Áp dụng kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-hydroxylase

Chia sẻ: Nguyễn Tuấn Anh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

72
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong số các bệnh nhân đã được phát hiện đột biến, 85,7% đột biến được phát hiện ở bệnh nhân thể mất muối, 14,3% được phát hiện ở bệnh nhân thể nam hóa đơn thuần. Đột biến đồng hợp tử chiếm 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8%. Nghiên cứu đã phát hiện được 9 kiểu gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– với 34,1%, tiếp đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3 chiếm tỉ lệ là 14,3%, các dạng đột biến còn lại chiếm tỉ lệ từ 2,9 - 5,6%.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Áp dụng kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-hydroxylase

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ÁP DỤNG KỸ THUẬT MLPA TRONG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN XÓA ĐOẠN GEN CYP21A2 GÂY BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH THỂ THIẾU 21-HYDROXYLASE Trần Vân Khánh1, Vũ Chí Dũng1,2, Trần Huy Thịnh1, Lương Hoàng Long1, Lê Thị Phương1, Ngô Thị Thu Hương1, Tạ Thành Văn1 1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21-hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường gây nên do đột biến gen CYP21A2 trong đó đột biến xóa đoạn được phát hiện chiếm tỉ lệ 20 - 25%. Kỹ thuật MLPA là kỹ thuật thường được áp dụng với hiệu quả và độ chính xác cao. Kỹ thuật MLPA được áp dụng để xác định đột biến xóa đoạn trên 102 bệnh nhân. Kết quả cho thấy 35/102 (34,3%) bệnh nhân có đột biến xóa đoạn gen CYP21A2. Trong số các bệnh nhân đã được phát hiện đột biến, 85,7% đột biến được phát hiện ở bệnh nhân thể mất muối, 14,3% được phát hiện ở bệnh nhân thể nam hóa đơn thuần. Đột biến đồng hợp tử chiếm 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8%. Nghiên cứu đã phát hiện được 9 kiểu gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– với 34,1%, tiếp đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3 chiếm tỉ lệ là 14,3%, các dạng đột biến còn lại chiếm tỉ lệ từ 2,9 5,6%. Từ khóa: Tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến xóa đoạn, gen CYP21A2, MLPA I. ĐẶT VẤN ĐỀ đột biến điểm chiếm 70 - 75% [5]. Tùy từng Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu dạng đột biến gen CYP21A2, các kỹ thuật 21-Hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm khác nhau sẽ được sử dụng để xác định đột sắc thể thường, do khiếm khuyết một phần biến. Kỹ thuật Southern blotting, PCR và hoặc hoàn toàn của một trong số các enzym MLPA thường được dùng để xác định đột biến tham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol ở xóa đoạn gen [6]. Những bệnh nhân không tuyến thượng thận, gây bệnh cảnh lâm sàng xác định được đột biến xóa đoạn sẽ được tiến là cơn suy thượng thận cấp hoặc nam hóa ở hành giải trình tự toàn bộ gen CYP21A2 để trẻ gái, dậy thì sớm giả ở trẻ trai [1; 2]. Các xác định đột biến điểm [7]. nghiên cứu đã cho thấy 95% ca mắc tăng sản Kỹ thuật đầu tiên được ứng dụng để xác thượng thận bẩm sinh có nguyên nhân do đột định đột biến xóa đoạn là Southern blotting, tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm là thời biến gen CYP21A2, là gen quy định tổng hợp cho enzym 21-Hydroxylase [3; 4]. Cho đến nay, nhiều dạng đột biến đã được phát hiện trong đó đột biến xóa đoạn chiếm 20 - 25%, Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 14/8/2018 Ngày được chấp thuận: 22/10/2018 TCNCYH 117 (1) - 2019 gian thực hiện lâu và cần sử dụng phóng xạ. Hiện nay, phương pháp thường được sử dụng để xác định đột biến xóa đoạn là MLPA, phương pháp này đảm bảo được độ chính xác cao, thời gian thực hiện nhanh và có thể xác định được toàn bộ các dạng đột biến xóa đoạn gen [8]. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: Xác định đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 trên bệnh tăng sản thượng thận 1 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21-hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA. 1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: từ tháng 1/2014 đến tháng II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1/2016. Địa điểm: Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di 1. Đối tượng truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương và Trung 102 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21-hydroxylase được chẩn đoán và điều trị tại Khoa Nội tiết Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương. tâm nghiên cứu Gene - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. 2. Phương pháp 2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA 1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân - Trẻ gái: có nam hóa được phát hiện khi sinh hoặc nam hóa sau sinh, tăng trưởng sớm chiều cao và tuổi xương. - Trẻ trai: dậy thì sớm giả, tăng sớm chiều cao và tuổi xương. DNA được tách chiết từ bạch cầu máu ngoại vi theo quy trình phenol/chloroform. Tất cả các mẫu DNA sẽ được tiến hành đo nồng độ và độ tinh sạch, chỉ có mẫu DNA đạt giá trị ≥ 1,8 mới đạt yêu cầu về tinh sạch và được sử dụng để phân tích. 2.2. Kỹ thuật MLPA - Cả hai giới: có biểu hiện mất muối những tuần đầu sau sinh: mất nước, hạ natri và clo, Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland) để phát hiện đột biến xóa đoạn trên bệnh tăng kali huyết thanh. nhân và người lành mang gen bệnh. Thành - Tăng 17-OHP huyết thanh vào lúc sáng sớm: Trẻ sơ sinh ≥ 1 ng/ml (bình thường < 1 ng/ ml). phần của kit gồm các đầu dò (probe) để khuyếch đại gen CYP21A2, mỗi đầu dò tương ứng với một vùng gen, ngoài ra còn có các đầu dò đặc trưng cho gen của người cũng Sau tuổi sơ sinh: ≥ 2 ng/ml. được sử dụng để làm đối chứng và 2 đầu dò cho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới 1.2. Tiêu chuẩn loại trừ tính. Sản phẩm khuếch đại sẽ được điện di - Loại trừ các thể tăng sản thượng thận bẩm sinh khác (được khẳng định bằng chẩn đoán phân tử) bao gồm thiếu 11 βhydroxylase; thiếu 3β - hydroxysteroid dehydrogenase typ 2. - Loại trừ các bệnh nhân suy thượng thận bẩm sinh do các nguyên nhân khác như giảm sản thượng thận bẩm sinh, suy thượng thận mao quản trên máy giải trình tự. Số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi đầu dò sẽ tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu với đầu dò đó. Quy trình MLPA: Cho 5µl DNA cần phân tích vào 1 ống PCR, biến tính ở 98oC trong 5 phút. Nhiệt độ được chuyển về 2oC trước khi cho 3µl hỗn hợp chứa các đoạn oligonucleotid của các probe. Hỗn hợp được ủ ở 60oC trong bẩm sinh do suy yên. - Loại trừ các bệnh nhân nam dậy thì sớm 16 giờ, lúc này 2 đoạn lai của 2 phân tử giả và bệnh nhân nữ nam hóa do các nguyên oligonucleotid sẽ gắn với exon đích đặc hiệu ở nhân khác như u vỏ thượng thận nam hóa. vị trí sát nhau. Thêm 32µl hỗn hợp ligase 2 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC buffer, ủ ở 54oC trong 15 phút, lúc này enzym exon đột biến. Trong trường hợp bệnh nhân ligase nối 2 đoạn oligonucleotid của probe với có đột biến dị hợp tử xóa đoạn, đỉnh tín hiệu nhau. Phản ứng nối sẽ chấm dứt khi tăng sẽ có chiều cao bằng một nửa chiều cao của nhiệt độ lên 98oC trong 5 phút, hỗn hợp được mẫu đối chứng. giữ ở 4oC. Để khuếch đại sản phẩm lai: Thêm 10µl sản phẩm lai vào 30µl hỗn hợp PCR buffer, giữ ở 60oC trước khi thêm 10µl hỗn hợp PCR master vào hỗn hợp, thực hiện chu trình nhiệt sau: [95oC - 30 giây, 60oC - 30 giây, 72oC - 1 phút] x 35 chu kỳ; 72oC - 20 phút; sản phẩm được bảo quản ở 4oC. Sản phẩm khuếch đại probe sẽ được điện di mao quản huỳnh quang trên máy giải trình tự để phân tích kết quả. Nếu có đột biến xóa đoạn, probe không gắn được vào gen đích, do đó kết quả điện di sẽ không xuất hiện đỉnh tương ứng tại 3. Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ tuyệt đối các quy định về đạo đức trong nghiên cứu y sinh. Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân hoàn toàn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân sẽ được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật. III. KẾT QUẢ Bảng 1. Kết quả phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 của bệnh nhân Kiểu gen Thể bệnh Dạng đột biến n % Mất toàn bộ gen (Del/Del) Mất muối Homozygous 10 28,6 exon 1 del/ exon 1 del Mất muối Homozygous 1 2,9 exon 1 - 2 del /exon 1 - 2 del Mất muối Homozygous 1 2,9 Đồng hợp tử exon 1 - 3 del/exon 1 - 3 del Mất muối Homozygous 5 14,3 57,2% exon 1 - 8 del/exon 1 - 8 del Mất muối Homozygous 2 5,6 exon 8 del/exon 8 del Mất muối Homozygous 1 2,9 exon 1 - 6 del/exon 4 - 6 del Mất muối Heterozygous 2 5,6 Del/exon 1 - 3 del Mất muối Heterozygous 1 2,9 Del/– Mất muối Heterozygous 7 Del/– NHĐT Heterozygous 5 Tổng cộng 35 Dị hợp tử 42,8% 34,3 100% Dạng đột biến chiếm tỉ lệ cao nhất là đột biến đồng hợp tử với 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8%. Nghiên cứu đã phát hiện được 9 kiểu gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– (34,3%), tiếp đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3 chiếm tỉ lệ là 14,3%, các dạng đột biến còn lại chiếm tỉ lệ thấp hơn từ 2,9 - 5,6% (bảng 1). TCNCYH 117 (1) - 2019 3 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Biểu đồ 1. Tỉ lệ các thể bệnh Bằng kỹ thuật MLPA, 35/102 (34,3%) bệnh nhân đã được phát hiện có đột biến xóa đoạn gene CYP21A2. Trong đó bệnh nhân thể mất muối chiếm 85,7% (30 bệnh nhân), bệnh nhân thể nam hóa đơn thuần chiếm 14,3% (biểu đồ 1). 50% 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 47% 17% 15% 6% Del - Exon 1-3 Exon 1-8 del del 3% 3% Exon 1 Exon 1-2 del del 3% 3% Exon 8 del 3% Exon 1-6 Exon 4-6 del del Biểu đồ 2. Tỉ lệ các allele đột biến Del là allele xóa toàn bộ gen CYP21A2; (-) là allele không phát hiện được đột biến xóa đoạn Biểu đồ 2 mô tả tỉ lệ các allele đột biến trong nghiên cứu, trong đó allele xóa toàn bộ gen chiếm tỉ lệ cao nhất với 47%, tiếp đến là allele xóa đoạn exon 1 - 3 (15%), các allele xóa đoạn còn lại chiếm tỉ lệ từ 3 - 6%. Tuy nhiên, 17% allele còn lại không phát hiện được đột biến xóa đoạn. Kết quả hình 1 cho thấy chiều cao đỉnh của exon 1 và exon 3 của bệnh nhân chỉ bằng một nửa so với mẫu đối chứng trong khi đó các đỉnh khác có chiều cao giống nhau giữa mẫu bệnh và mẫu chứng. Điều đó chứng tỏ bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3. 4 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Mẫu chứng Ex4 Ex3 Ex1 E1P Ex8 E10P I2P Ex6 Mẫu bệnh nhân Ex3 Ex1 Hình 1. Kết quả đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2; E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, intron 2 và exon 10 của gen giả CYP21A1P; Y là đỉnh tương ứng với nhiễm sắc thể Y dùng để xác định giới tính. Hình trên là hình ảnh tương ứng với kết quả người bình thường, hình bên dưới là hình ảnh tương ứng với kết quả của bệnh nhân bị xóa đoạn dị hợp tử exon 1 đến exon 3 gen CYP21A2. IV. BÀN LUẬN Áp dụng kỹ thuật MLPA, 102 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21-OH đã được phân tích để phát hiện đột biến gen. Kết quả cho thấy 34,3% bệnh nhân được phát hiện là có đột biến xóa đoạn. Nghiên cứu đã phát hiện được 8 dạng đột biến xóa đoạn gen gồm: mất toàn bộ gen (Del), exon 1 del, exon 1 - 2 del, exon 1 - 3 del, exon 1 - 6 del, exon 1 - 8 del, exon 4 - 6 del và exon 8 del. Kết quả này phù hợp với các dạng xóa đoạn được tìm thấy trong các nghiên cứu khác trên thế giới [5; 9]. là 14,3%. Như vậy các đột biến xóa đoạn lớn chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các đột biến và tỷ lệ này cũng phù hợp với các nghiên cứu trên các chủng tộc khác nhau. Xóa đoạn lớn chiếm tỷ lệ từ 18,8% đến 45% ở các nước châu Âu bao gồm: Phần Lan, Đan Mạch, Áo, Anh, Đức, Thụy Điển, Hà Lan, các nước Đông Âu [5; 9; 10; 11]. Tỷ lệ thấp hơn các đột biến xóa đoạn lớn gặp ở các nước châu Á như Trung quốc (25,4%), Nhật Bản (12%) [12; 13]. Sự khác nhau này có thể do cỡ mẫu nghiên cứu khác nhau và có thể có yếu tố chủng tộc. Tỉ lệ đột biến xóa đoạn di hợp tử với 1 allele không xác định được đột biến là 34,3%. Nghiên cứu cũng xác định được 9 kiểu Theo quy luật di truyền của Menden, đối với gen, trong đó kiểu gen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– (34,3%), tiếp bệnh lý di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, cần phải có 2 allele đột biến mới biểu đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3, chiếm tỉ lệ hiện bệnh. Chúng tôi giả thiết allele còn lại ở các bệnh nhân này có thể là đột biến điểm. Do TCNCYH 117 (1) - 2019 5