BÁO CÁO KHOA HỌC: "HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA Equus caballus ANGIOGENIN"

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:15

Thêm vào BST

Báo xấu

45
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Angiogenin là một trong những protein tham gia vào quá trình kích thích sự hình thành và phát triển mạch máu mới (angiogenesis). Trình tự amino axít của angiogenin ở người giống 80% so với angiogenin ở chuột lang (1), 75% với angiogenin chuột nhà, 73% với angiogenin thỏ, 66% với angiogenin lợn và 64% với angiogenin bò (2).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO KHOA HỌC: "HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA Equus caballus ANGIOGENIN"

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA Equus caballus ANGIOGENIN Nguyễn Hoài Giang Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương ĐẶT VẤN ĐỀ Angiogenin là một trong những protein tham gia vào quá trình kích thích sự hình thành và phát triển mạch máu mới (angiogenesis). Trình tự amino axít của angiogenin ở người giống 80% so với angiogenin ở chuột lang (1), 75% với angiogenin chuột nhà, 73% với angiogenin thỏ, 66% với angiogenin lợn và 64% với angiogenin bò (2). Cấu trúc của protein angiogenin được chia làm bốn vùng chính: (i) vùng 1 (trình tự FLxxHxDxxPxG) liên quan đến việc kìm hãm tổng hợp protein; (ii) vùng 2 (trình tự MxxRxxTxPCKxxNTF) liên quan đến quá trình di chuyển vào nhân của protein này; (iii) vùng 3 (trình tự NGxPxxxxxRxSxSxFQxTTC) có vai trò quan trọng trong
việc kích thích mạch máu phát triển và có vị trí bám cho actin; (iv) vùng 4 (trình tự GGSxxPPCxYxA) tham gia vào quá trình kìm hãm hình thành các tiểu phần của tế bào leukocyte (2). Những nghiên cứu trước đây đã chứng minh được rằng angiogenin có hoạt tính ribonuclease, có khả năng kích thích tế bào máu di chuyển, phân chia và khả năng kích thích mạch máu phát triển in vivo (2, 3, 4). Sử dụng phương pháp tách dòng phân tử của gen mới và thường qui để tinh sạch protein tái tổ hợp tương tự như ở angiogenin của chuột lang (1), tác giả đã thành công trong việc tìm ra gen mã hoá cho angiogenin ở ngựa (Equus caballus). Trình tự của gen này được lưu giữ tại ngân hàng dự liệu gen thế giới (Genbank) với số hiệu AY450362. Trong bài báo này, tác giả muốn giới thiệu các kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học của protein angiogenin tái tổ hợp này. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng: Protein tái tổ hợp angiogenin của ngựa đã được
tinh chế và các tế bào máu từ cuống rốn (Human Umbilical Vein Endothelial Cells - HUVE). Phương pháp nghiên cứu - Sử dụng điện di zymogram để xác định hoạt tính ribonuclease (4, 5). - Sử dụng Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit (Calbiochem) để phát hiện tế bào chết theo chương trình. - Sử dụng kỹ thuật Chorioallantoic Membrane (CAM) để phát hiện sự kích thích tạo mạch máu mới in vivo (6). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Hoạt tính ribonuclease của protein angiogenin Protein angiogenin có cấu trúc tương tự với RNase A và có khả năng cắt RNA, nên chúng được xếp vào nhóm các ribonuclease với hoạt tính sinh học đặc biệt (RISBASES).
Hoạt tính ribonuclease của angiogenin lại liên quan chặt chẽ đến khả năng kích thích mạch máu phát triển (angiogenesis) của protein này (2, 3). Do vậy, sau khi được tinh chế qua các cột SPsepharose, heparin và C18, angiogenin của ngựa được kiểm tra hoạt tính ribonuclease bằng kỹ thuật điện di zymogram với cơ chất là poly(C) (4, 5). Cũng tương tự như angiogenin của chuột lang, khi sử dụng 0,5 mg/ml poly(C) làm cơ chất, angiogenin của ngựa thể hiện hoạt tính ribonuclease rất rõ ở 2 µg (Hình 1). Trên gel SDS-PAGE với poly(C) làm cơ chất, angiogenin của ngựa còn tỏ ra có hoạt tính ribonuclease mạnh hơn so với angiogenin của chuột lang (thể hiện bằng khả năng phân cắt poly (C) khi so sánh giếng 1 và 2 của hình 1). Như vậy, cũng như các angiogenin khác (người, bò, chuột lang …) angiogenin của ngựa có hoạt tính ribonuclease.
Hình 1. Hoạt tính ribonuclease của angiogenin ở ngựa trên gel SDS-PAGE với cơ chất là poly(C). Giếng 1: Angiogenin chuột lang (2 µg) Giếng 2: Angiogenin ngựa (2 µg) 2. Angiogenin hạn chế số lượng tế bào máu từ cuống rốn (HUVECs) bị chết theo chương trình (apoptosis) Những nghiên cứu trước đây cho thấy trong môi trường (EGM 2) nuôi cấy tế bào máu từ cuống rốn (HUVECs) nếu
không được bổ sung các nhân tố sinh trưởng thì sau 48 giờ các tế bào này sẽ chuyển sang giai đoạn chết theo chương trình (apoptosis) (2). Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cũng cho thấy angiogenin của chuột lang có khả năng kích thích sự phân chia của tế bào máu (4). Do vậy, tác giả giả thuyết rằng angiogenin của ngựa có khả năng hạn chế các tế bào máu chết theo chương trình. Để kiểm chứng giả thuyết này, kit Annexin V-FITC Apoptosis Detection được sủ dụng để phát hiện số lượng tế bào máu ở giai đoạn chết theo chương trình trong trường hợp không hoặc có bổ xung angiogenin của ngựa vào môi trường nuôi cấy. Kết quả thí nghiệm cho thấy có 19,42% tế bào HUVE chuyển sang giai đoạn chết theo chương trình sau 48 giờ nuôi cấy ở môi trường EGM 2 khi không bổ sung các nhân tố sinh trưởng, so với 11,98% tế bào HUVE chuyển sang giai đoạn chết theo chương trình khi có 1 µg/ml angiogenin của ngựa trong môi trường môi cấy (Hình 2). Kết quả này cho thấy, đúng như giả thuyết đặt ra, angiogenin có khả năng hạn chế số lượng tế bào HUVE bị chết theo chương trình.
Hình 2. Angiogenin hạn chế các tế bào HUVE chết theo chương trình A. Đối chứng âm (môi trường nuôi cấy không bổ xung các nhân tố tăng trưởng, chỉ có PBS) B. Angiogenin của ngựa (ANG -1 mg/ml) được bổ sung trong nuôi trường nuôi cấy C. Đồ thị so sánh số lượng tế bào chết theo chương trình sau khi bổ xung PBS và angiogenin
3. Angiogenin kích thích sự hình thành mạch máu in vivo CAM (chorioallantoic membrane) là thí nhiệm được sử dụng rất phổ biến như một mô hình quan sát sự hình thành và kích thích mạch máu phát triển in vivo (6). Lần đầu tiên angiogenin của người được xác định tính chất cũng dựa trên khả năng kích thích hình thành các mạch máu mới trong thí nghiệm CAM này (7). Sau đó, angiogenin của bò, lợn và thỏ đều được thông báo có tính chất tương tự như angiogenin của người ở thí nghiệm CAM (2). Để kiểm tra khả năng kích thích sự hình thành và phát triển của mạch máu, angiogenin tái tổ hợp của ngựa sau tinh chế với các lượng khác nhau (62,5 đến 250 ng) được đem thử nghiệm với kỹ thuật CAM. Kết quả thí nghiệm cho thấy trong tổng số 31 trứng gà có đặt 62,5 ng angiogenin thì 9 trứng ( hay 29%) quan sát được hình thành và phát triển mạch máu mới hướng tới vị trí đặt mẫu. 13 trong tổng số 33 trứng (hay 38%) có đặt 125 ng angiogenin quan sát được hình thành và phát triển mạch máu mới tại vị trí đặt. 14 trong tổng số
30 trứng (hay 47%) có đặt 250 ng angiogenin quan sát được hình thành và phát triển mạch máu mới tại vị trí đặt, so với 4 trên tổng số 40 trứng (hay10%) sử dụng PBS như là đối chứng âm cũng quan sát được hiện tượng mạch máu như trên (Vùng có dấu mũi tên - Hình 3A và 3B). Như vậy, cũng giống như các angiogenin khác, angiogenin của ngựa có khả năng kích thích sự hình thành và phát triển của mạch máu in vivo. Ngoài ra, theo kết quả thu nhận được từ đồ thị (Hình 3C) thì sự kích thích này phụ thuộc vào nồng độ của angiogenin.
1: Đối chứng âm (PBS) 2: Angiogenin của ngựa 62.5 ng 3: Angiogenin của ngựa 125 ng 4: Angiogenin của ngựa 250 ng Hình 3. Angiogenin kích thích mạch máu hình thành và
phát triển trong thí nghiệm CAM. A. Đối chứng âm (PBS) B. Angiogenin của ngựa (125 ng) C. Đồ thị về sự hình thành và phát triển mạch máu mới và angiogenin của ngựa. KẾT LUẬN 1. Angiogenin của ngựa có hoạt tính ribonuclease. 2. Angiogenin của ngựa có khả năng hạn chế số lượng tế bào máu từ cuống rốn (Human Umbilical Vein Endothelial Cells - HUVECs) bị chết theo chương trình. 3. Angiogenin của ngựa có khả năng kích thích hình thành mạch máu mới in vivo. Lời cảm ơn The author thanks Professor Chang Soo-Ik (Chungbuk National University, Korea) for his support.
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyen Hoai Giang. (2005). Characterization of Rattus norvegicus Angiogenin. Ph.D dissertation. Chungbuk National University, Korea. 2. Riordan, J. F. (1997). Structure and function of angiogenin. In: Ribonucleases: Structures and Functions, D’Alessio G. and Riordan J. F. (eds), pp. 445-489, Academic Press, New York. 3. Shapiro, R., Riordan J. F., and Vallee B. L. (1986). Characteristic ribonucleolytic activity of human angiogenin. Biochemistry. 25: 3527-3532. 4. Nguyễn Hoài Giang, Nguyễn Hạnh Phúc. (2004). Xác định hoạt tính sinh học của protein mã hoá bởi gen angiogenin từ Rattus norvegicus. Tạp chí Di truyền học và ứng dụng. 4: 56-59. 5. Leland, P. A., Staniszewski, K. E., Park, C., Kelemen, B. R., and Raines, R. T. (2002). The ribonucleolytic activity of angiogenin. Biochemistry. 41: 1343-1350. 6. Nguyen, M., Shing, Y., and Folkman, J. (1994).
Quantitation of angiogenesis and antiangiogenesis in the chick embryo chorioallantoic membrane. Microvasc. Res. 47: 31-40. 7. Fett, J. W., Strydom, D. J., Lobb, R. R., Alderman E. M., Bethune, J. L., Riordan,J. F., and Vallee, B. L. (1985). Isolation and characterization of angiogenin, an angiogenic protein from human carcinoma cells. Biochemistry 24: 5486-5494. SUMMARY Bioactivities of Equus caballus Angiogenin Angiogenin is a powerful angiogenic protein, which involves in angiogenesis process. The human angiogenin shares 80, 75, 73, 66 and 64% sequence identity to rat, mouse, rabbit, pig and bovine angiogenins, respectively. The angiogenin can be divided into 4 regions: region 1 with a main consensus sequence FLxxHxDxxPxG; region 2 with a main consensus sequence MxxRxxTxPCKxxNTF; region 3 with a main consensus sequence
NGxPxxxxxRxSxSxFQxTTC and region 4 with a main consensus sequence GGSxxPPCxYxA (region 4). The region 1 involves in the inhibition of cell-free protein synthesis. The region 2 associates with a nuclear translocation. The region 3 plays an essential role in angiogenesis and the actin-binding site. The region 4 takes a part in the inhibition of degranulation of polymorphonuclear leukocytes. The ribonucleolitytic activity of angiogenin is important for its angiogenic functions. Angiogenin can induce the prolifelation, migration of endothelial cells. Angiogenin can also promote the formation of new blood vessel in vivo. Using the similar methods for obtaining, expression and purification of a new rat angiogenin, the author successed getting a novel Equus caballus angiogenin cDNA (GenBank with accession number AY450362). The purified recombinant horse angiogenin was confirmed to have a ribonucleolytic activity toward poly(C) by zymogram assay. Moreover, horse angiogenin could recover the HUVECs from apoptosis. Finally, horse
angiogenin could induce the formation of new blood vessels in vivo by chorioallantoic membrane (CAM) assay and it was in a dose dependent manner. Người thẩm định nội dung khoa học : GS.TS. Lê Đình Lương