Xây dựng quy trình phân tích Gen CRHR1 và FCER2 ở bệnh nhân nhi hen phế quản

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đa hình di truyền trên gen CRHR1 và FCER2 có ảnh hưởng đáng kể đến đáp ứng thuốc corticoid trong điều trị hen phế quản. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào mô tà mối liên hệ giữa kiểu gen và khả năng đáp ứng thuốc corticoid ở bệnh nhân nhi hen phế quản Việt Nam. Đề tài nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình phân tích kiểu gèn của đa hình rs242941 trên gen CRHR1 và đa hình rs28364072 trên gen FCER2 ở bệnh nhân nhi hen phế quản.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng quy trình phân tích Gen CRHR1 và FCER2 ở bệnh nhân nhi hen phế quản

Chemistry Biochemistry and Implications. The Royal 20. Wang, X., Jiao, F., Wang, Q. w ., Wang, J., Yang, Society of Chemistry, 2-4. K„ Hu, R. R., Liu, H. c., Wang, H. Y., Wang, V. s. (2012). 17. Sasaki, J., Lu, c., Machiya, E., Tanahashi, M., Aged black garlic extract induces inhibition of gastric Hamada, K. (2007). Processed black garlic (Allium cancer cell growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Sativum) extracts enhance anti-tumor potency against Report, 5,66-72. mouse tumors. Medical and Aromatic Piant Science and 21. Xu, G., Ye, X., Chen, J„ Liu, D. (2007). Effect of Biotechnology, 1(2), 278-281. heat treatment on the phenolic compounds and 18. Sato, E., Kohno, M., Ha mano, H., Niwano, Y. antioxidant capacity of citrus peel extracts. Journal of (2006). increased Anti-oxidative Potency of Garlic by agricultural Food Chemistry, 55, 330-335. Spontaneous Short-term Fermentation. Plant Foods for 22. Yeh, Y. Y., Liu, L. (2001). Cholesterol-Lowering Human Nutrition, 61,157-160. Effect of Garlic Extracts and Organosulfur. The Journal of 19. Wang, D., Feng, Y. Liu, J„ Yan, J., Wang, M„ Nutrition, 131, 989-993. Sasaki, J., Lu, c. (2010). Black Garlic (Allium sativum) 23. Yiimaz, Y-, & Toledo, R. (2005). Antioxidant Extracts Enhance the Immune System. Medicinal and activity of water-soluble Maillard reaction products. Food Aromatic Plant Science and Biotechnology, 37-40. Chemistry, 93, 273-27 8. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN CRHR1 VÀ FCER2 Ở BỆNH NHÂN NHI HEN PHÉ QUẢN Phạm Thị Hồng Nhung1, Vũ Thị Thơm 1, Đậu Thế Huy1, Nguyễn Thị Thu Hằng2, Đỉnh Đoàn Long , Dương Thị Ly Hương 1Khoa Y Dược, Đ ại học Quốc gia Hà Nọi 2Đ a i h o c D ư ơ c H à N ô i TÓM TẤT Đặt vấn đề: Đa hình di truyền trên gen CRHR1 và FCER2 có ảnh hưởng đáng kể đến đáp ứng thuốc corticoid trong điều trị hen phế quản. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào mô tà mối liên hệ giữa kiểu gen và khả năng đáp ứng thuốc corticóid ở bệnh nhân nhi hen phế quản Việt Nam. Mục tiêu: Xây dựng quy trình phân tích kiểu gèn của đa hình rs242941 trên gen CRHR1 và đa hình rs28364072 trên gen FCER2 ở bệnh nhân nhi hen phế quản. Phương pháp: tách DNA từ máu ngoại vi, khuếch đại gen bằng PCR, xác định kiểu gen của bệnh nhân bằng phương pháp giài trình tự và PCR-RFLP. Kết quả: 40 bệnh nhân nhi hen phế quàn đã được xấc định được kiều gen CRHR1 và FCER2. Tần số alen đột biến của đa hình rs242941 và rs28364072 lần lượt là 0,10 và 0,33. Kết luận: chúng tôi đã xây dựng được quy trình xấc định đa hình trên gen FCER2 sử dụng phương pháp giải trình tự và xốc đinh đa hình trên gen CRHR1 với hai phương pháp song song là phương phấp PCR-RFLP va giải trình tự. Từ khóa: CRHR1, FCER2, hen phế quản. SUMMARY CONSTRUCTION PROCESS TO GENOTYPE THE CRHR1 AND FCER2 GENE VARIATIONS OF PEDIATRIC ASTHMA PATIENTS Pham Thi Hong Nhung1, Vu Thi Thom\ Dau The Huy1, Nguyen Thi Thu Hang2, Dinh Doan Long\ Duong Thi Ly Huong1 1 School o f Medicine and Pharmacy - Vietnam National University, Hanoi 2 Hanoi University o f Phamacy Background: The genetic variations o f CRHR1 and FCER2 gene have significant influences in response to corticosteroid drugs in the treatment o f asthma. However, no study about the relationship between this genotypes and the response to corticosteroid in pediatric asthma Vietnamese. Objectives: construction genotyping tests of CRHR1 (rs242941) and FCER2 (rs28364072) polymorphisms on asthma pediatric patients. Materials and method: DNA extraction from blood samples, polymerase chain reaction (PCR) amplification o f target genes, Sanger sequencing and PCR-RFLP. Results: we have identified the FCER2 and CRHR1 genotype o f 40 patients. The fr&quencies o f mutated alleles o f rs242941 and r$28364072 were 0.10 and 0.33, respectively. Conclusion: We have established successfully process to identified FCER2 polymorphisms using sequencing and CRHR1 polymorphisms using P C R - RFLP and sequencing. Keywords: CRHR1, FCER2, asthma. ĐẶT VÁN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU CRHR1 !à gen mã cho thụ thể kết cặp G-protein Hen phế quản ià bệnh hô hấp mãn tính, đa nhân tố liên kết với các neuropeptide thuộc họ hormon giải rất phổ biến ở nước ta cũng như trên thế giới với tĩ íệ phóng corticotropin. CRHR1 liên quan đến việc sản gia tăng liên tục ử trẻ em trong thời gian qua [3], [4]. xuất corticosteroid nội sinh và do đó có thể được dự Corticoid là nhóm thuốc được sử dụng phổ biến trong báo sẽ ảnh hưởng đến đáp ứng corticosteroid ngoại điều trị hen phế quản, tuy nhiên đến 40% bệnh nhân sinh. Đa hình rs242941 (G> T) trên gen CRHR1 đã không có đáp ứng khi được điều trị với corticosteroid được chứng minh íàm ỉăng đáp ứng với điều trị dạng hít [7Ị. corticoid dạng hít [6]. 537
FCER2 là gen mã hóa cho thụ thề gắn với IgE ái Xác ứịnh kiểu gen CRHR1 và FCER2 lực thấp (FcsRII/CD23) có mặt ờ nhiều dòng tế bào Sản phẩm PCR được gửi tinh sạch và giải trình tự như tế bào B, bạch cầu ổơn nhân, đại thực bào [5]. Đa - 2 chiều tại hãng First Base (Malaysia). Tần sổ alen của hình rs28364072 (A>G) trên gen FCER2 đã được các SNP sẽ được tính toán và so sánh với tần sổ lý chửng minh có liên quan với việc tăng nguy cơ các đợt thuyết theo định luật Hardy-Weinberg sử dụng chi- kịch phát với những bệnh nhân dử dụng corticosteroid square test. dạng hít [2]. Cảc alen G có liên quan với nồng độ IgE Kiều gen của rs242941 được phát triển thêm quy tăng cao ở bệnh nhân hen suyễn. trình xác định bằng PCR - RFLP với enzyme giới hạn Trong nghiền cứu này, chúng tôi tiến hành xây SsiỊ (ER1791, Thermo Scientific), đựng quy trình phân tích các đa hình trên CRHR1 và KẾT QUẢ FCER2 ờ bệnh nhân nhi hen phế quản, cung cẩp công 1- Tách chiết DNA tổng số từ máu ngoại ví cụ giúp phân tích mối liên quan giữa kiểu gen và đáp Tất cả 40 mẫu máu đều tách được DNA tổng sổ đù ứng thuốc corticosteroid. chắt lượng cho các thí nghiệm tiếp theo. DNA thu ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u được cho băng sáng rõ khi điện đi và có nồng độ từ 8- 1. Đối tượng nghiên cứ u 176ụg/ml. Mâu máu cua 40 bệnh nhân nhi hen phế quản có 2. Khuếch đại vùng gen quan tâm bằng PCR độ tuổi íừ 6-16 đang điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung Thành phần phản ứng tổỉ ưu nhân dòng đoạn gen ương. Quá trinh thu thập mẫu máu được sự cháp CRHR1 chứa rs242941 gồm 2 mM dNTP, 3 mM thuận của gia đỉnh bệnh nhân và được Hội đồng đạo MgS04, 0.3 pM mỗi mồi, 0.05 uỉụỉ Pfu DNA đức thông qua. põiymerase. Nhiệt độ gắn mồi tối ưu ià 640C. Quy 2. Phương pháp nghiên cứu trình đảm bảo độ nhạy với nồng độ DNA khuôn từ 5 - 2.1. Tách ch iế t DNA tổ n g số từ máu toàn phần 500 ụg/pi phản ứng. Kết quả thí nghiệm tối ưu PCR E.Z.N.A blood DNA Mini kit (Omega-Biotek) được đưực trình bày ở hinh 1. sử dụng theo quy írình khuyến cáo của hãng. Thành phần phản ứng tối ưu nhân dòng đoạn Tối ưu hóa điều kỉện khuếch đại gen bằng PCR gen FCER2 chứa rs28364072 gồm 2 mM dNTP, 2 Sử dụng cặp mồi tự thiết kế, chúng tôi tiến hành tối MgS04, 0.3 mM mỗi mòi, 0.05 u/ụl Pfu DNA ưu các yeu tố: nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi, nồng độ polymerase. Nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 560C. Quy MgS04. Các thí nghiệm được tiến hành trên 3 mẫu cổ trình đảm bảo độ nhạy với nồng độ DNA khuôn từ 5 nong ổộ DNA khâc nhau: niẫu 17 (nồng độ DNA 177 - 100 pg/pl phản ứng. PCR với nồng độ mẫu quá ng/yí), mẫu 29 (nồng độ DNA 90 ng/pi), mẫu 49 (nồng cao (như mẫu 17) sẽ ức chế phàn ứng khuếch đại độ DNA 46 ng/ụí). Đánh giá độ nhạy cua phương pháp gen. Kết quả thỉ nghiệm tối ưu PCR được trình bày với dải nồng độ DNA từ 5 - 5Ó0 ng/ụl. Sản phẩm PCR Ờ hinh2. được điện di trên gel agarose 1 %, A N h iệ t đô g ắ n m ồ i (°C ) B N ô n g đ ộ m ô i (fiM ) M 59 62 63 64 64.5 65 0.9 0.3 0.1 0.9 0.3 0.1 0.9 0.3 0.1 M i H 4 - 3 8 1 bp M ẫ u 17 M ầu 29 M ầ u 49 c N ồ n g độ M g S 0 4 ( n ử ỉ ) N ồn g đ ô D N A (ng/jil) D M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 (-) 500 100 50 10 s 01 02 03 (-) M Mẩ u 17 Mầ u 29 Mầ u 49 Hình 1. Ảnh điện di thí nghiệm tối ưu PCR nhân vùng chứa rs242941 (CRHR1) trên gel agarose 1%. Ảnh A: PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi (Làn M: thang chuẩn DNA100 bp). Ảnh B: PCR tối ưu nồng độ mồi. Ảnh C: PCR tối ưu nồng độ MgS04 và DNA. Ảnh D: PCR với điều kiện tốl ưu với 3 mẫu baỉ kì. 538
A N hiệt độ gắn m ồi (°C) B Nồng độ mồi (juM) 52 54 5Ố 58 59 M (-) 0.9 0.3 0 1 0 9 0 1 0 1 0 9 0 3 01 SiS bp —► mm M ầu 17 M ầu 29 M ẩu 49 Nồng độ DNA (ng/|il) Nồng độ M g S 0 4 (mM) (-) 500 100 50 10 5 M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 _____________________________ M ầu 17 M lu 29 M ầu 49 Hình 2. Ảnh điện di thí nghiệm tối ưu PCR nhân vùng chứa rs28364072 (FCER2) trên gel agarose 1%, thang chuẩn DNA 100 bp (iàn M). Ảnh A: PCR tối tru nhiệt độ gắn. Ành B: PCR tôi ưu nong độ mồi. Ảnh C: PCR tối ưu nông độ MgS04 và nồng độ DNA. Ành D: PCR VỚI điều kiện tối ưu với 3 mẫu bất kì. 3. Xác định kiểu gen CRHR1 và FCER2 trên 40 M 4 4.1 4.2 4.3 1 1.1 1.2 1,3 bệnh nhân nhí CA) Hình ảnh kết quả giải trình tự các kiểu gen được trình bày ờ hình 3-4 và một sổ tần số alien đột biền •• — bi’ trên CRHR1 và FCER2 được trình bày ở bảng 1. Giải : = ĩliĩ trinh tự phân vùng gen FCER2, ngoài rs28364072 chúng tôi xác định thêm được 16 SNP khác là: rs 2277994, rs76013233, rs77121754, rs78283814, r " r " " ■“ „ II ~ ~ĩỉõ 2J0 rs75584211, rs74927160, rs2277995, rs4996972, c o c oo ÕI 3Qq ItO oGcG qGgQ g C c cO C q .C .c ó G ỉ íG G rG G G G G C rs4996973, rs2228138, rs4996975, rs4996976, rs4996977, rs4996978, rs4996979, rs4996980. I-.Z ___ A -I -À _____ A SNP rs242941 rs28364072 m ầ ft m ề ỊẬ Tần sô alien đột biên 0,10 0,33 Hỉnh 3. Kết quả phân tích kiểu gen rs242941 (CRHR1) của X* 0,49 0,03 bệnh nhân mã sổ 01 và 04. Ảnh A: ảnh điện di sản phẩm P-vaỉue 0,48 0,87 PCR-RFLP trên gel agarose 1.5%, íàn M: 100 bp DNA Ladder, làn 1-4: san phẩm PCR, làn 1.1 -1.3 và 4.1 - 4.3: RFLP vớí xử lý Ssil 1u ừong 1 giờ ở 37°c (hình 3). sàn phẩm cắt với mẫu PCR từ bệnh nhân số 01 (kiểu gen Alen G trên bản điện di sẽ cho 2 băng kích thừớc 156 GT) và 04 (kiểu gen GG) trong thời gian ủ tương ứng 1 và 225 bp; alen T chỉ cho một băng kích thước 381 bp. giờ, 2 giờ và 3 giờ. Ảnh B: Kết quà gỉài trình tự tương ứng Kết quả phân tích PCR-RFLP với cho kết quả tương đồng 100% với kết quả giải trình tự. Hình 4. Kết quả giải trình tự đa hình rs28364072 cùa bệnh nhân có kiều gen AA (hình A), kiểu gen AG (hình B), kiểu gen GG (hỉnh C) 539
BÀN LUẬN gũi về khoảng cách địa lý và chủng tộc phản ánh Chúng tối đã xây dựng được quy trình xác định tương đổi rõ qua sự tương đồng về mặt di truyền, các kiểu gen của CRHR1 và FCER2 dựa trên kĩ thuật quần thể thuộc cùng một khu vực địa lý có tần số ãlen PCR-RFLP và giải trình tự Sanger. Ưu điểm của xắp xỉ nhau. Điều đáng chú ý là alen T của rs242941 phương pháp giải trinh tự là chúng ta sẽ biết được và aìen G của rs28364072 ơ các quần thể người ử toàn bộ trình tự của phân đoạn DNA được nhân !ên Châu Phi hoặc gốc Phi có tỷ lệ cao vượt trội. Trong trong. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn giải trình tự để Chương trinh quản íý hen ở trẻ em, nghiên cứu của xác định được đống thời 17 SNP trên FCER2. Với Kelan và cộng sự cho thấy sự tăng tần số đa hỉnh di phương pháp PCR-RFLP, đây là phương pháp đơn truyền trên FCER2 có thế giúp iỷ giải sự tăng tỷ lệ giản, nhanh và có giá thành rẻ hơn so giải trình tự nên nhập viện liên quan đến hen ở trẻ em Mỹ gốc Phi [1], có thể ỉriển khai ở những phòng xét nghiệm, nghiên Tính đa hinh trên FCER2 cao cho thấy các nghiên cứu cứu cơ bàn. về di truyền học dược lý liên quan đến các SNP này ở Với tập hợp mẫu n=40, kiểm định chi-square cho người Việt Nam có thể sẽ mang lại nhiều ý nghĩa khoa thấy tần số của các alen trên phân bố theo định luật học và thực tiễn. Việc mở rộng nghiên cứu với số Hardy-Weinberg, nhóm mẫu nghiên cứu có tính đại lượng mẫu lởn hơn, đánh giá khả năng đáp ứng thuốc diện cho quần thể bệnh nhân nhi hen phé quàn. ờ các nhóm kiểu gen sẽ cung cấp những dữ liệu có So sánh với các nghiên cứu khác trên thế giới, giá trị cho nghiên cứu về mối liên hệ giữa kiểu gen và chúng tôi thấy rằng tần số cùa các alen đột biến trong khả năng đáp ứng thuốc của từng cá thể, có thề hỗ trợ nghiên cứu này khá tương đồng với tần số ở các quần xây dựng mô hình tiên iượng đáp ứng corticoid trong thể khu vực Đông Á (hình 5). Điều đó cho thấy sự gần điều trị hen. Châu Phi Châu Phi Châu Mỹ Ị Chân Mỹ Châu Âu ỊìIìIÌkÉ kìS ị I Châu Âu Đông Á ị Ị ỉ I Đông Á ViệtNam Nam Á pẩiii&ĩPìị I Ị Ị j : I i I Nam Á 0 (U 0 .2 03 OA 0 .5 0 .6 0 .7 o is 0.9 1 A. Tần sốalen T của rs24294Ị-(CRHR!) B. Tần số alen G của rs28364072 ựCER2) Hình 5. Tần sô"các alen thuộc gen CRHR1 và FCER2 ờ người trong lìhiếu quân thê’ khác nhau trên thê giới: Châu Phi, Châu Mỹ, Châu Âu, Đông A, Nam Á [8] KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 2. Koster s. E. et al. (2011), “FCER2 T2206C variant Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình xác associated with chronic symptoms and exacerbations in định kiểu gen FCER2 và CRHR1 đảm bảo tính chính steroid-treated asthmatic children", Allergy, 66, pp. 1546- xác, độ nhạy và độ lặp lại cao. Với quy trình này, 1552. chúng tôi đã thu được số liệu ban đầu ve phân bố tần 3. Masoli M. et ai. (2004), “The global burden of số cốc alen và kiểu gen thuộc gen CRHR1 và FCER2 asthma: executive summary of the G!NA dissemination trên nhóm bệnh nhân nhi hen phế quản người Việt committee report”, Allergy, 59, pp. 469 - 478. Nam. 4. Matthew M. et al. (2004), "Globa! Burden of Asthma”, Medical Research institute of New Zealand, Chúng tôi kiến nghị sử dụng quy trình phân tích University of Southampton. trên cho các nghiên tiếp phân tfch mối liên quan giữa 5. Tantisira K. et al. (2007), “FCER2: A kiểu gen và khả năng đáp ứng thuốc corticoid trong pharmacogenetic basis for severe exacerbations in điều trị hpn ở trẻ em Việt NarrChỗ trợ nâng cao hiệu children with asthma”, J. Allergy Clinlmmunol, 120, pp. quả điều trị. 1285-1291. LỜI CẤM ƠN 6. Tantisira K. et al. (2004), “Corticosteroid Chúng tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Đại học pharmacogenetics: association of sequence variants in Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã sổ QG.Ĩ4.59 để thực CRHRIwith improved lung function in asthmatics treated hiện nghiên cứu này. Chúng tôi chân thành cám ơn with inhaled corticosteroids”, Human Molecular Genetics, nhóm nghiên cứu của bệnh viện Nhi Trung ương đã 13(13), pp. 1353-1359. cung cấp mẫu máu để thực hiện nghiên cứu. 7. Tantisira K.G. et al. (2011), “Genomewide TÀI LIỆU THAM KHẨO association between GLCCI1 and response to 1. Kelan G. et al (2007), “FCER2: A pharmacogeneticglucocorticoid therapy in asthma”, N Engl J Med 365(13), basis for severe exacerbations in children with asthma”, pp. 1173-1183. 120, pp. 1285-1291. 8. http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/ 540