Apoptosis - Sự chết tế bào

Chia sẻ: Nguyễn Minh Khôi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:30

Thêm vào BST

Báo xấu

326
lượt xem 57
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết sau đây nhằm tìm hiểu về sự chết tế bào Apoptosis, nguyên nhân, quá trình diễn ra và vai trò của nó. Động thời, bài viết cũng giúp các bạn hiểu những cơ chế quan trong trong chuyển hoá tế bào bình thường.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Apoptosis - Sự chết tế bào

APOPTOSIS SỰ CHẾT CỦA TẾ BÀO Sự tăng sinh và chết tế bào là hai mặt của một vấn đề giúp đảm bảo cân bằng nội môi tế bào. Những mạng lưới điều hoà điều khiển đời sống và quyết định cái chết trên cấp độ tế bào thì phức tạp hơn nhiều so với chúng ta từng nghĩ. Quá trình này diễn ra bình thường là nhờ vào sự diều hòa một các nghiêm ngặt của cơ thể nhưng khi gặp một số tác nhân tạo nên sự mất cân bằng (như bệnh, thoái hóa neuron,biến đổi tạo hình), quá trình này sẽ thay đổi. Apoptosis có ở tất cả các động vật đa bào. Điều quan trọng ở đây là các tế bào nào sẽ tham gia vào quá trình chết tế bào apoptosis và cách các tế bào này vào apoptosis. Hai con đường chính dẫn đến quá trình apoptosis: các thụ thể chết (lộ trình bên ngoài) vàlộ trình ty thể (lộ trình bên trong). Lộ trình ty thể là một quá trình nhanh chóng và mạnh mẽ. Sự phá huỷ ty thể làm phóng thích các yếu tố tiền apoptosis như cytochrome c. Còn nhiều lý do làm cho quá trình nghiên cứu gặp khó khăn, một trong số đó là cho đến nay người ta vẫn chưa chắc chắn về mối quan hệ của hai lớp màng của ti thể và mối quan hệ của các lỗ lớn tham gia. Gần đây, nghiên cứu trênsự tái cấu trúc mào ty thể đã cho ta biết về một “trạm kiểm soát” các tế bào đi vào apoptosis, qua đó xác định độ nhạy của con vật trưởng thành với apoptosis. Giới thiệu: Sự sống và cái chết Sự sống và cái chết đi chung với nhau như 2 mặt của cùng một đồng xu. Sinh học tế bào và sinh hoá 1
đã củng cố cho luận điểm này, cho chúng ta thấy rằng đã có sự sống ăt hẳng sẽ phải có cái chết và ngược lại. Các tế bào có thể chết vì già, vì khiếm khuyết, vì thừa so vơi nhu cầu của mô hay vì chúng gây ra vài hư hại. Điều chắc chắn là tất cả tế bào thật sự được lập trình để chết. Nhưng các tế bào sống được là nhờ một loạt những tín hiệu ngăn cản chúng thực hiện các chương trình chết của mình. Kết quả là, các tế bào sống sót, tăng sinh, biệt hoá, và thực hiện những chức năng của chúng. Các tín hiệu ngăn cản chương trình chết này có thể là các tín hiệu nội bào hay ngoại bào. Khi các tín hiệu này không được phát ra hay có một tín hiệu khác mạnh hơn nó được hoạt hóa, tế bào sẽ đi vào chu trình chết của chúng. Trong trường hợp này, sự sống là bất cứ điều gì mà không có cái chết. Điều này dẫn đến việc tế bào sinh ra rồi lại chết đi và có chết đi mới có tế bào tiếp tục được sinh trưởng và phát triển, cứ tiếp tục như thế cho đến hết cuộc đời hay nói khác hơn chết có chu trình đóng một vai trò chủ chốt trong việc phát triển và tăng trưởng của những sinh vật phức tạp. Một lượng lớn các tế bào chết trong quá trình phát triển của phôi, ví dụ trong giai đoạn tạo tác hình thành các cơ quan. Trong cuộc đời của các sinh vật trưởng thành, các tế bào chết đi với một số lượng lớn đối trọng với sự phân chia tế bào để (1) cung cấp cho cơ thể những tế bào cần cho những giai đoạn khác nhau, (2) để diệt những tế bào già, hư hại hoặc gây hại trong tổng số tế bào hằng định nội môi. Sự mất cân bằng giữa sự phân chia tế bào và sự chết tế bào dẫn đến những bất thường về phát triển, những bệnh thoái hoá hay những biến đổi tân sinh. Những cách thức tế bào chết đi Sự hoại tử Tác nhân gây bệnh là chấn thương nghiêm trọng như: bỏng, đứt hay đè nén, có thể gây chết tế bào hoại tử.Trong cái chết hoại tử này, tình trạng stress quá mức gây nên tình trạng sinh hóa không tương thích với sự tồn tại bình thường của tế bào. Trong trường hợp này, những khối các tế bào trong mô bị sưng phù và sau khi nghiên cứu người ta nhận thấy rằng các khối tế bào bào này không còn tồn tại hoạt động chuyển hóa. DNA nhân ngưng tụ, tập trung nhiều nhất ở rìa nhân và các thành phần tế bào bắt đầu phân hủynhanh chóng và không kiểm soát được. Những chất quan trọng nội bào nhanh chóng rò rỉ ra khỏi tế bào, kích hoạt tình trạng viêm nhờ tế bào của hệ miễn dịch bẩm sinh.Những bằng chứng gần đây cho thấy rằng đáp ứng viêm được khởi phát bằng cách phóng thích một phổ đầy đủ của các phân tử được gọi chung là alarmins, mà cụ thể danh tínhvẫn còn chưa được xác định chính xác. Đặc điểm chung của chúng là khả năng hoạt hóa các thụ thể nhận dạng đại thực bào, tế bào đuôi gai và các tế bào diệt tự nhiên. Qua đo các alarmins này sẽ giúp các tế bào của hệ miễn dịch kích hoạt được tế bào T và bắt đầu đáp ứng miễn dịch, để ngăn chặn nhiễm trùng và loại bỏ tế bào ở các mô đang bị viêm.Tại thời điểm này, các mảnh vỡ tế bào bị nhấn chìm và được loại bỏ bởi các đại thực bào. 2
Hình 1: Sự khác biệt giữa hoại tử và apoptosis. Nét cơ bản là sự phá hủy màng bào tương phóng thích tất cả thành phần của tế bào ở hoại tử, điều này có thể khởi phát tiến trình viêm lan rộng. Trong apoptosis, màng bào tương nguyên vẹn của các thể apoptotic hầu như sẽ bị thực bào êm đềm không khởi phát tiến trình viêm. Apoptosis Quá trình thứ hai của cái chết được đặt ra là apoptosis (trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là sự rụng lácây cối). Năm 1972, một kiểuchết tế bào mới được định nghĩa đã được xác định bởi Kerr, Wyllie, và Currie.Ban đầu kiểu chết này được xem như không thoái hóa trong tự nhiên nhưng sau đó một bài nghiên cứu ấn tượngsau đó đã chứng minh điều ngược lại. Apoptosis là khôngchỉ là một quá trình hoạt động theo thứ tự, mà nó còn là một quá trình yên lặng bằng cách tháo dỡ các tế bào nhưng không lan truyền bừa bãi đến các tế bào xung quanh. Ở cấp độ tế bào, quá trình này đặc trưng bởi một sự khởi phát làm thủng các tế bào và sau đóphá vỡ những mối liên hệ tế bàotế bào. Các tế bào co tròn lại và màng nội bào và các bào quan cô đặc lại nhiều hơn trong tế bào chất, sau đó chúng sẽ tối hơn. Hình 2: tiến trình Apoptosis. Đáng chú ý là ở thời kì muộn của quá trình, các bào quan vẫn còn nguyên vẹn và bình thường,cho thấy hoạt động chuyển hóa vẫn còn quan trọng đối với tế bào trong thời gian đầu. Các thành phần tế bào chất không bị rò rỉ khỏi tế bào, vì vậy, đáp ứng viêm không được tạo ra. Trong nhân, chất nhiễm sắc cô đặc tối đa và thườngtạo ra các phần hình lưỡi liềm bao quanh màng nhân hoặc pycnosis. Sự kiện rất đặc biệt nàykhông nhìn thấy trong bất kỳ trường hợp nào khác.Endonucleasestách một cách chính xác DNA giữa các nucleosome, cho ra những mảnh vỡ của 180 (hay nhiều hơn) đôi base. Mặc dù ít được 3
chú ý hơn, những mạng lưới nội bào khác như Golgi, lưới nội chất và ty thể cũng bịphân mảnh đáng kể. Trong khi quá trìnhphân cắt DNA tiếp tục, nhân bắt đầu vỡ thành từng mảnh vàtế bào tương tự cũng chia tách thành một số mảnh nhỏ còn nguyên vẹn hoặc các thể apoptosis không bắt màu thuốc nhuộm. Sau đó xảy ra sự thực bào, một quá trình trong đó các đại thực bào di cư hay các tế bào biểu mô khoẻ mạnh xung quanh nuốt các mảnh vỡ của tế bào. Sự kiện này đặc biệt đáng chú ý là ở trạng thái bình thường các thực bào nàytham gia trong việc nhận và loại bỏ vật lạ hoặc các thực thể "không phải của bản thân". Kết quả là, các thể apoptosis gắn vào một túi được bao bọcbởi màng trong một tế bào gọi là thể thực bào. Cuối cùng, tế bào chủhay thể thực bào và chất chứa của nó dần dần bị suy thoái, và trong nhiều trường hợp, một tế bào mới thay thế tế bào cũ trong một vài giờ. Trong một số hệ thống tế bào,đặc biệt là trong nuôi cấy tế bào (in vitro), apoptosis không xảy ra với đầy đủ các bước và theo đúng trình tự thời gian như ở trên.Lưu ý, sự cô đặc nhiễm sắc chất thành quả bóng đặc hình cầu tại một đầu của nhân không phải là bất thường. Trái lại, khi nuôi cấy trong ống nghiệm (in vitro), các tế bào trải qua quá trình apoptosis bị mất một phần màng plasma. Trong trường hợp không có đại thực bào, các tín hiệu apoptosis có vai trò thúc đẩysự tự loại bỏ nhanh chóng bởi sự vắng mặt các đại thực bào nhận diện sự bất thường (ví dụ như sự ngoại bào hoá phosphatidylserine từ lớp trong ra lớp ngoài trên màng bào tương của chúng) không thể xảy ra. In vivo, sự nhận diện này loại bỏ hiện tương viêm và khở động phản ứng đông máu. Hình 3: Scramblase hoán vị phosphatidyl serine từ lớp lipid trong ra lớp lipid ngoài, macrophage có thể nhận diện sự bất thường này, ngoài ra PS còn có thể tương tác với 4
Hình 4: gắn kết phosphatidyl serineAnnexinV Hình 5: gắn kết Annexin V (A5)PS vị trí nhận diện của macrophage. Sự tự thực (Autophagy) Bên cạnh sự hoại tử và apoptosis, chúng ta nên giới thiệu một quá trình đáng chú ý thứ ba quyết định cái chết của tế bào và có vai trò ngày càng quan trọng trong cuộc sống con người. Đó là sự tự thực. Nếu như apoptosis là rất quan trọng trong phát triển và sinh lý bình thường cũng như trong một phạm 5
vi rộng các bệnh lý thì sự tự thực cũng vậy. Sự tự thực hay chính xác hơn là đại tự thực, là một quá trình ly giải proteinliên quan đến cô lập các bộ phận của tế bào chất trong những túi màng đôi được gọi là túi tự thực hoặc các autophagosomes, kết hợp với các lysosomes hình thành nên autophagolysosome.Trong autophagosome, vật chất trong tế bào chất bị nuốtbị thủy phân và các sản phẩmamino acids, các tiền chất đại phân tử khác có thể được tái chế. Sự tự thực hạn chế này là một cơ chếđể cung cấp cho các tế bào các cơ chất trao chuyển hoá để đáp ứng nhu cầu năng lượng của mình dưới những điều kiện căng thẳng, chẳng hạn như: sự tước mất chất dinh dưỡng. Đây cũng là cơ chếly giải protein căn bản cho những protein bị mòn và ủng hộ việc loại bỏ có chọn lọc các bào quan bị hư hỏng (và có thể nguy hiểm), nhờ đó duy trì kiểm soát chất lượng của chúng. Trong những trường hợp này, sự tự thực hoạt động như một cơ chế tiền sống sót. Mặc dù người ta đã mô tả rằngsự tự thực có thể bảo vệ các tế bào bằng cách ngăn chặn chúng trải qua quá trình apoptosis, mọi thứ không đơn giản như vậy, vàvai trò của nó hiện còn đang bàn cãi, vì nó cũng có thể làm ngược lại tức là nó có thể giết chếtcác tế bào. Trong thực tế, chết tế bào do tự thực còn được gọi là chết tế bào được lập trình loạiII để phân biệt với quá trình apoptosis hoặc chết tế bào được lập trình loại I. Gọi như vậy vì các tế bào có khiếm khuyết trong bộ máy apoptosis sẽ chết theo kiểu tự thực.Ngoài ra, chết tế bào do tự thực có thể được gây ra bởi sự tăng các oxygen dạng tái hoạt động cũng còn gọi là gốc oxy tự do phản ứng (reactive oxygen species, ROS), kết quả của sự ly giải protein tự thực của catalase. Ở các tế bào chết do apoptosis, các protein cấu trúc như bộ khung tê bào sẽ bị ly giải protein sớm trong khi các bào quan được giữ nguyên đến cuối quá trình. Ngược lại, trong chết tế bào do tự thực, một sự tích lũy lớn các túi tự thực liên quan đến sự ly giải protein đầu tiên của các bào quan, trong khibộ khung tế bào vẫn còn nguyên vẹn và duy trì chức năng cho đến khi vào cuốiquá trình. Bất kể những điểm khác biệt về hình thái đáng kể giữa apoptosis và sự tự thực, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sự đại tự thực có mối quan hệ phức tạp với quá trình apoptosis dựa trên các kết nối chặt chẽ tồn tạigiữa các tác nhân kích thích và bộ máy điều hoà kiểm soát cả hai quá trình này. Đó lànhững chất điều hoàsự tự thực có thể kiểm soát quá trình apoptosis và ngược lại. Vì vậy, mặc dù các nghiên cứu về hình tháisẽ dẫn chúng ta đến kết luận rằng quá trình apoptosis và đại tự thực là hai cách chết khác nhau nhưng có lẽchúng chỉ là hai khía cạnh khác nhau của cùng cơ chế chết tế bào tích hợp. Hơn nữa, nhiều ví dụ bắt đầu chỉ ra rằng thật sự không có hai cơ chế chết tế bào được lập trình (apoptosisvà sự tự thực) và một cơ chế ítđược điều hoà thứ ba (hoại tử). Thay vào đó, chết tế bào có thể được coi là một cơ chế tích hợp trong đó ba quá trình làm việc với nhau và điều hoà lẫn nhau một cách liên tục, với sự phân biệt không rõ ràng giữa chúng. Các tế bào đã đi vào quá trình chết thì nếu không chết bằng apoptosis thì cũng sẽ chết bằng con đường khác. Chúng ta chỉ nghiên cứu cơ chế chết nổi bật nhất tại 1 thời điểm trong tế bào. Tuy nhiên, có sự phân biệt rõ ràng giữa cái chết được cam kếttứcapoptosis và sự tự thực, chúng ta có thể khẳng định rằng trong khi cái chết do xâm phạm (sự tự thực) là một sự hỗn loạn và là một quá trình thụ động, cái chết đã cam kết (apoptosis) là một quá trình có thứ tự, được lập trình, và hiện diện trong tất cả các quá trình hoạt động ở cấp độ phân tử. Số phận của tế bào và Apoptosis Rất rõ ràng rằng các tế bào khỏe mạnh và các tế bào đã được tiếp xúc với một tác nhân gây hư hạicó các chương trình di truyền và phân tử để nhận được hướng dẫn (tín hiệu) và đáp ứng với những tín hiệu này. Đáp ứng này có thể là một chuỗi các sự kiện dẫn đến việc đình chỉ chu kỳ tế bào và sửa chữa hoặc lựa chọn đi đến apoptosis. Tế bào có thể bị xâm phạm bởinhững chất độc và không độc đối vớibộ gene làm tăng nhanh chóngp53. Thật ra tất cả các loại gây hại đến DNA (ví dụ: bức xạ, phản ứng với các gốc tự do oxy hóa, thuốc, nhiễm virus, v.v) được xác định là do sự tồn tại của protein p53 và lộ trình chuyển hoá của nó. Ngoài ra hư tổn các thành phần liên quan đến việc phân bố các vật liệu di truyền (chẳng hạn như thoi phân bào), tình trạng thiếu oxy, sự kích hoạt oncogen,cạn kiệt ribonucleotide hoặc tiếp xúc với nitric oxide, cũng gia tăng mức đáng kể nồng độ của protein này trong 6
tế bào. Do đó, lộ trình p53 liên quan đến hàng trăm gen và các sản phẩm của chúng đáp ứng một loạt cáctín hiệu stress tế bào và p53 được xem là protein được nghiên cứu nhiều nhất hiện nay. Nó đóng vai trò quan trọng trong việc theo dõi tính chính xác trong di truyền của tế bào, vì vậy mà nó còn được gọi là “chất bảo vệ bộ gen ". p53 đáp ứng với sự hư hại DNA hay với việc các tế bào không vượt qua được checkpoint bằng cách tạo một loạt phản ứng chống tăng sinh. Các nghiên cứuvề khiếm khuyết di truyền khi cấy ghép sớm trước và sau phôi động vật có vú đã chứng minh rằng được rằng p53 sẽ làm các tế bào quái thai chết đi thông qua apoptosis và làm sẩy nhưng phôi bị khiếm khuyết. Như vậy, một trong những chức năng quan trọng nhất của p53 là khả năng tạo ra apoptosis, sự gián đoạn của lộ trình p53 này có thể thúc đẩy sự tiến triển của khối u và sức đề kháng hóa trị. Các chương trình dịch mã của p53 rất linh hoạt, vì nó thay đổi theo bản chất của các kích thích kích hoạt, loại tế bào và thời gian của tín hiệu kích hoạt. Tính linh hoạt này có thể cho phép tế bào gắn kết các phản ứng thay thế để kích hoạt p53, chẳng hạn như ngừng chu kỳ tế bào hoặc apoptosis. Làm thế nào p53 có liên quan trong việc đưa ra quyết định này vẫn chưa được biết rõ. Dù vậy đối với một tế bào riêng lẻ, sự lựa chọn có thể được chi phối bởi mức độ mà lượng p53 được nâng lên đáp ứng với sự hư hại DNA.Với lượng thấp p53thì khởi động gen sửa chữa, còn lượng p53 cao hơn được yêu cầu để mở những genes apoptosis hoặc tắt những genes dành cho sự sống còn. Bên cạnh khả năng thúc đẩy apoptosis thông qua cơ chế dịch mã phụ thuộc, p53 cũng có thể kích hoạt apoptosis độc lập với sư điều hoà dịch mã. Để đảm bảo sự phát triển của tế bào bình thường, nồng độ và hoạt động của p53 được điều hoà một cách chặt chẽ. Trong hầu hết các tế bào ở điều kiện bình thường, p53 thường hiện diện ở mức rất thấp hoặc không thể phát hiệnđược. Protein này có một cuộc sống rất ngắn (630 phút) và nồng độ của nó phần lớn được quy định bởi sựphân huỷ protein nhanh chóng. Nhờ các hình thức đa dạng của stress tế bào,mức độ ổn định và hoạt động phiên mã của p53 xảy ra nhanh chóng (trong vòng hai giờ). Sự ổn định và kích hoạt p53 là một kết quả của sự ức chế bị cản trở bởi các chất điều hoà âm như Mdmx (còn được gọi là Mdm4) và Mdm2; trong khi các chất kích hoạt khác như HIPK2 và DYRK2 có thể tăng cường đáp ứng p53. Khi p53 được tăng lên và kích hoạt, nó sẽ tăng khả năng liên kết với các yếu tố chuỗi DNAđáp ứng p53 trong hệ gene tạo nên sự thay đổi trong sao chép ở hơn 150 genesđược điều hoà dương hay âm bởi p53. Một vài gene điều hòa bởi p53 có thể được sao chép khi nhận được nhiều loại tín hiệu khác nhau và xảy ở tất cả các mô (ví dụ như MDM2, Gadd45, hoặc những genes mã hóa cho p21 và cyclin G)nhưng cũng có một vài gene chỉ sao chép khi nhận được tín hiệu phù hợp ở những mô phù hợp mà thôi (ví dụ như PTE TSC2).Cơ chế của quá trình điều hòasự khác biệt này vẫn chưa rõ ràng.Chức năng của các gen đáp ứng với p53 gồm nhiều loại. Một tập hợp các gen và các sản phẩm của chúng liên quan đến việc đình chỉ chu kỳ tế bào và quá trình lão hóa tế bào(ví dụ như p21, 1433 sigma, Gadd-45). Trong các tế bào không thể sửa chữa, một bộ thứ hai cácgenesdo p53điều hoàsẽ tham gia vào quá trình apoptosis. Như chúng ta sẽ thảo luận dưới đây,cả lộ trìnhbên trong và bên ngoàicủa quá trình apoptosis đều được khởi phát.Tronglộ trìnhbên ngoài,p53điều hoà sản xuất Fas (một protein được tiết ra), cũng nhưDR5/killer, thụ thể trail và một protein màng. Lộ trình tín hiệu nội tại được tăng cườngvới nhiềugenes do p53 điều hoà trong đó các protein Bax, Noxa vàPuma có thể hoạt động trong các loại tế bào khác nhau. Mối quan tâm chính của các nhà nghiên cứu bây giờ là cách p53 khởi sự apoptosis thông qua chương trình dịch mã của nó một cách chi tiết và cụ thể.Mặc dù có rất nhiều tế bào được tạo thành trong suốt quá trình cảm ứng của apoptosis nhưng chưa xác định được một gen đích mà sự thay đổi biểu hiện đơn lẻ của nó có thể giải thích đầy đủ quá trình p53. Người ta đã chứng minh rằng một phần nhỏp53 sinh ra nhanh chóng di chuyển ra khỏi nhân và thúc đẩy apoptosis trong khi nó tương tác với các thành phần chống và tiền apoptosis của của dòng tế bào B CLL/lymphomacủa những chất điều hoà hoà tính thấm ty thể. Một số nhóm nghiên cứu đã xác nhận sự tồn tại của cái chết ty thể trực tiếp qua trung gian p53. 7
Hình 6: tích hợp lộ trình tín hiệu của hiện tượng Apoptosis. Lưu ý vai trò của protein1433 và p53. protein 1433 chịu tác động sớm từ Akt(protein kinase B) ức chế hoạt động của Bad và FoxO1 kiểm soát chu kỳ tế bào và apoptosis. p53 có tác động hai mặt, sửa chữa sai lệch ở đoạn DNA ngắn; khi không thể sửa chữa thì protein này có vai trò biểu hiện gen apoptosis gây chết tế bào. Sự huỷ diệt của tế bào và sự kết thúc của Apoptosis Một khi quá trình apoptosis được kích hoạt,giai đoạntác động của sự hủy diệt của tế bào trong hầu hết trường hợplà con đường không thoái lui. Những biến đổi hình thái biểu hiện của apoptosis được tạo ra bởi những gì diễn ra trong giai đoạn này, và sự gián đoạn của nó chỉ đơn thuần là không điều hoà quá trình đó chứ không cho các tế bào sống sót. Nghiên cứu tiến hành trong hai thập kỷ qua đã cho ta biết về một mạng lưới phức tạp các phân tử thực hiện và điều tiết quá trình apoptosis. Điều thú vị là, trong những năm gần đây, một sự chuyển đổi mô hình đã xảy ra và nó giúp chúng ta hiểu rằng các protein tham gia vào quá trình apoptosis cũng thực hiện những chức năng không liên quan đến chết tế bào. Thật vậy, có vẻ như sự tiến hóa đã không "tạo" ra những yếu tố tiền apoptosis mà đúng hơn là đã "chiếm đoạt" những phân tử đã có chức năng trong các quá trình quan trọng (chẳng hạn như thích ứng với stress) vào chết tế bào theo chương trình. Ở cấp độ proteome, hầu hết các tính năng siêu cấu trúc của quá trình apoptosis là kết quả của hàng trăm protein trải qua quá trình ly giải protein bị hạn chế trong giai đoạn tác động. 8
Tuy nhiên, cho đến nay sự liên quan của đa số các sự kiện ly giải protein vẫn còn chưa rõ ràng. Một loạt các protease cystein từ họcaspase làm trung gian phân cắtnhiều protein này. Trong thực tế, gần như tất cả các kích thích kích hoạt apoptosis đều thông qua việckhởi phátcác sự kiện liên quan đến kích hoạt caspase, mặc dù theo những cách hơi khác nhau. Trong các động vật có vú, ba cách chính để kích hoạt caspase apoptosis liên quan đã được công bố, bao gồm (1) con đường ngoại sinh hay con đường thông qua thụ thể chết,(2) con đường nội sinh hay con đường qua trung gian ty thể và (3)con đường B granzyme. Ngoài ra, ít nhất là hai con đường khác đã được đề xuất nhưng chúng vẫn chưa biết rõ. Lộ trình ngoại sinh Lộ trìnhngoại sinh được khởi độngbởi các kích thích ngoại bào, chẳng hạn như phóng thích các yếu tố tăng trưởng kích động sự gắn của các thụ thể chết xuyên màng (một tập hợp con họthụ thể TNF, bao gồm cả TNFR1, Fas/CD95, thụ thể TRAIL 1 và 2, và cả thụ thể chết3) với các ligand cùng nguồn gốc với chúng. Điều này làm hoạt hoá trực tiếp các thụ thể này thông qua trimerization và của một phức hợp tín hiệu gây chết (deathinducing signaling complex DISC) lớn ở mặt tế bào chất của màng bào tương. Mặc dù các thành phần của DISC chưa được xác định, người ta thấy rằng vùng Fasliên quan đến cái chết (Fasassociated death domain, FADD)dường như là thành phần bắt buộc, tuyển chọn và điều biến sự kích hoạt tự động caspase khởi phát, tiền caspase 8 (và có thể của caspase 10). Caspase 8 hoạt động sau đó ly giải protein bằng cách cắt đứt và kích hoạt caspase3, 6 và 7; dẫn đến các việc kích hoạt thêm caspase cho đến khi đến đỉnh trong quá trình ly giải protein chất nền và chết tế bào. Con đường ngoại sinh có thể được kích hoạt bằng các thụ thể phụ thuộc, chúng cung cấp một tín hiệu cái chết khi không có các ligands của chúng, thông qua các chất trung gian chưa được biết đến. Trong trường hợp không ligand, các thụ thể này kích hoạt chết tế bào, do đó tạo ra một tình trạng các ligand phụ thuộc tế bào. Nguyên mẫu các thụ thể phụ thuộc là các thụ thể netrin1 DCC (bị mất trong ung thư đại trực tràng) và UNC5H- 1, 2, 3. Hình 7: Sơ đồ lộ trình apoptosis nội sinh và ngoại sinh. Trong lộ trình ngoại sinh, sự tham gia của cácthụ thể chết với các ligands cùng nguồn gốcgây ra việc bổ sungcácproteinschuyển đổi, chẳng hạn như protein FADD protein tuyển chọn và tổng hợp một số phân tử caspase 8. Phức hợp tín hiệu gây 9
chết (DISC) do đó hình thành trongmặt tế bào chất của màng bào tương, thúc đẩy quá trình xử lý tự động và kích hoạt tiền caspase 8 (và có thể của caspase 10). Đến phiên nó có thể cắt đứt caspase tác động 3, 6, và7. Caspase 8 cũng có thể ly giải kích hoạt Bid. Bid được cắt ngắn đại diện cho các liên kết chính giữalộ trìnhapoptosis ngoại sinh và nội sinh, bởi vì nó hỗ trợviệc kết hợp và chènBax và Bak vào màng ngoài ty thể. Kết quả là quá trình Apoptosis tạo ra kênh (MAC membrane attack complex bao gồm C6, C7, C8α, C8β, C9và perforin) thúc đẩy tăng tính thấm của màng ty thể, đó là dấu hiệu của lộ trình nội sinh. Trong con đường này, một số tín hiệu nội bào, bao gồm stress tổn hại DNA và lưới nội chất (ER), hội tụ trên ty thểđể làm màng ngoài thấm, gây giải phóng các yếu tố tiền apoptosis từ khoảng gian màng. Trong số này, Cyt c gây ra yếu tố apoptosis hoạt hoá protease – 1(APAF1) và ATP / dATP để lắp ráp các apoptosome, một phân tử nền tảng thúc đẩy sựtrưởng thành nhờ ly giải protein của caspase 9. Đến lượt caspase 9 hoạt động, cắt đứt và kích hoạt các caspasesphản ứng, cuối cùng dẫn đến kiểu hình apoptosis. Chất kích hoạt thứ hai có nguồn gốc từ ty thể của các caspases/ protein gắn kết IAP (inhibitor of apoptosis protein) trực tiếp với một pI thấp (Smac/DIABLO) và endoprotease được điều hoà bởi Omi stress/ protein A2yêu cầu nhiệt độ cao (Omi/HtrA2), thúc đẩy quá trình apoptosis gián tiếp, bằng các gắn kết với các chất đối vận của họ IAP (chất ức chế protein apoptosis). Lộ trìnhphụ thuộc granzyme B của sự hoạt hoá caspase liên quan đến việc cung cấp các protease này vào tế bào đích thông qua các hạt chuyên biệt được phóng thích từ các tế bào lympho T gây độc tế bào hoặc các tế bào diệt tự nhiên. Những hạt này cũng chứa lỗ hình thành protein perforin, cho phép granzymes đi vào. Granzyme B có thể xử lý Bid cũng như caspase 3 và 7 để bắt đầu quá trình apoptosis. Lộ trình nội sinh Lộ trình nội sinh dựa trên tính thấm hoá của màng ty thể (mitochondrial membrane permeabilization, MMP) để giải phóng các yếu tố tiền apoptosis như cytochrome capoptosis từ khoảng gian màng của bào quan này. Ví dụ, trong điều kiện của stress tế bào, những chất chống apoptosis trong họ protein Bcl2 (ví dụ, Bcl2 và BclXL), cư trú trong màng ty thể bên ngoài, có thể mất ổn định thông qua giảm biểu hiện, hoặc bổ sung các thành viên tiền apoptosis của họ Bcl2 (ví dụ: Bax, Bad, và Bak). Tỷ lệ giữa các chất tiền apoptosis và chất đối kháng apoptosisngày càng lớn. Việc này gây ra sự lắp ráp các oligomers BaxBak ở màng ngoài ty thể. Những oligomers này làm tổn thương tính thấm của màng, cho phép sự thành lập những kênh đầy protein ngoài màng. Kết quả là những yếu tố tiền apoptosis từ khoảng gian màng của ty thể được phóng thích vào tế bào chất. Trong số này, cytochrome c (Ctyt c) hoạt hoá trực tiếp Apaf1 và với sự hiện diện của dATP hoặc ATP, tạo điều kiện hình thành một phức hợp multimeric lớn thể “apoptosome”. Thể apoptosome tuyển lựa và điều biến quá trình tự hoạt hoá caspase khởi đầu, tiền caspase 9, rồi chất này tiếp tục hoạt hoá caspase 3, 6 và 7. Những chất thuộc họ Bcl2 không phải là tác nhân duy nhất có khả năng xúc tiến MMP cần để phóng thích những yếu tố tiền apoptosis từ khoảng gian màng của ty thể. Các proteases cũng như các tác nhân khác (ceramide, các ROS và Ca2+) cũng có thể có chức năng này. MMP thậm chí có thể lập trình một tế bào đi vào cái chết khi các caspases không được hoạt hoá. Cái chết không phụ thuộc caspase này có thể xảy ra do sự mất chức năng không hồi phục của ty thể cũng như do ty thể phóng thích các chất tác động cái chết không phụ thuộc caspase bao gồm yếu tố gây ra apoptosis (apoptosis inducing factorAIF) và endonuclease G. Cả 2 chất này đi từ tế bào chất đến nhân làm phân đoạn DNA và cô đặc nhiễm sắc chất. Ở mức độ phân tử, sự giao thoa giữa 2 cơ chế apoptosis nội sinh và ngoại sinh xảy ra khi hoạt hoá caspase 3, 6, và 7. Hơn nữa, mục tiêu sinh lý của caspase 8 được hoạt hoá là Bid, một protein BH3 họ 10
hàng duy nhất với Bcl2, thiếu mất vùng xuyên màng. Ở vài tế bào, để đáp ứng với ligands thụ thể chết, caspase 8 cắt Bid thành phân đoạn tận cùng là carboxy bị cắt ngắn (tBid) đi từ tế bào chất đến màng ngoài ty thể. Những oligomers của tBid có thể khởi phát sự thấm của màng ngoài ty thể, theo sau bởi sự phóng thích những yếu tố tiền apoptosis. Bằng cách này, Bid cũng điều biến sự trao đổi giữa 2 con đường nội sinh và ngoại sinh của apoptosis. Ở mức độ thụ thể chết, sự giao thoa giữa con đường nội sinh và ngoại sinh được nghiên cứu rất nhiều. Trong khi ở một số loại tế bào (tên là loại 1), liên kết của ligands với thụ thể chết hoạt hoá những caspase tác động mà không cần có MMP, ở loại khác (loại 2) dòng thác tín hiệu phức tạp ở trên (hoạt hoá caspase 8 > cắt đoạn và hoạt hoá Bid > MMP > hoạt hoá Caspase 3 pụ thuộc Cyt 2) hoàn toàn phụ thuộc vào MMP. Các lộ trình Granzyme B Hình8: chi tiết lộ trình tín hiệu của nối kết hạt độc chứa granzymeB &FASFASL, cho thấy con đường chung là hoạt hóa caspase 8. Hình 9: tế bào ung thư nối kết với cytotoxic lymphocyte qua 2 loại kết nối TCR (T cell receptor) MHC I & FASFASL có vai trò cô lập một vùng màng bào tương giữa 2 kết nối này. Các hạt độc phóng ra từ cytotoxic lymphocyte hướng tới tế bào ung thư chỉ giới hạn trong khu vực này cách thức giao tiếp tế bào này được gọi là tiếp tiết (juxta crine).Các hạt độc chứa Granzyme, Ca2+ C6, C7, C8α, C8β, C9và perforin, granzyme gắn kết với thụ thể mannose6 11
phosphate (MPR) và xâm nhập tế bào ung thư. Gắn kết giữa TCRMHC I cần thiết cho sự hoạt hóa lộ trình PI3K phóng thích Ca2+ từ ER của lymphocyte là động lực xuất bào của hạt độc. P19 là một protein ức chế đặc hiệu granzymeB có thể ức chế quá trình apoptosis. Những tế bào ung thư tăng biểu hiện FASL có thể gây chết cho cytotoxic lymphocyte qua lộ trình caspase của lymphocyte này, điều này giải thích sự thất bại của lymphocyte trong việc phá hủy tế bào ung thư. Hình 46.10: Perforin & granzymeB. Lộ trình phụ thuộc granzyme B của quá trình hoạt hoá caspase liên quan đến sự phân phối protease này vào tế bào đích thông qua các hạt chuyên biệt được phóng thích từ những tế bào lympho T gây độc tế bào (cytotoxic T lymphocytes, CTL) hoặc các tế bào diệt tự nhiên (natural killer, NK). Các hạt CTL và NK chứa rất nhiều granzymes cũng nhưng lỗ tạo thành protein, perforin. Khi tế bào CTL hay NK được hoạt hoá bởi thụ thể kháng nguyên của chúng, các hạt được ly giải di chuyển tụ lại và xếp dọc synapse miễn dịch. Màng của những hạt này hoà với màng bào tương của tế bào diệt và giải phóng các chất có trong nó vào sypnase bao gồm perforin và granzymes. Granzymes gắn kết bới màng tế bào đích bởi liên kết tĩnh điện (granzymes được tích điện dương với pI khoảng 911, và bề mặt tế bào thì tích điện âm), và bởi những thụ thể chuyên biệt như thụ thể không phụ thuộc cation mannose6- phosphate. Tuy nhiên, những thụ thể chuyên biệt này không phải là cửa ngõ duy nhất cần thiết cho sự gắn kết và gây độc tế bào. Ngõ vào của granzymes vào trong tế bào chất của tế bào đích được điều biến bởi perforin, nhưng cách thức hoạt động của perforin thì chưa được rõ. Mô hình đầu tiên về ngõ vào của granzyme thông qua những lỗ trên màng bào tương tạo ra chính bởi perforin được xem là có giá trị. Một mô hình sửa đổi công nhận rằng perforin tạo ra những lỗ hổng vi thể trên màng bào tương gây nên dòng Ca2+ tràn vào khởi phát đáp ứng của màng bào tương và nhập bào nhanh granzymes và bất cứ chất nào gắn với bề mặt tế bào. Thật ra, ngõ vào phụ thuộc động học và kết quả là hình thành những thể nội bào khổng lồ chứa cả granzymes và perforin. Trong vòng vài phút, granzymes thoát ra (thông qua những lỗ perforin trong thể nội bào) và tìm đường đi đến bào chất. Ở một số mô hình khác granzymes chuyển chỗ trước hết thông qua những lỗ kích thước có hạn có thể sửa chữa được của màng tế bào và không phải do những túi nội bào vỡ ra. Nghiên cứu gần đây cho thấy họ serine esterase này có thể hoạt hoá ít nhất 3 con đường chết tế bào khác nhau. Granzyme B hoạt hoá con đường caspase apoptosis bằng cách cắt đứt caspase 3. Tuy nhiên, có bằng chứng rằng nó cũng hoạt hoá những con đường chết tế bào khác (đặc biệt trong ty thể và nhân) và vẫn còn được nghiên cứu. Do vậy, granzyme B của người, chứ không phải enzyme của chuột, hoạt hoá quá trình chết tế bào bằng cách trực tiếp cắt đứt cơ chất caspase, Bid và chất ức chế DNaseđược hoạt hoá bởi caspase (ICAD), để hoạt hoá những con đường huỷ hoại ty thể và DNA tương tự như caspases. Kết quả là các chất ức chế caspase có tác động nhỏ đến sự chết tế bào do granzyme B ở người và sự phân mảnh DNA, trong khi những chất ức chế tương tự ngăn chặn hoạt động của enzyme chuột. Con đường ty thể granzyme B (và caspase) dẫn đến việc sản xuất ROS, mất MMP, với sự phóng thích cytochrome c và những phân tử tiền apoptosis khác từ khoảng gian màng ty thể. Granzyme B người hoạt hoá trực tiếp con đường này (bằng cách cắt đứt Bid) trong khi enzyme 12
chuột hoạt hoá gián tiếp. Mục tiêu khác của granzymes là nhân tế bào. Granzyme A và B nhanh chóng di chuyển đến nhân tế bào., nơi quá trình phân cắt ly giải những cơ chất chính rất quan trọng trong việc tạo ra chết tế bào theo lập trình bởi 2 enzyme này xảy ra. Sự di chuyển đến nhân tế bào của granzymes có lẽ được hỗ trợ bởi importinα. Chúng ta mới phần nào hiểu được cách thức các granzymes khác ngoài B hoạt hoá chết tế bào vì các phòng thí nghiệm đã chỉ mới bắt đầu giải mã những dạng tái tổ hợp hoạt động của cácenzymes này. Điều mới được sang tỏ gần đây là granzyme A hoạt hoá sự chết tế bào với những đặc trưng hình thái của apoptosis nhưng hoà toàn độc lập với caspase và liên quan đến những con đường làm huỷ hoại ty thể và DNA,. Hơn nữa, granzyme C (ở chuột) và granzyme H (ở người) cũng hoạt hoá sự chết tế bào độc lập với caspase với kiểu hình ty thể. Có vài chứng cứ cho rằng granzyme M có thể hoạt hoá sự tự thực. Những lộ trình phụ thuộc và không phụ thuộc các Caspase khác Có thêm 2 proteases không phải caspase bên cạnh granzymes đã được xem như là chất phản ứng của apoptosis. 1. Họ cathepsin bao gồm cysteine, asparte và các serine proteases. Cathepsin B và cathepsin L, cả cysteine proteases và cathepsin D, aspartate protease đều có liên hệ thường xuyên đến apoptosis. Những proteases này nằm trong lysosome và/hoặc các thể nội bào, nhưng chúng di chuyển ra tế bào chất trong suốt apoptosis. Các cathepsin có thể phân cắt một số lượng các cơ chất bao gồm các chất trong họ Bcl2 như p53, cyclin D, cFos và cJun.30. Vả lại hoạt động của cathepsin được chứng minh là có liên quan đến MMP(matrix metalloproteinase), sự cô đặc nhiễm sắc chất, sự ly giải protein của chất nền nội bào, sự xử lý các chất tiền caspase và biểu hiện phosphatidyl serine (PS) ra ngoài màng bào tương của tế bào bị apoptosis. Một cơ chế gần đây cho rằng MMP qua trung gian cathepsin và apoptosis không phụ thuộc caspase liên quan đến apoptosis kết hợp lysosome tạo ra protein LAPF thúc đẩy tính thấm hoá của màng lysosome và phóng thích cathepsin vào những tế bào fibrosacoma. Cathepsin K là một enzyme đặc biệt tiết ra từ osteoclast giện diện trong quá trình phá hủy và tạo mới mô xương. Hình 11: cathepsin K phá hủy nền apatite. Hình 12: phân tử cathepsin K. 2. Calpain là một họ protein mà hoạt tính thủy phân các protein khác lệ thuộc vào nồng độ Ca++ 13
(calciumdependent proteolytic activities) nội bào, họ calpain của cysteine proteases có mặt trong bào chất. Cả μcalpain và mcalpain đều có liên hệt với những quá trình của apoptosis và các tình trạng bệnh lýcó mất một lượng lớn tế bào (ví dụ bệnh Alzheimer’s và bệnh Parkinson’s) có liên hệ trực tiếp đến hoạt động khác thường của calpain. Các calpain được hoạt hoá bởi sự tăng bất thường nồng độ Ca2+ tự do trong nội bào. Trong lúc một vài nghiên cứu cho rằng không có hoạt động caspase trong suốt quá trình apoptosis được điều biến bởi calpain, thì lại có những nghiên cứu khác ngụ ý rằng hoạt động ly giải protein được tăng cường trong apoptosis thông qua một vòng lặp khuếch đại hướng về nguồn cung cấp có liên quan đến các caspases. Ngoài ra, một “dòng thác calpaincathepsin” cũng đã được đề xuất để tích hợp và nâng cao hoạt động phân giải protein trong quá trình apoptosis. Cuối cùng, sự hư hại DNA có thể phát tín hiệu cho sự hoạt hoá caspase 2. Cơ chế phân tử của tiền caspase (procaspase) 2 trong quá trình apoptosis vẫn còn chưa được xác định. Vài báo cáo cho rằng capase 2 liên quan đến việc phóng thích cytochrome c và cần thiết cho quá trình apoptosis gây ra bởi dược phẩm trong vài dòng tế bào người. Dựa vào những dữ liệu này, caspase 2 được xem như chất khởi phát caspase trong apoptosis gây độc tế bào do stress hoạt động ngược dòng ty thể. Cũng có lúc, các tác giả khác cho rằng hoạt hoá caspase 2 xảy ra xuôi dòng lộ trình của ti thể. Thêm vào đó, caspase 2 được xem là 1 chất trung gian ở đầu gần trong apoptosis gây ra bởi shock nhiệt. Vai trò của caspase 2 trong việc phát tín hiệu của thụ thể chết cũng mâu thuẫn. Caspase 2 được xử lý trong apoptosis do thụ thể chếtlàm trung gian. Có nghiên cứu báo cáo rằng sự hoạt hoá này được điều biến bởi caspase 3 và do đó quá trình xử lý capase 2 xảy ra sau sự hoạt hoá caspase 3. Trái ngược với những dữ liệu này, caspase 2 được cho là cần thiết đối với sự phân cắt Bid tối ưu được điều biến bởi thụ thể chết. Ngoài ra, người ta cũng báo cáo rằng caspase 3 được hoạt hoá tại DISC nhưng không đóng vai trò trong việc khởi phát apoptosis gây ra bởi thụ thể chết. Hình 13: phân tử calpain II. Có nhiều con đường mà thông qua chúng, apoptosis có thể được hoàn tất và thêm vào các caspases, chúng ta đã phát hoạ ra nhiều ví dụ về những cơ chế chất tác động thúc đẩy tiến trình apoptosis trong các tế bào đang chết. Nghiên cứu tăng cường suốt 15 năm qua về những proteases đặc biệt này cho ta thấy rằng caspase có vai trò như “bánh xe” và là chất tác hiệu đặc hiệu cho apoptosis. Ngày càng nhiều các chất được tìm ra, những cơ chế chất tác động mới bắt đầu được biết đến. Hiện tại thì những cơ chế mới độc lập với caspase này còn chờ thêm thời gian để hoàn thiện. Những vũ khí của tế bào đối với Apoptosis Hiểu chi tiết về con đường của sự chết tế bào là con đường tốt nhất để hiểu được cơ chế quan trọng trong chuyển hóa tế bào bình thường và trong các tế bào đangc chịu áp lực từ stress từ môi trường bên 14
ngoài.. Hình 14: sơ đồ hoạt hóa calpain lệ thuộc nồng độ calcium nội bào. Caspases Cơ chế chết được hoạt hóa bởi rất nhiều các tín hiệu trong đó trung tâm của các tín hiệu này là enzyme ly giải protein: caspase (cytenyl aspartatespecific protease). Dù apoptosis xảy ra theo cơ chế thì luôn có hiện tượng hoạt hóa những effector caspase chính yếu. Caspase có nhiệm vụ như binh đoàn kiếm mảnh của tế bào, có nhiệm vụ thực hiện các quá trình ly giải protein và tạo nên sự thay đổi ở kiểu hình (còn gọi là kiểu hình của apoptosis). Cấu trúc và sự hoạt hoá caspase Những caspases tạo thành một hệ thống dòng thác caspase đóng vai trò trung tâm trong việc tạo, truyền tính trạng và khuếch đại những tín hiệu nội bào của apoptosis trong quá trình xác định số phận tế bào, quá trình điều hoà miễn dịch và tăng sinh biệt hoá tế bào. Tính đến nay đã có 15 caspases của loài hữu nhũ được xác định. Chúng được chia thành 2 nhóm chính: (1) các caspase gây viêm (bao gồm các caspases 1, 4, 5, 11, 12, 13 và 14) và (2) các caspase liên quan đến apoptosis (bao gồm caspase 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10 và 15). Các caspases của apoptosis còn đươc chia nhỏ thành 2 nhóm nhỏ hơn là các caspases khởi phát và các caspases đao phủ. Caspase 2, 8, 9 và 10 kích hoạt apoptosis và được biết đến như là những caspases ngược dòng hay khởi phát. Chúng hoạt hoá các capases đao phủ hay xuôi dòng bao gồm caspases 3, 6, 7 và 15. Cuối cùng các caspase này sẽ thực hiện chết tế bào theo apoptosis. Các caspases sử dụng tiểu phân cysteinenhư là nucleophile xúc tác đểđiều hòa nghiêm ngặt việc phân cắt các cơ chất sau các các aspartic acid trong protein đích. Motif cấu trúc chính của chúng là một vùngchứa nhiều protease đồng đẳng cao phân tử. Vùng này có thể chia nhỏ hơn thành 2 tiểu đơn vị, một tiểu đơn vị lớn khoảng 20kDa và một tiểu đơn vị bé khoảng 10kDa. Các tiền caspases cũng chứa một tiền vùng hay peptide đầu tận là amino với độ dài thay đổi. Các caspase khởi phát apoptosis có những tiền vùng có ít hơn 100 amino acids, trong khi những tiền vùngs của effector caspases thường chỉ có ít hơn 30 amino acids. Những tiền vùng dài này chứa đựng một motif riêng biệt, đáng chú ý nhấtlà vùng chết (DD). DD là thành viên của họ thụ thể TNF và có 2 vùng nhỏ hơn: vùng tác hiệu chết (death effector domain, DED) và vùng tuyển lựa caspase (caspaserecuitment domain, CARD) có vai trò tuyển chọn các caspases cho màng bào tương trước khi hoạt hoá. Tiền caspase8 và 10 có2 DED sóng đôi trong tiền vùng của chúng. Trong số các caspases liên quan đến apoptosis, CARD được tìm thấy trong tiền caspase 2 và 9. DED và CARD bao gồm 67 vòng xoắn α bất đối xứng phân cực liên kết với những proteins khác bằng liên kết tĩnh điện hay liên kết kỵ nước. Thật vậy, tất cả caspases tồn tại trong tế bào dưới dạng zymogentiền chất tiềm ẩn không hoạt động hay proforms. Những kích thích nội bào và ngoại bào đặc biệt dẫn đến việc thành lập những phức hợp truyền tín hiệu gây ra cái chết (deathinducing signaling, DISC). Vùng DED và CARD có trách nhiệm lựa chọn những caspases khởi 15
phát vào các phức hợp này. Điều này tạo thuận lợi cho sự tự hoạt hoá ly giải protein của những caspase đỉnh. Sự hiện diện Asp ở vị tríphân cắt trưởng thành (maturation cleavage site)giúp cho các caspases tự hoạt hoá hay được hoạt hoá bởi những caspases khác, chúng có vai trò như mộtsự kiện xảy ra trong thác khuếch đại. Sau khi hoạt hoá, tiền vùng được phóng thích từ proenzyme nhờ việc cắt đứt kiên kết ApsX giữa protein này và tiểu đơn vị lớn. Tương tự đối với các tiểu đơn vị xúc tác lớn và nhỏ, p20 và p10 được tách ra thông qua sự phân cắt thứ hai tại liên kết AspX giữa hai vùng này. Các caspases với tiền vùng ít hơn 30 amino acid như caspase 3, 6 và 7 được hoạt hoá bởi quá trình ly giải protein do các caspases khác hoặc granzyme B. Caspases có tiền vùng ngắn chắc chắn cần được hoạt hoá trong khi caspase 9 và những caspase khác với tiền vùng dài có thể hoạt động ngay cả ở trạng thái không được hoạt hóa. Các caspase xúc tác trưởng thành có trong một tetramer gồm 2 tiểu đơn vị lớn và 2 tiểu đơn vị nhỏ là phức hợp heterodimer (p20, p10)2 và vì thế chúng có 2 vị trí hoạt động ở 2 đầu đối lập của phân tử. Cơ chất Các caspases gắn với cơ chất của chúng thông qua các liên kết của rãnh hoạt động với các motifs amino acid trong cơ chất riêng biệt của từng caspases hoặc từng nhóm caspase có liên hệ chặt chẽ với nhau. Những yếu tố chính quyết định đặc điểm của cơ chất được định vị bên trong tiểu đơn vị nhỏ và thông tin cụ thể về sự liên kết của các caspase với cơ chất của chúng hiện đã được xác định. Các caspase nhận ra các tetrapeptide (P4P3P2P1) motif trong cơ chất của chúng (ví dụ DEVD, YVAD, DEAD), cắt đứt liên kết giữa amino acidP1 và amino acid đầu tận C liền kề trong chuỗi peptide. Aspartate là rất cần cho các caspases tại vị trí P1; tuy nhiên chính phần tử này tại vị trí P4 mới là quan trọng nhất để xác định đặc điểm cơ chất của từng caspases. Nhưng đặc điểm của cơ chất là một lĩnh vực chưa được nghiên cứu kỹ ở nhiều loài. Sự xuất hiện phổ biến của những trình tự phù hợp với cơ chất chuyên biệt của caspases trong protein nội bào, sẽ cho thấy vô số (khoảng vài trăm) cơ chất trong cơ thể. Thật vậy,ngày càng có nhiều proteins được phân cắt bởi caspases trong cơ thể hay trong ống nghiệm được tìm thấy. Những nghiên cứu kết luận rằng các caspase cắt đứt những thành phần cấu trúc chính cũa bộ khung tế bào và nhân, cũng như nhiều protein liên quan đến những lột trình tính hiệu. Những cơ chất này được phân loại thành protein bào tương (actin, gelsolin, αfodin: spectrin không hồng cầu , adherin, thành phần kết nối βcatenin (junction components β catenin), plakoglobin, protein sợi trung gian keratin 18, rabaptin5: proteinhợp nhất thể nội bào, serpin: chất hoạt hoá ức chế plasminogen 2), các protein nhân (laminA, B; thụ thể lamin B, protein bộ máy nguyên phân nhân: NuMA, protein bám RNA và protein liên hệ với ribonucleoprotein, protein liên kết khung chromosome), protein chuyển hoá và sửa chữa DNA (PARP, DNAPKcs, protein sao chép DNA, DNAtopoisomerases, RNA- polymerase), protein kinases (PKC và các đồng phân của nó; MAPK, ERK, Akt, Wee1), protein lộ trình truyền tín hiệu (prointerleukin cytokines, phospholipases), protein chu kỳ tế bào và tăng sinh tế bào (p21, p27, pRB, proteins được gắn với ubiquitin), protein liên quan với bệnh di truyền người,các proteins liên quan với apoptosis khác. Rõ ràng là những cơ chất này đại diện cho một nhóm các proteins mà chỉ một subset tương đối nhỏ cơ chất caspase là “những kẻ ngoài cuộc vô tội (innocent bystander)” và sự ly giải chúng đóng góp rất nhỏ vào quá trình. Vì lý do này, hệ quả của nhiều sự kiện chia tách cơ chất diễn ra trong quá trình apoptosis vẫn là chủ đề nóng hiện nay. Ngoài ra, các bộ các caspases khác nhau được hoạt hoá cắt đứt những cơ chất khác nhau trong những tế bào khác nhau dựa trên hậu quả sinh lý khác nhau giữa các tế bào, các caspases và loại stress. Thật thú vị là các cơ chất caspase ở động vật có vú rất giống các cơ chất đặc trưng ở các 16
loài động vật có xương sống khác. Cơ chế điều hòa Vai trò then chốt của sự hoạt hoá caspase trong những sự kiện chết gần hết tế bào cho thấy nên có những cơ chế để phòng ngừa hay giảm thiểu sự hoạt hoá của chúng. Thật vậy, ở những tế bào bình thường, sự biểu hiện, xử lý, hoạt hoá và bất hoạt các caspases được điều khiển một cách chính xác bởi những cơ chế khác nhau bởi những chất ức chế hoặc chất hoạt hoá khác nhau. Ở những động vật có vú, sự điều hoà giải mã và sau dịch mã của những genes tiền caspase thay đổi tuỳ theo loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên, những nghiên cứu chi tiết vẫn còn rất ít. Ngược lại, sự điều hoà hoạt động của các caspases thì được nghiên cứu nhiều. Hoạt động của các caspases được điều hoà ở nhiều mức độ bao gồm ngăn chặn hoạt hoá caspases tại DISC cũng như ức chế hoạt động enzyme của caspase. Có ít nhất 3 loại chất điều hoà caspases khác nhau tên là IAPs, FLIP và calpain đã được xác định. Protein ức chế apoptosis (inhibitor of apoptosis proteins, IAPs) là họ của proteins tế bào được tìm thấy lần đầu trong các tế bào côn trùng bị nhiễm baculovirus. IAPs gồm có 8 thành viên được tìm thấy ở động vật có vú với những mô hình được bảo tồn cao và biểu hiện phân biệt trong các mô khác nhau. Ở người, đã có 6 IAP được xác định như NAIP (protein ức chế apoptosis trong tế bào thần kinh, c- IAP1/HIAP2, cIAP2/HIAP1, XIAP/hILP (protein liên kết với NST X ở động vật có vú, ức chế apoptosis), survivin và BRUCE (một protein màng ngoại vi được bảo tồn 528kDa của mạng lưới giữa các Golgi). Một đặc điểm của IAP là sự hiện diện của 13 bản sao vùng mới gồm 7080 amino acids được gọi là chuỗi lặp lại IAP baculovirus (baculovirus IAP repeat BIR), cho thấy một liên kết chặt với kẽm có thể bám vào bề mặt các caspases, ngăn chặn rãnh xúc tác của các enzymes này. Vài IAPs của động vật hữu nhũ không những có vùngs BIR mà còn có một cấu trúc dạng vòng ởđầu tận C liên quan đến hoạt động của ubiquitinligase. Vùng nối tiếp giữa vùngs BIR1 và BIR2 đích có chọn lọc hướng đến caspases 3 và 7, trong khi vùng BIR thứ 3 (BIR3) liên kết với caspase 9. Do đó IAPs ức chế chuyên biệt hoạt động của những caspase tác động 3 và 7 cũng như caspase khởi phát 9. IAPs không gắn hay ức chế caspase 8, nhưng chúng vẫn gắn và ức chế procaspase 3 là cơ chất của nó, vì vậy IAP có vai trò bảo vệ tế bào khỏi apoptosis gây ra bởi Fas/caspase 8. Trong lộ trình ty thể, sự bất hoạt caspase được điều hoà bởi XIAP, cIAP1 và cIAP2 gắn trực tiếp với procaspase 9, ức chế sự xử lý và hoạt hoá bởi cytochrome c. Sự biểu hiện quá mức của proteins IAP ức chế apoptosis gây ra bởi Bax và những protein tiền apoptosis thuộc họ Bcl2. Không phải tất cả protein chứa BIR đều là chất ức chế caspase hay apoptosis. Survivin chỉ chứa 1 vùng BIR có thể hoạt động như một chất điều hoà nguyên phân hơn là apoptosis. Hơn nữa, vùngs BIR cũng là những vị trí làm các protein của apoptosis ( như các protein xuất phát từ ty thể Smac/DIABLO và HtrA2/Omi) tập trung, tác động đối kháng lại chức năng chống apoptosis của IAPs. IAPs không phải là chất ức chế tự nhiên duy nhất của caspases, và FLIP, p35 của baculovirus, calpain, hay Ca2+ là những chất điều hoà khác. Protein FLIP là những đồng đẳng caspase không hoạt động có vị trí xúc tác của chúng bị làm hư hại và là những chất điều biến ưu thế âm của dòng thác caspase. Có 2 nhóm FLIP chính: FLIP của virus (vFLIP) được mã hoá bởi virus gamma herpes, và FLIP của loài có vú hay FLIP tế bào (cFLIP). Cả v và c FLIPs đều có 2 DEDs sóng đôi tại đầu tận N tạo thuận lợi cho việc tuyển chọn chúng cho DISC. Dưới điều kiệu biểu hiện quá mức, tất cả đồng phân ức chế sự hoạt hoá procaspase 8 tại DISC bằng cách ngăn chặn quá trình xử lý của chúng. Cùng lúc đó, tại DISC, nồng độ thấp của đồng phân cFLIP tạo thuận lợi cho sự cắt đứt procaspase 8 bằng cách tạo thành heterodimer với tiền caspase này. 17
Protein p53 của baculovirus là một chất ức chếcaspase, nó nhắm đến phần lớn caspases bằng cách tạo thành một phức hợp ức chế cùng với chúng. p35 của baculovirus là một chất ức chế hiệu quả caspase. Một chất ức chế pancaspase khác là serpin CrmA, có nguồn gốc từ virus đậu bò. Protein này liên kết hoá trị với trung tâm hoạt động của các caspases. Nó là chất ức chế mạnh caspase 1 và 8, và là một chất ức chế yếu caspase 3 và 6. Tuy nhiên, cơ chế mà những thành viên của họ caspase tác động lẫn nhau và tác động đến những factor tiền apoptosis và chống apoptosis khác vẫn còn chưa được biết rõ. Calpain là một dạng protease cyteine phụ thuộc Ca2+. Calpain và caspase 3 có chung nhiều cơ chất bao gồm fodrin, một protein kinase phụ thuộc Ca2+, và ADP ribosyltransferase/PARP. Trong cái chế tế bào gây ra bởi stress của lưới nội bào (ER), vai trò của calpain đặc biệt quan trọng vì cân bằng nội môi Ca2+ bị đảo lộn. Trong những tế bào não của chuột cống bị thiếu máu cục bộ một bên do giảm oxy, đầu tiên, mcalpain phân cắt procaspase 3 thành những phân đoạn 29kDa, tạo điều kiện cho sự phân cắt và hoạt hoá hơn nữa của nó. Cisplatin, một dạng tác nhân chống ung thư, có thể gây stress ER và apoptosis. Trong suốt quá trình này, sự hoạt hoá procaspase 12 bởi cisplatin phụ thuộc vào Ca2+ và calpain. Calpain cũng phân cắt BclxL để chuyển đổi một phân tử tiền apoptosis thành một phân tử chống apoptsis. Thụ thể chết Các thụ thể chết là những thụ thể cytokine ở bề mặt tế bào thuộc siêu yếu tố hoại tử khối u/ yếu tố tăng trưởng dây thần kinh (TNF/NGF). Những thụ thể này truyền các tín hiệu apotosis được khởi phát bởi các ligand chết (death ligand), hoạt hoá dòng thác caspase trong vài giây. Chúng là những protein xuyên màng với đuôi tận C nằm trong tế bào, khung màng tế bào, và một vùng đầu N ngoài tế bào gắn với ligand. Các thụ thể chết được đặc trưng bởi sự tương đồng đáng kể trong một vùng có chứa 1 đến 5 đoạn lặp lại giàu cysteine trong vùng ngoại bào của chúng, và trong chuỗi 6080 amino acids tế bào chất được gọi là vùng chết (DD), nó tuyển lựa các protein xuôi dòng apoptosis. Truyền tín hiệu bởi những thụ thể chết được khởi phát bởi sự trimer hoá thụ thể này, được kích hoạt khi các vùng nội bào kề nhau, theo sau sự tham gia của ligand đến vùng ngoại bào của thụ thể. Sự kiện này dẫn đến sự tuyển chọn những protein thích ứng khác nhau, cung cấp cầu nối giữa thụ thể của các caspase tác hiệu của tế bào(ví dụ caspase 8 và caspase 10). Các protein thích ứng (adapter protein) thường không có hoạt động enzyme của chính mình, nhưng có thể liên hệ với những thụ thể thông qua các liên kết với các kháng nguyên chuyên biệt của DD thụ thể và một DD tương tự trên chính protein thích ứng đó. Các proteins thích ứng có thể chứa một vùng tác động đến cái chết (death effector domain, DED) làm trung gian cho sự lựa chọn caspase thông qua kết hợp với một DED tương ứng trên vùng tuyển lựa caspase (CARD) trong tiền vùng của các caspase khởi phát không hoạt động. Phức hợp cuối cùng được gọi là phức hợp truyền tín hiệu gây chết (death inducing signaling complex, DISC). Sự gần nhau của một số phân tử caspase được tuyển chọn vào các thụ thể đưa đến quá trình tự xử lý và hoạt hoá caspase, thông qua hoạt động ly giải protein nhẹ của bản thân procaspase. Caspase khởi phát được hoạt hoá này sau đó khởi động một dòng thác hoạt hoá caspase bằng cách hoạt hoá các caspases tác động (ví dụ caspase 3, caspase 6 và caspase 7), trực tiếp hay gián tiếp chịu trách nhiệm cho sự thực hiện cái chết tế bào. Ngoài ra, caspase khởi phát có thể cắt ngững cơ chất khác gây ra sự huỷ hoại chức năng của ty thể (ví dụ sự phân cắt Bid), và hoạt hoá những caspase tác động thông qua việc phóng thích những yếu tố tiền apoptosis của ty thể. Sau khi tín hiệu apoptosis được kích hoạt, DISC được tiếp nhận ở nơi chúng phân tách (nơi có pH thấp). Vì vậy các thụ thể chết có thể hoạt động như những kíp nổ của những hộp thuốc nổ gắn vào màng bào tương và bùng nổ do những kết hợp chính xác các ligands chuyên biệt ngoại bào của chúng. 18
Hiện nay những thụ thể chết được mô tả bao gồm Fas (còn gọi là CD05, APO1), TNFR1 (còn gọi là p55, CD120a), DR3 (còn gọi là APO3, WSL1, TRAMP, LARD), DR4 (TRAILR1), DR5 (APO2, TRAILR2, chất huỷ diệt), và thụ thể chết 6 (DR6). Những dòng thác truyền tinthì hơi khác, nhưng người ta vẫn chưa hiểu rõ về những lộ trình phức tạp này. Cơ chế truyền tín hiệu của Fas Hình 15: Fas & Fas ligand và lộ trình tín hiệu của nó. Fas hay CD5 là một protein 4554 kDa được glycosyl hoá ở bề mặt tế bào và được tìm thấy ở rất nhiều mô khác nhau, đặc biệt có nhiều trong tuyến ức, gan, tim, thận và các tế bào lympho trưởng thành được hoạt hoá và những tế bào lympho bị virus biến đổi. Đa số Fas được tìm thấy ở dạng gắn với màng hơn là dạng hòa tan. Tác động chống apoptosis của những dạng thụ thể hoà tan này đã được xác định, nó có thể trung hòa tính gây độc tế bào qua trung gian Fasbằng cách gắn và bất hoạt Fas ligand (FasL). Hơn nữa, Fas ở trong bào chất, đặc biệt là trong bộ Golgi và mạng lưới giữa các Golgi với nhau.Quá trình chuyển những túi chứa Fas đến bề mặt tế bào đã được hiểu rõ. Đó một cơ chế hiệu quả để điều hoà mật độ màng bào tương của thụ thể chết và tránh sự hoạt hoá tự phát. Apoptosis qua trung gian Fas có thể cũng được điều biến bằng cách glycosyl hoá thụ thểnày hay ở mức độ dịch mã, quá trình được điều hòa bằng cách điều hoà trực tiếp sự biều hiện của nó. Một vị trí gắn cho yếu tố dịch mã NF κ B đã được xác định, và yếu tố đáp ứng với p53 cũng được định vị trong gene Fas. FasL là một protein 40kDa xuyên màng với cấu trúc homotrimer được biểu hiện trên bề mặt của những tế bào T được hoạt hoá vào tế bào diệt tự nhiên. Nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng nội môi tế bào T và B ngoại biên, và trong việc giết những tế bào gây hại như những tế bào bị nhiễm virus hay tế bào ung thư và giết những tế bào viêm tại những vị trí ưu tiên cho miễn dịch như mắt. Sự tham gia của Fas với ligand của nó (hoặc với kháng thể Fas đơn dòng) dẫn đến sự trimer hoá của thụ thể được theo sau bởi sự tuyển chọn phân tử thích ứng FADD (protein liên quan đến Fas với vùng chết). FADD là một protein nặng 28kDa trong bào chất được biểu hiện phổ biến với vùng chết ở đầu tận C và một DED tại đầu tận N. FADD liên hệ với thụ thể Das thông qua DD của nó, trong khi DED cần trong sự liên hệ của chính nó với procaspase 8. Sự tuyển chọn và tích luỹ procaspae 8 tại DISC dẫn đến sự hoạt hoá tự phát caspase này thông qua quá trình ly giải tự phân cắt và khởi phát tín hiệu apoptisis. Procaspase 10 cũng được tuyển lựa và hoạt hóa tại Fas DISC với động học tương tự như procaspase 8. Cả hai enzyme có thể khởi phát apoptosis độc lập lẫn nhau. 19
Hạ nguồn tín hiệu của sự hình thành DISC khác nhau giữa các loại tế bào. Trong những tế bào loại I, lượng lớn caspase 8 được hoạt hoá tại DISC và sau đó các caspase nàyđược phân cắt nhanh. Quá biểu hiện protein Bcl2 chống apoptosis hoặc BcxL không ngăn ngừa được sự hoạt hoá caspase 8 hoặc caspase 3 trong những tế bào này, và cũng không ức chế apoptosis. Điều này cho thấy sự hoạt hoá độc lập ty thể của dòng thác caspase. Ngược lại, thành lập DISC trong những tế bào loại II bị giảm thiểu mạnh và hoạt hoá caspases, bao gồm caspase 8, xảy ra chủ yếu ở hạ nguồn ty thể vì cả quá trình hoạt hoá caspase và apoptosis có thể bị ngăn chặn bởi sự biểu hiện quá mức Bcl2 hoặc BclxL. Đáng chú ý là Fas kích hoạt sự hoạt hoá ty thể ở cả loại tế bào I và II, và trong cả 2 loại, hoạt động sinh apoptosis của ty thể bị ngăn chặn bởi sự biểu hiện quá mức của Bcl2 hoặc BclxL. Tuy nhiên, chỉ trong tế bào loại II mà không phải trong tế bào loại I, sự biểu hiện quá mức Bcl2 hoặc BclxL ngăn apoptosis xảy ra. Vì vậy chỉ trong tế bào loại II, ty thể cần thiết cho sự thực hiện chương trình apoptosis, trong khi ở tế bào loại I, rối loạn chức năng ty thể có thể là sự khuếch đại tín hiệu apoptosis. Sự điều hoà tốt truyền tín hiệu Fas là cần thiết để tránh kích hoạt chết tế bào không cần thiết và để đảm bảo hoạt động chính xác của cỗ máy apoptosis. FLIP là những protein chứa DED, điều hoà apoptosis qua trung gian Fas. DED của FLIP gắn với phức hợp FasFADD và ức chế sự lựa chọn và hoạt hoá procaspase 8 qua đó đóng vai trò như là một phân tử chống apoptosis. Cơ chế truyền tín hiệu bằng yếu tố hoại tử u (TNF) Hệ thống truyền tín hiệu TNF/ thụ thể TNF gồm có 2 thụ thể khác nhau, TNFR1 và TNFR2, và 3 ligands: TNFα gắn với màng, TNFα hoà tan và TNFβ hoà tan có nguồn gốc từ tế bào lympho. TNF đều là những protein xuyên màng với những đặc tính cấu trúc tương tự nhau, bao gồm vùng ngoại bào đầu tận N giàu disulfur nhận ra TNF, một vòng xoắn xuyên màng và một đuôi trong tế bào chất. Tuy nhiên chỉ TNFR1 có DD nội bào (TNFR2 không có), và vì vậy nó có thể là một chất trung gian duy nhất của tín hiệu apoptosis trong hầu hết các loại tế bào, cũng như trong các nghiên cứu trong cơ thể con người(in vivo). Những tín hiệu nội bào xuất phát từ TNFR1 rất phức tạp và có thể dẫn đến những đáp ứng tế bào đa dạng, thậm chí là trái ngược từ quá trình tăng sinh tế bào đến quá trình viêm và cuối cùng đến chết tế bào. Hầu hết các tế bào đều được tiếp xúc với TNFα, tuy nhiên apoptosis xảy ra trừ phi protein tổng hợp RNA bị ngăn chặn. Điều này cho thấy ưu thế những tín hiệu sống còn cao hơn những tín hiệu chết trong điều kiện bình thường, và cần có sự tổng hợp protein mới để kềm lại kích thích apoptosis. Sự biểu hiện của những protein chống apoptosis này có thể được điều khiển bởi hoạt động của yếu tố dịch mã NFκB. Sự tham gia của TNFR1 bởi TNFα dẫn đến sự trimer hoá và những thay đồi hình dạng trong vùng nội bào của thụ thể, dẫn đến sự tuyển chọn nhanh va nhiều loại proteins thích ứng trong tế bào chất chứa DD, và một lần nữa thông qua liên kết phân cực với DD của thụ thể. TNFR1 không được kích thích liên kết với SODD (silencer of death domain) mới được phân lập, ngăn ngừa hiệu quả sự tự tổng hợp DD và khởi phát tự ý sự truyền tín hiệu. Khi được kích hoạt, SODD tách khỏi TNFR1 để protein thích ứng protein liên quan với TNF với vùng chết (TNFRassociated protein with death domain, TRADD) gắn với thụ thể DD bị gom lại. TRADD hoạt động như là một protein neo, lựa chọn nhiều phân tử truyền tin để hoạt hoá thụ thể như FADD, TRAF2 (yếu tố liên hệ TNF2), RIP (protein liên kết với thụ thể) và RAIDD (protein đồng đẳng ICH1/CED3 liên hệ RIP với vùng chết). Những protein này không có hoạt động enzyme, ngoại trừ RIP,enzyme này có hoạt tính serinethreonine kinase. Vai trò của kinase này trong apoptosis vẫn chưa được biết nhưng chúng có vai trò làm trung gian chết tế bào gây ra bởi thụ thể chết không phải apoptosis. FADD gắn và hoạt hoá caspase, thúc đẩy apoptosis thông qua 20