%, độ lệch chuẩn tương đối của độ chính xác trung gian ≤ 1,85%. Từ khóa: sắc ký lỏng, hoa thốt nốt, độ chính xác, độ đúng, dioscin. 191
1. Mở đầu Trong y học dân gian Việt Nam, hoa thốt nốt đực (Borassus flabellifer) được sử dụng để chữa sốt và lợi tiểu. Qua nhiều nghiên cứu của các tác giả ngoài nước cho thấy hoa thốt nốt đực có chứa nhóm saponin steroid, chủ yếu là spirostan và dioscin. Trong đó dioscin đã được nghiên cứu có tác dụng chống ung thư và chống viêm rất mạnh trên mô hình thử in vitro (tế bào) và mô hình in vivo. Các kết quả này gợi ý rằng chất dioscin là hoạt chất chính mang lại các tác dụng đã được đề cập của hoa thốt nốt đực nên có thể sử dụng làm chất đánh dấu trong các tiêu chí định tính và định lượng (Zhao et al., 2016; Wang et al., 2018). Dioscin là một hợp chất steroid, được hình thành khi diosgenin và glucoside liên kết với nhau thông qua liên kết - 1,3 glycosidic. Đây là hợp chất được tìm thấy chủ yếu trong thực vật thuộc chi củ Nâu (tên khoa học là Dioscora zingiberensis). Liên kết thủy phân dioscin-diosgenin rất quan trọng, là nền tảng cơ bản trong việc sản sinh nội tiết tố có tác dụng điều trị hiệu quả việc chống nhiễm trùng, các bệnh do virus, bệnh khớp, các bệnh về tim mạch, da liễu. Bên cạnh đó, các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng dioscin có tác dụng chống ung thư. Cơ chế chống ung thư bằng hệ ROS của diosin cũng được nghiên cứu bởi Wang et al. (2012). Nhóm tác giả kết luận rằng dioscin, một saponin glucoside được phân lập từ một loại củ nâu (tên khoa học là Dioscora panthaica) có tác dụng bảo vệ gan và chống ung thư ở người thông qua cơ chế ―apoptosis‖- một quá trình kiểm soát bao gồm nhiều bước, nhằm loại bỏ các tế bào không mong muốn trong một hệ thống sinh học. Nghiên cứu đã khẳng định Dioscin ức chế tế bào ung thư do gây ra dây chuyền phản ứng oxy hóa khử (ROS). Song song đó, Zhao et al. (2016) cũng tiến hành nghiên cứu và đưa ra cơ chế chống ung thư cổ tử cung. Đồng thời, nghiên cứu của Wang et al (2018) chứng minh được khả năng chống ung thư phổi của dioscin. Cho đến thời điểm hiện tại, trong nước chưa có nghiên cứu nào về dioscin được công bố. Như vậy, phát triển các nghiên cứu về dioscin là một hướng mới tại Việt Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có thêm một lựa chọn thuốc trong điều trị. Xây dựng phương pháp định lượng dioscin theo tiêu chuẩn quốc tế là công việc hết sức cần thiết nhằm kiểm soát chất lượng thuốc đồng thời tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo như bào chế, đánh giá tương đương sinh học, theo dõi dược động học của thuốc. (a) (b) Hình 1. Cấu trúc hóa học của dioscin (a) và hoa Thốt nốt (b). 2. Vật Liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu hoa Thốt nốt (Borassus flabellifer L.) được thu hái tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang. hoa Thốt nốt sau khi thu hái từ các nhà vườn được vận chuyển về phòng thí nghiệm của Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang. 192
Thiết bị và hóa chất: hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản), cân phân tích (Shimadzu, Nhật Bản), màng lọc 0,45µm (Merck, Đức), methanol (Merck, Đức), Dioscin (Merck, Đức), Acetonitril (Merck, Đức),… hóa chất và thiết bị cần thiết khác. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Chuẩn bị mẫu chuẩn Cân chính xác 6mg chất chuẩn Dioscin (độ tinh khiết 95% - Sigma). Hòa tan chuẩn với trong 10 mL methanol, được dung dịch chuẩn nồng độ 600µg/mL. Xây dựng đường chuẩn với các nồng độ dioscin là 60 µg/mL; 120 µg/mL; 180 µg/mL; 240 µg/mL; 300 µg/mL. Chuẩn bị mẫu thử Lấy 10 gam bột nguyên liệu, cho vào túi giấy lọc, chiết Soxhlet với 300 ml cồn 96% (16 giờ). Dịch chiết được cô áp suất thấp thu được cắn. Hòa cắn trong 20 ml nước cất, chuyển vào bình lắng gạn 100 mL. Chiết dịch nước với diethyl ether 4 lần, mỗi lần 20 mL. Dịch nước tiếp tục chiết với n-butanol bão hòa nước 4 lần, mỗi lần 20 mL. Tập trung phần dịch n-butanol lại rồi cô đến cắn. Pha loãng mẫu 250 lần với methanol và lọc qua màng 0,45 µm và tiêm dịch lọc vào hệ thống HPLC. Ghi nhận diện tích peak, hàm lượng dioscin được tính dựa trên đường chuẩn. Hệ thống HPLC Hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản), gồm: Bơm LC-20AT, bộ tiêm mẫu tự động SIL20AHT, detector UV-vis, phần mềm Labsolution để truy xuất hình ảnh và số liệu trên máy HPLC. Phần mềm Excel (Microsoft Office) được sử dụng để tính toán kết quả. Điều kiện sắc ký - Detector: SPD-M20A; pump: LC-30AD 15. - Cột sắc ký: Merck C18 (15cm x 4,6 mm x 5µm). - Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. - Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút. - Pha động: Acetonitril: H2O = 60: 40 (v/v). - Bước sóng: 209 nm. Thẩm định quy trình định lƣợng dioscin Quy trình được đánh giá theo hướng dẫn của các tài liệu tham khảo (Trần Cao Sơn và cs., 2010), bằng việc khảo sát các chỉ tiêu sau đây: độ đặc hiệu, độ tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp. Khảo sát hàm lƣợng dƣợc chất hiện diện ở từng phần của hoa thốt nốt Hai bộ phận của phát hoa (hoa và cuống) sau khi được tách riêng để xử lý. Lấy 10 gam mỗi loại, cho vào túi giấy lọc, chiết Soxhlet với 300 mL cồn 96% (16 giờ). Dịch chiết được cô áp suất thấp thu được cắn. Hòa cắn trong 20 mL nước cất, chuyển vào bình lắng gạn 100 mL. Chiết dịch nước với diethyl ether 4 lần, mỗi lần 20 mL. Dịch nước tiếp tục chiết với n-butanol bão hòa nước 4 lần, mỗi lần 20 mL. Tập trung 193
phần dịch n-butanol lại rồi cô đến cắn. Pha loãng mẫu 250 lần với methanol và lọc qua màng 0,45µm và tiêm dịch lọc vào hệ thống HPLC, ghi nhận lại diện tích peak. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Thẩm định quy trình phân tích Thẩm định quá trình phân tích là một quá trình thiết lập bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh rằng phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến (Trần Cao Sơn và cs., 2010). 3.1.1. Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu hay còn gọi là tính chọn lọc của một quy trình phân tích là khả năng của quy trình cho phép xác định chính xác và đặc hiệu các chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác có trong mẫu thử (Trần Cao Sơn và cs., 2010). Hình 2. (a) Sắc ký đồ mẫu blank; (b) Sắc ký đồ dioscin chuẩn; (c) Sắc ký đồ mẫu hoa Thốt nốt. Tiến hành phân tích mẫu blank (methanol), mẫu chuẩn dioscin, mẫu hoa thốt nốt theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Các sắc ký đồ thu được trình bày trong Hình 2. Kết quả thu được cho thấy tín hiều peak của chất dioscin xuất hiện tại thời gian lưu (tR ~ 5,0 phút). Trên sắc ký đồ mẫu blank, không thấy xuất hiện tín hiệu peak tại thời gian lưu này và trên sắc ký đồ các mẫu thử hoa thốt nốt có xuất hiện tín hiệu peak này, tín hiệu này tách khỏi các tín hiệu khác hiện trên sắc ký đồ. Điều này chứng tỏ, phương pháp có tính đặc hiệu chọn lọc phù hợp cho phân tích dioscin trong nguyên liệu thốt nốt. 3.1.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký, tiến hành pha 01 mẫu đối chiếu có nồng độ 150 µg/mL. Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần với điều kiện đã lựa chọn, kết quả được trình bày trong Bảng 1. 194
Bảng 1. Kết quả định lƣợng 1 mẫu với 6 lần lặp lại. RSD Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 TB (%) Thời gian 5,24 5,06 5,013 5,008 4,96 4,91 5,0242 1,96 lƣu (phút) Speak 707.254 713.959 707.348 709.825 710.842 712.549 710.296 0,349 (AU.s) Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian và diện tích peak lần lượt là 1,96% và 0,349% (đều < 2%). Kết quả cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo sự ổn định của phép phân tích định lượng chất dioscin. 3.1.3. Độ tuyến tính và khoảng tuyến tính của phƣơng pháp định lƣợng Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự tương quan tỷ lệ giữa đại lượng đo được y và nồng độ x. Cả hai trường hợp điều yêu cầu giữa đại lương đo được và nồng độ phải có sự phụ thuộc tuyến tính (Trần Cao Sơn và cs., 2010). Chuẩn bị một dãy gồm 05 dung dịch mẫu đối chiếu dioscin như trên rồi tiến hành chạy phân tích sắc ký lỏng cao áp theo quy trình nghiên cứu. Kết quả phân tích định lượng dioscin với các mức nồng độ khác nhau (60 - 300 µg/mL) được trình bày trong Bảng 2. Dựa vào kết quả phân tích định lượng dioscin, tiến hành xây dựng phương trình đường chuẩn dioscin và tình toán giá trị hệ số tương quan (Hình 3). Kết quả xây dựng được phương trình đường chuẩn và giá trị hệ số tương quan có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ của chất đối chiếu dioscin (x) và diện tích peak (y) với phương trình hồi quy: y = 6854,4x + 7144,4 và hệ số tương quan R2 = 0,997. Bảng 2. Kết quả định lƣợng mẫu dioscin chuẩn. Nồng độ (µg/mL) 60 120 180 240 300 Diện tích peak (AU.s) 413.219 871.046 1.184.602 1.661.538 2.074.301 Hình 3. Phƣơng trình đƣờng chuẩn dioscin. 195
3.1.4. Khảo sát độ đúng Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần các giá trị tìm thấy với giá trị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã được làm đồng nhất trong cùng điều kiện xác định (Trần Cao Sơn và cs., 2010). Độ đúng của phương pháp được xác định bằng phương pháp thêm chất chuẩn, tức là thêm vào mẫu M1 đã được xác định hàm lượng một lượng chính xác chất dioscin sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Cụ thể, pha dung dịch mẫu chuẩn dioscin có nồng độ 20 µg/mL và mẫu thử được pha dung dịch thử như trên. Hút chính xác 1 mL dịch thử và 1 mL dung dịch chất đối chiếu dioscin, lắc đều rồi tiến hành định lượng. Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức sau: (%) = [(𝑆𝑐 + 𝑆𝑀) ∗ 100]/𝑆𝑇 Trong đó: SC: Diện tích peak chất chuẩn. SM: Diện tích peak chuẩn; STH: Diện tích peak thu hồi Bảng 3. Xác định độ đúng của phương pháp. % Thu TT Mẫu TR (phút) Diện tích peak (AU.s) RSD (%) hồi 1 Đối chiếu 4,534 113.250 2 Mẫu 4,896 2.256.430 3 Thu hồi 1 4,55 1.141.758 96,36 4 Thu hồi 2 4,602 1.190.152 100,45 5 Thu hồi 3 5,194 1.196.070 100,95 1,69 6 Thu hồi 4 4,848 1.170.689 98,81 7 Thu hồi 5 4,883 1.165.151 98,34 8 Thu hồi 6 4,936 1.162.215 98,09 Trung bình 98,83 Độ đúng của phương pháp được xác định từ tỷ lệ (%) thu hồi của chất thu được từ kết quả định lượng so với lượng chất chuẩn thêm vào. Kết quả phân tích cho thấy, quy trình định lượng chất dioscin có khả năng thu hồi cao (>96%, RSD
phân tích hàm lượng dioscin trong hoa Thốt nốt được trình bày trong Bảng 4. Hàm lượng chất dioscin là 2,7326 và giá trị RSD = 1,846%. Như vậy, có thể áp dụng chương trình đã lựa chọn để định lượng chất dioscin trong mẫu hoa thốt nốt. Bảng 4. Kết quả xác định độ lặp lại của phƣơng pháp. RSD Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 (%) Khối lƣợng cao 0,2002 0,2002 0,2187 0,2015 0,2023 0,2241 định lƣợng (g) 1,846 Hàm lƣợng 2,7959 2,7136 2,7678 2,7352 2,7349 2,6483 dioscin (%) Hàm lƣợng trung 2,7326 bình dioscin(%) 3.1.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) Giới hạn phát hiện (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất cần thử trong mẫu còn có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết phải xác định chính xác hàm lượng (Trần Cao Sơn và cs., 2010). Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất cần thử trong mẫu thử còn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác thích hợp. Giới hạn định lượng là một thông số của phương pháp định lượng đối với lượng thấp nhất của chất thử trong khuôn mẫu và được sử dụng đặc biệt trong việc xác định các tạp chất và các sản phẩm phân hủy. Giới hạn định lượng có thể được biễu diễn bằng sự cho phép có mặt của chất cần thử trong mẫu đem thử và nồng độ phần tram, phần ngàn, phần triệu,.. (Trần Cao Sơn và cs., 2010) Phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ còn có xuất hiện tín hiệu của chất đối chiếu và xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền. S/N = 2H/h Trong đó: H là chiều cao của peak ứng với chất cần thử trên sắc ký đồ. h: Là khoảng dao động của nhiễu đường nền trên sắc ký đồ thu được với mẫu trắng. Phân tích mẫu dioscin ở nồng độ 20 µg/mL, sau đó pha loãng dần đến khi dung dịch chuẩn không còn xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Nồng độ dung dịch chuẩn là 2 µg/mL, thì tỷ số giữa chiều cao tín hiệu và nhiễu đường nền: S/N = 2H/h = 2 x 0,6/0,6 = 2, đạt trong khoảng từ 2-3. Như vậy, nồng độ 2 µg/mL được coi là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp. Giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,6 (µg/mL). Bảng 5. Kết quả xác định LOD và LOQ. Nồng độ chất dioscin 20 10 2 1 (µg/mL) Speak (AU.s) 84.698 42.025 17.941 Không có tín hiệu 197
3.2. Khảo sát hàm lƣợng dƣợc chất hiện diện ở từng phần của hoa thốt nốt Sau khi thẩm định quy trình nghiên cứu tiến hành định lượng hàm lượng dioscin có trong hai mẫu nguyên liệu thu thập, đó là hoa và cuống hoa Thốt nốt. Từ kết quả thẩm định phương pháp phân tích, xác định được phương trình hồi quy: y = 6854,4 x + 7144,4 (R2 = 0,997). Hàm lượng dioscin (%) trong nguyên liệu được tính theo công thức như sau: X = (x x C% x d x 10-4)/p Trong đó: X: là hàm lượng phần trăm dioscin trong mẫu (%). x: nồng độ dioscin trong dung dịch phân tích sắc ký tính dựa theo đường chuẩn (μg/mL). d: độ pha loãng. C%: độ tinh khiết của chất chuẩn (C%=0,95). p: Khối lượng mẫu thử đã trừ ẩm (g). Bảng 6. Kết quả phân tích hàm lƣợng diosin trong hoa và cuống hoa Thốt nốt. Nồng độ Khối Độ Độ theo Hàm lƣợng ẩm Trung bình Mẫu Speak pha đƣờng lƣợng mẫu cao (%) loãng chuẩn (%) khô (g) (%) (µg/mL) 10 669.941 96,697 0,2491 Hoa 10 7,8 708.977 102,392 0,2638 0,2693 ± 0,023 10 792.177 114,530 0,295 250 10 153.514 21,3541 0,0523 0,0523 ± Cuống 10 3,12 154.654 21,5204 0,0528 0,0004 10 152.305 21,1777 0,0519 Từ kết quả phân tích trên cho thấy, hàm lượng dioscin hiện diện trong phần hoa thốt nốt (0,2693%) nhiều hơn khoảng 5 lần so với phần cuống hoa (0,0523%). Ngoài ra, do phần cuống hoa chiếm tỷ lệ rất ít trong một phát hoa của cây Thốt nốt, nên hoa Thốt nốt có thể sử dụng nghiên cứu và làm nguồn nguyên liệu cho quá trính sản xuất các sản phẩm có khả năng hỗ trợ và điều trị bệnh. 4. Kết luận Lần đầu tiên quy trình định lượng dioscin trong hoa Thốt nốt bằng kỹ thuật HPLC cột pha đảo C18 với đầu dò UV-Vis đã được xây dựng và thẩm định. Pha tĩnh được sử dụng là cột sắc ký pha đảo C18 (150 mm x 4,6 mm x 5 µm), pha động là hỗn hợp acetonitril: nước (60:40, v/v), tốc độ dòng 0,8 mL/phút. Mẫu được tiêm với thể tích 20 µL, thời gian sắc ký 5 phút, bước sóng phát hiện 209 nm. Thời gian lưu của 198
dioscin là 5,02 phút. Quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, độ lặp lại, độ đúng, khảo sát được tính tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp. Lời cảm ơn Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang và Sở Khoa học và Công nghệ An Giang đã tạo điều kiện và giúp đỡ thực hiện nghiên cứu. Tài liệu tham khảo Trần Cao Sơn, Phạm Xuân Đà, Lệ Thị Hồng Hảo và Nguyễn Thành Chung. (2010). Thẩm định phương pháp phân tích trong hóa học và vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội, 102 trang. Wang, Y.C., De-Wei, W., Tzu-Chin, W., Lee ,W., Chih-Yi, C. and Huei, L. (2018). Dioscin overcome TKI resistance in EGFR-mutated lung adenocarcinoma cells via down-regulation of tyrosine phosphatase SHP2 expression; Internatioanl journal of biological sciences. Wang, Z., Cheng, Y., Wang, N., Wang, D.M., Li, Y.W., Han, F., Shen, J.G., Yang, D.P., Guan, X.Y. and Chen, J.P. (2012). Dioscin induces cancer cell apoptosis through elevated oxidative stress mediated by downregulation of peroxiredoxins; School of Chinese Medicine; The University of Hong Kong; Hong Kong, China. Zhao, X., Xufeng, T., Lina, X., Lianhong, Y., Yan, Q., Youwei, X., Xu, H. and Jinyong, P. (2016). Dioscin Induces Apoptosis in Human Cervical Carcinoma HeLa and SiHa Cells through ROS-Mediated DNA Damage and the Mitochondrial Signaling Pathway; College of Pharmacy, Dalian Medical University, Western 9 Lvshunnan Road, Dalian 116044, China. 199