intTypePromotion=1
ADSENSE

Áp dụng kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-hydroxylase

Chia sẻ: Nguyễn Tuấn Anh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

32
lượt xem
0
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong số các bệnh nhân đã được phát hiện đột biến, 85,7% đột biến được phát hiện ở bệnh nhân thể mất muối, 14,3% được phát hiện ở bệnh nhân thể nam hóa đơn thuần. Đột biến đồng hợp tử chiếm 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8%. Nghiên cứu đã phát hiện được 9 kiểu gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– với 34,1%, tiếp đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3 chiếm tỉ lệ là 14,3%, các dạng đột biến còn lại chiếm tỉ lệ từ 2,9 - 5,6%.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Áp dụng kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-hydroxylase

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> ÁP DỤNG KỸ THUẬT MLPA TRONG PHÁT HIỆN<br /> ĐỘT BIẾN XÓA ĐOẠN GEN CYP21A2 GÂY BỆNH TĂNG SẢN<br /> THƯỢNG THẬN BẨM SINH THỂ THIẾU 21-HYDROXYLASE<br /> Trần Vân Khánh1, Vũ Chí Dũng1,2, Trần Huy Thịnh1, Lương Hoàng Long1,<br /> Lê Thị Phương1, Ngô Thị Thu Hương1, Tạ Thành Văn1<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương<br /> <br /> Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21-hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể<br /> thường gây nên do đột biến gen CYP21A2 trong đó đột biến xóa đoạn được phát hiện chiếm tỉ lệ 20 - 25%.<br /> Kỹ thuật MLPA là kỹ thuật thường được áp dụng với hiệu quả và độ chính xác cao. Kỹ thuật MLPA được áp<br /> dụng để xác định đột biến xóa đoạn trên 102 bệnh nhân. Kết quả cho thấy 35/102 (34,3%) bệnh nhân có đột<br /> biến xóa đoạn gen CYP21A2. Trong số các bệnh nhân đã được phát hiện đột biến, 85,7% đột biến được<br /> phát hiện ở bệnh nhân thể mất muối, 14,3% được phát hiện ở bệnh nhân thể nam hóa đơn thuần. Đột biến<br /> đồng hợp tử chiếm 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8%. Nghiên cứu đã phát hiện được 9 kiểu gen, kiểu<br /> gen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– với 34,1%, tiếp đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%,<br /> đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3 chiếm tỉ lệ là 14,3%, các dạng đột biến còn lại chiếm tỉ lệ từ 2,9 5,6%.<br /> Từ khóa: Tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến xóa đoạn, gen CYP21A2, MLPA<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> đột biến điểm chiếm 70 - 75% [5]. Tùy từng<br /> <br /> Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu<br /> <br /> dạng đột biến gen CYP21A2, các kỹ thuật<br /> <br /> 21-Hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm<br /> <br /> khác nhau sẽ được sử dụng để xác định đột<br /> <br /> sắc thể thường, do khiếm khuyết một phần<br /> <br /> biến. Kỹ thuật Southern blotting, PCR và<br /> <br /> hoặc hoàn toàn của một trong số các enzym<br /> <br /> MLPA thường được dùng để xác định đột biến<br /> <br /> tham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol ở<br /> <br /> xóa đoạn gen [6]. Những bệnh nhân không<br /> <br /> tuyến thượng thận, gây bệnh cảnh lâm sàng<br /> <br /> xác định được đột biến xóa đoạn sẽ được tiến<br /> <br /> là cơn suy thượng thận cấp hoặc nam hóa ở<br /> <br /> hành giải trình tự toàn bộ gen CYP21A2 để<br /> <br /> trẻ gái, dậy thì sớm giả ở trẻ trai [1; 2]. Các<br /> <br /> xác định đột biến điểm [7].<br /> <br /> nghiên cứu đã cho thấy 95% ca mắc tăng sản<br /> <br /> Kỹ thuật đầu tiên được ứng dụng để xác<br /> <br /> thượng thận bẩm sinh có nguyên nhân do đột<br /> <br /> định đột biến xóa đoạn là Southern blotting,<br /> tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm là thời<br /> <br /> biến gen CYP21A2, là gen quy định tổng hợp<br /> cho enzym 21-Hydroxylase [3; 4]. Cho đến<br /> nay, nhiều dạng đột biến đã được phát hiện<br /> trong đó đột biến xóa đoạn chiếm 20 - 25%,<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm nghiên cứu<br /> Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn<br /> Ngày nhận: 14/8/2018<br /> Ngày được chấp thuận: 22/10/2018<br /> <br /> TCNCYH 117 (1) - 2019<br /> <br /> gian thực hiện lâu và cần sử dụng phóng xạ.<br /> Hiện nay, phương pháp thường được sử<br /> dụng để xác định đột biến xóa đoạn là MLPA,<br /> phương pháp này đảm bảo được độ chính<br /> xác cao, thời gian thực hiện nhanh và có thể<br /> xác định được toàn bộ các dạng đột biến xóa<br /> đoạn gen [8]. Nghiên cứu được thực hiện với<br /> mục tiêu: Xác định đột biến xóa đoạn gen<br /> CYP21A2 trên bệnh tăng sản thượng thận<br /> <br /> 1<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21-hydroxylase<br /> bằng kỹ thuật MLPA.<br /> <br /> 1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu<br /> Thời gian: từ tháng 1/2014 đến tháng<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> 1/2016.<br /> Địa điểm: Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di<br /> <br /> 1. Đối tượng<br /> <br /> truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương và Trung<br /> <br /> 102 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm<br /> sinh thể thiếu enzym 21-hydroxylase được<br /> chẩn đoán và điều trị tại Khoa Nội tiết Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung<br /> ương.<br /> <br /> tâm nghiên cứu Gene - Protein, Trường Đại<br /> học Y Hà Nội.<br /> 2. Phương pháp<br /> 2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA<br /> <br /> 1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân<br /> - Trẻ gái: có nam hóa được phát hiện khi<br /> sinh hoặc nam hóa sau sinh, tăng trưởng sớm<br /> chiều cao và tuổi xương.<br /> - Trẻ trai: dậy thì sớm giả, tăng sớm chiều<br /> cao và tuổi xương.<br /> <br /> DNA được tách chiết từ bạch cầu máu<br /> ngoại vi theo quy trình phenol/chloroform. Tất<br /> cả các mẫu DNA sẽ được tiến hành đo nồng<br /> độ và độ tinh sạch, chỉ có mẫu DNA đạt giá trị<br /> ≥ 1,8 mới đạt yêu cầu về tinh sạch và được<br /> sử dụng để phân tích.<br /> 2.2. Kỹ thuật MLPA<br /> <br /> - Cả hai giới: có biểu hiện mất muối những<br /> tuần đầu sau sinh: mất nước, hạ natri và clo,<br /> <br /> Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland)<br /> để phát hiện đột biến xóa đoạn trên bệnh<br /> <br /> tăng kali huyết thanh.<br /> <br /> nhân và người lành mang gen bệnh. Thành<br /> <br /> - Tăng 17-OHP huyết thanh vào lúc sáng<br /> sớm:<br /> Trẻ sơ sinh ≥ 1 ng/ml (bình thường < 1 ng/<br /> ml).<br /> <br /> phần của kit gồm các đầu dò (probe) để<br /> khuyếch đại gen CYP21A2, mỗi đầu dò tương<br /> ứng với một vùng gen, ngoài ra còn có các<br /> đầu dò đặc trưng cho gen của người cũng<br /> <br /> Sau tuổi sơ sinh: ≥ 2 ng/ml.<br /> <br /> được sử dụng để làm đối chứng và 2 đầu dò<br /> cho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới<br /> <br /> 1.2. Tiêu chuẩn loại trừ<br /> <br /> tính. Sản phẩm khuếch đại sẽ được điện di<br /> <br /> - Loại trừ các thể tăng sản thượng thận<br /> bẩm sinh khác (được khẳng định bằng chẩn<br /> đoán phân tử) bao gồm thiếu 11 βhydroxylase;<br /> <br /> thiếu<br /> <br /> 3β<br /> <br /> -<br /> <br /> hydroxysteroid<br /> <br /> dehydrogenase typ 2.<br /> - Loại trừ các bệnh nhân suy thượng thận<br /> bẩm sinh do các nguyên nhân khác như giảm<br /> sản thượng thận bẩm sinh, suy thượng thận<br /> <br /> mao quản trên máy giải trình tự. Số lượng sản<br /> phẩm khuếch đại của mỗi đầu dò sẽ tỷ lệ<br /> thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc<br /> hiệu với đầu dò đó.<br /> Quy trình MLPA: Cho 5µl DNA cần phân<br /> tích vào 1 ống PCR, biến tính ở 98oC trong 5<br /> phút. Nhiệt độ được chuyển về 2oC trước khi<br /> cho 3µl hỗn hợp chứa các đoạn oligonucleotid<br /> của các probe. Hỗn hợp được ủ ở 60oC trong<br /> <br /> bẩm sinh do suy yên.<br /> - Loại trừ các bệnh nhân nam dậy thì sớm<br /> <br /> 16 giờ, lúc này 2 đoạn lai của 2 phân tử<br /> <br /> giả và bệnh nhân nữ nam hóa do các nguyên<br /> <br /> oligonucleotid sẽ gắn với exon đích đặc hiệu ở<br /> <br /> nhân khác như u vỏ thượng thận nam hóa.<br /> <br /> vị trí sát nhau. Thêm 32µl hỗn hợp ligase<br /> <br /> 2<br /> <br /> TCNCYH 117 (1) - 2019<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> buffer, ủ ở 54oC trong 15 phút, lúc này enzym<br /> <br /> exon đột biến. Trong trường hợp bệnh nhân<br /> <br /> ligase nối 2 đoạn oligonucleotid của probe với<br /> <br /> có đột biến dị hợp tử xóa đoạn, đỉnh tín hiệu<br /> <br /> nhau. Phản ứng nối sẽ chấm dứt khi tăng<br /> <br /> sẽ có chiều cao bằng một nửa chiều cao của<br /> <br /> nhiệt độ lên 98oC trong 5 phút, hỗn hợp được<br /> <br /> mẫu đối chứng.<br /> <br /> giữ ở 4oC. Để khuếch đại sản phẩm lai: Thêm<br /> 10µl sản phẩm lai vào 30µl hỗn hợp PCR<br /> buffer, giữ ở 60oC trước khi thêm 10µl hỗn<br /> hợp PCR master vào hỗn hợp, thực hiện chu<br /> trình nhiệt sau: [95oC - 30 giây, 60oC - 30 giây,<br /> 72oC - 1 phút] x 35 chu kỳ; 72oC - 20 phút; sản<br /> phẩm được bảo quản ở 4oC. Sản phẩm<br /> khuếch đại probe sẽ được điện di mao quản<br /> huỳnh quang trên máy giải trình tự để phân<br /> tích kết quả. Nếu có đột biến xóa đoạn, probe<br /> không gắn được vào gen đích, do đó kết quả<br /> điện di sẽ không xuất hiện đỉnh tương ứng tại<br /> <br /> 3. Đạo đức nghiên cứu<br /> Nghiên cứu tuân thủ tuyệt đối các quy định<br /> về đạo đức trong nghiên cứu y sinh. Bệnh<br /> nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào<br /> nghiên cứu. Bệnh nhân hoàn toàn có quyền<br /> rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp<br /> tục tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân sẽ<br /> được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để<br /> giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa<br /> chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thông tin<br /> cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật.<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> Bảng 1. Kết quả phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 của bệnh nhân<br /> Kiểu gen<br /> <br /> Thể bệnh<br /> <br /> Dạng đột biến<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Mất toàn bộ gen (Del/Del)<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> Homozygous<br /> <br /> 10<br /> <br /> 28,6<br /> <br /> exon 1 del/ exon 1 del<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> Homozygous<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2,9<br /> <br /> exon 1 - 2 del /exon 1 - 2 del<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> Homozygous<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2,9<br /> <br /> Đồng hợp tử<br /> <br /> exon 1 - 3 del/exon 1 - 3 del<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> Homozygous<br /> <br /> 5<br /> <br /> 14,3<br /> <br /> 57,2%<br /> <br /> exon 1 - 8 del/exon 1 - 8 del<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> Homozygous<br /> <br /> 2<br /> <br /> 5,6<br /> <br /> exon 8 del/exon 8 del<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> Homozygous<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2,9<br /> <br /> exon 1 - 6 del/exon 4 - 6 del<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> Heterozygous<br /> <br /> 2<br /> <br /> 5,6<br /> <br /> Del/exon 1 - 3 del<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> Heterozygous<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2,9<br /> <br /> Del/–<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> Heterozygous<br /> <br /> 7<br /> <br /> Del/–<br /> <br /> NHĐT<br /> <br /> Heterozygous<br /> <br /> 5<br /> <br /> Tổng cộng<br /> <br /> 35<br /> <br /> Dị hợp tử<br /> 42,8%<br /> <br /> 34,3<br /> 100%<br /> <br /> Dạng đột biến chiếm tỉ lệ cao nhất là đột biến đồng hợp tử với 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm<br /> 42,8%. Nghiên cứu đã phát hiện được 9 kiểu gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp<br /> tử xóa đoạn Del/– (34,3%), tiếp đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn<br /> exon 1 - 3 chiếm tỉ lệ là 14,3%, các dạng đột biến còn lại chiếm tỉ lệ thấp hơn từ 2,9 - 5,6%<br /> (bảng 1).<br /> TCNCYH 117 (1) - 2019<br /> <br /> 3<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> Biểu đồ 1. Tỉ lệ các thể bệnh<br /> Bằng kỹ thuật MLPA, 35/102 (34,3%) bệnh nhân đã được phát hiện có đột biến xóa đoạn<br /> gene CYP21A2. Trong đó bệnh nhân thể mất muối chiếm 85,7% (30 bệnh nhân), bệnh nhân thể<br /> nam hóa đơn thuần chiếm 14,3% (biểu đồ 1).<br /> 50%<br /> 45%<br /> 40%<br /> 35%<br /> 30%<br /> 25%<br /> 20%<br /> 15%<br /> 10%<br /> 5%<br /> 0%<br /> <br /> 47%<br /> <br /> 17%<br /> <br /> 15%<br /> 6%<br /> <br /> Del<br /> <br /> -<br /> <br /> Exon 1-3 Exon 1-8<br /> del<br /> del<br /> <br /> 3%<br /> <br /> 3%<br /> <br /> Exon 1 Exon 1-2<br /> del<br /> del<br /> <br /> 3%<br /> <br /> 3%<br /> Exon 8<br /> del<br /> <br /> 3%<br /> <br /> Exon 1-6 Exon 4-6<br /> del<br /> del<br /> <br /> Biểu đồ 2. Tỉ lệ các allele đột biến<br /> Del là allele xóa toàn bộ gen CYP21A2;<br /> (-) là allele không phát hiện được đột biến xóa đoạn<br /> Biểu đồ 2 mô tả tỉ lệ các allele đột biến trong nghiên cứu, trong đó allele xóa toàn bộ gen<br /> chiếm tỉ lệ cao nhất với 47%, tiếp đến là allele xóa đoạn exon 1 - 3 (15%), các allele xóa đoạn<br /> còn lại chiếm tỉ lệ từ 3 - 6%. Tuy nhiên, 17% allele còn lại không phát hiện được đột biến xóa<br /> đoạn.<br /> Kết quả hình 1 cho thấy chiều cao đỉnh của exon 1 và exon 3 của bệnh nhân chỉ bằng một<br /> nửa so với mẫu đối chứng trong khi đó các đỉnh khác có chiều cao giống nhau giữa mẫu bệnh và<br /> mẫu chứng. Điều đó chứng tỏ bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3.<br /> <br /> 4<br /> <br /> TCNCYH 117 (1) - 2019<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Mẫu chứng<br /> <br /> Ex4<br /> Ex3<br /> <br /> Ex1<br /> <br /> E1P Ex8<br /> <br /> E10P<br /> <br /> I2P<br /> <br /> Ex6<br /> <br /> Mẫu bệnh nhân<br /> Ex3<br /> <br /> Ex1<br /> <br /> Hình 1. Kết quả đột biến xóa đoạn gen CYP21A2<br /> Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2;<br /> E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, intron 2 và exon 10 của gen giả<br /> CYP21A1P; Y là đỉnh tương ứng với nhiễm sắc thể Y dùng để xác định giới tính. Hình trên là hình<br /> ảnh tương ứng với kết quả người bình thường, hình bên dưới là hình ảnh tương ứng với kết quả<br /> của bệnh nhân bị xóa đoạn dị hợp tử exon 1 đến exon 3 gen CYP21A2.<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> Áp dụng kỹ thuật MLPA, 102 bệnh nhân<br /> tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21-OH<br /> đã được phân tích để phát hiện đột biến gen.<br /> Kết quả cho thấy 34,3% bệnh nhân được phát<br /> hiện là có đột biến xóa đoạn. Nghiên cứu đã<br /> phát hiện được 8 dạng đột biến xóa đoạn gen<br /> gồm: mất toàn bộ gen (Del), exon 1 del, exon<br /> 1 - 2 del, exon 1 - 3 del, exon 1 - 6 del, exon 1<br /> - 8 del, exon 4 - 6 del và exon 8 del. Kết quả<br /> này phù hợp với các dạng xóa đoạn được tìm<br /> thấy trong các nghiên cứu khác trên thế giới<br /> [5; 9].<br /> <br /> là 14,3%. Như vậy các đột biến xóa đoạn lớn<br /> chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các đột biến và<br /> tỷ lệ này cũng phù hợp với các nghiên cứu<br /> trên các chủng tộc khác nhau. Xóa đoạn lớn<br /> chiếm tỷ lệ từ 18,8% đến 45% ở các nước<br /> châu Âu bao gồm: Phần Lan, Đan Mạch, Áo,<br /> Anh, Đức, Thụy Điển, Hà Lan, các nước Đông<br /> Âu [5; 9; 10; 11]. Tỷ lệ thấp hơn các đột biến<br /> xóa đoạn lớn gặp ở các nước châu Á như<br /> Trung quốc (25,4%), Nhật Bản (12%) [12; 13].<br /> Sự khác nhau này có thể do cỡ mẫu nghiên<br /> cứu khác nhau và có thể có yếu tố chủng tộc.<br /> Tỉ lệ đột biến xóa đoạn di hợp tử với 1 allele không xác định được đột biến là 34,3%.<br /> <br /> Nghiên cứu cũng xác định được 9 kiểu<br /> <br /> Theo quy luật di truyền của Menden, đối với<br /> <br /> gen, trong đó kiểu gen có tỉ lệ xuất hiện cao<br /> nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– (34,3%), tiếp<br /> <br /> bệnh lý di truyền lặn trên nhiễm sắc thể<br /> thường, cần phải có 2 allele đột biến mới biểu<br /> <br /> đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến<br /> đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3, chiếm tỉ lệ<br /> <br /> hiện bệnh. Chúng tôi giả thiết allele còn lại ở<br /> các bệnh nhân này có thể là đột biến điểm. Do<br /> <br /> TCNCYH 117 (1) - 2019<br /> <br /> 5<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2