BÁO CÁO KHOA HỌC: "TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN 16S ARNR CỦA VI KHUẨN LAM ANABAENA AZOTICA"

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:17

Thêm vào BST

Báo xấu

92
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Vi khuẩn lam là sinh vật quang dưỡng, có khả năng sử dụng ánh sáng để đồng hoá cacbon và cố định nitơ phân tử từ khí quyển giúp cải tạo đất trồng trọt (2). Một số loài vi khuẩn lam còn có thể được sử dụng làm thức ăn, làm thuốc và chế tạo mỹ phẩm (8).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO KHOA HỌC: "TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN 16S ARNR CỦA VI KHUẨN LAM ANABAENA AZOTICA"

TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN 16S ARNR CỦA VI KHUẨN LAM ANABAENA AZOTICA Lê Quang Huấn, Hoàng Phương Hà, Trần Văn Nhị Viện Công nghệ Sinh học 1. GIỚI THIỆU CHUNG Vi khuẩn lam là sinh vật quang dưỡng, có khả năng sử dụng ánh sáng để đồng hoá cacbon và cố định nitơ phân tử từ khí quyển giúp cải tạo đất trồng trọt (2). Một số loài vi khuẩn lam còn có thể được sử dụng làm thức ăn, làm thuốc và chế tạo mỹ phẩm (8). Những nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn lam là một nguồn nguyên liệu phong phú về các chất có hoạt tính sinh học: các peptid, alcaloid, phicobilinprotein với các hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng u...(4, 5). Nhiều loại vi khuẩn lam đã được nghiên cứu để sử dụng làm phân đạm vi sinh ở ấn Độ, Trung Quốc và ở Việt Nam (2, 9) . Chính vì vậy, vi khuẩn
lam ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu rộng rãi của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới. Trong các nghiên cứu, việc phân loại có ý nghĩa rất quan trọng làm nền tảng cho những nghiên cứu tiếp theo. Phương pháp phân loại truyền thống dựa vào đặc điểm hình thái và các đặc điểm sinh hoá do Stanier năm1977 (7) và Rippka năm 1979 (6) đề xướng đã đóng vai trò rất quan trọng. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp hiện tượng thường biến gây nên những nhầm lẫn trong phân loại. Những hạn chế này chỉ có thể được giải quyết khi sử dụng phương pháp phân loại phân tử, dựa vào việc phân tích trình tự gen 16S ARNr. Trình tự nucleotit của gen này hầu như không có sự trao đổi giữa các loài (3), do vậy trình tự 16S ARNr có ý nghĩa đặc trưng cho loài. Trong công trình này chúng tôi trình bầy những kết quả phân loại chủng vi khuẩn lam Anabaena azotica dựa vào trình tự đoạn gen 16S ARNr. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu Chủng vi khuẩn lam Anabaena azotica sử dụng trong • nghiên cứu này được lấy từ tập đoàn vi khuẩn lam của Phòng Quang Sinh, Viện Công nghệ Sinh học. Vectơ tách dòng được sử dụng là Vectơ pCR 2.1 (Invitrogen). Các hoá chất sử dụng trong thí nghiệm đều là những • hoá chất tinh khiết được sử dụng trong các phòng thí nghiệm về sinh học phân tử (hoá chất của các hãng Sigma, Invitrogen, Merck...). Phương pháp Phương pháp tách ADN tổng số của vi khuẩn, ADN • plasmit được tiến hành theo phương pháp của Knut Rudi và cs (1). Phương pháp nhân bản đoạn gen 16S ARNr của chủng • Anabaena azotica được tiến hành với cặp mồi:
NostF:5'-gcttaacacatgcaagtcgaacgg-3' và NostR:5'-cagcctgcgatctgactgagc-3' Phản ứng nhân bản (PCR) có chu trình nhiệt như sau: • 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết ADN tổng số vi khuẩn lam ADN tổng số của vi khuẩn lam Anabaena azotica được tách theo phương pháp của Knut Rudi và cs (1). Kết quả tách chiết ADN tổng số được kiểm tra trên gel agarose 0,8% và được trình bày trên hình 1. Qua ảnh chụp kết quả điện di (máy chụp ảnh điện di (GEL-
DOC) cho thấy ADN tách chiết theo phương pháp mà chúng tôi đã trình bày (phần phương pháp) có độ tinh sạch cao (băng ADN khá rõ) có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Hình 1: Kết quả điện di mẫu ADN tách từ vi khuẩn lam trên gel agaroza 0,8% Kênh 1: Mẫu ADN tách từ chủng vi khuẩn lam Anabaena azotica Kênh 2: Mẫu ADN tách từ chủng vi khuẩn lam số 6 (chưa xác định tên) 3.2. Nhân bản đoạn gen 16S ARNr Để phân lập và tách đoạn gen 16S ARNr vi khuẩn lam
chúng tôi đã thiết kết cặp mồi NOSTF/NOSTR (xem phần phương pháp) dựa vào trình tự gen 16S ARNr của các chủng vi khuẩn lam đã được công bố trong ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế. Thành phần phản ứng PCR ngoài các thành phần cơ bản như ADN khuôn, cặp mồi NOSTF/NOSTR, Taq ADN- polymeraza, dNTP còn có muối MgCl2 (Phần phương pháp). Vì sử dụng ADN tổng số làm khuôn, cho nên để tạo điều kiện thuận lợi cho việc duỗi xoắn chuỗi ADN kép và không làm mất hoạt tính của enzym Taq ADN-polymeraza, chúng tôi tiến hành biến tính ADN trước khi bổ sung enzym Taq ADN-polymeraza. Quy trình biến tính được tiến hành như sau: Bổ sung đầy đủ các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR (ngoại trừ Taq ADN-polymeraza), ống phản ứng được để trên bể nhiệt 94 0C thời gian 4 phút, sau đó bổ sung Taq polymeraza và phản ứng PCR được tiến hành theo chu kỳ nhiệt như sau: (94oC 50 giây, 52oC 50 giây, 72oC 1 phút 30 giây ) /30 chu kỳ; 72oC 8 phút
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 1 %. Kết quả được trình bầy trên hình 2. Hình 2: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR Kênh 1: Sản phẩm PCR chủng Anabaena azotica Kênh 2: Sản phẩm PCR chủng vi khuẩn lam số 6 (chưa xác định tên) Kênh 3: Chỉ thị phân tử ADN Qua kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agaroza 1%, ta thấy một băng ADN rất rõ nét có kích thước khoảng trên 1000bp. 3.3. Tách dòng sản phẩm PCR Để tách dòng và xác định trình tự đoạn gen nhận được sau
phản ứng PCR, chúng tôi sử dụng vectơ pCR2.1 (Invitrogen). Sản phẩm PCR không cần phải qua một bước tinh chế nào mà được sử dụng trực tiếp cho phản ứng gắn với vectơ. Sau đó được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH-5 để chọn cácplasmit tái tổ hợp. Sau khi thực hiện quá trình biến nạp, các tế bào vi khuẩn E. coli chứa vectơ tái tổ hợp được cấy trải trên môi trường thạch LB có bổ sung ampicillin, IPTG, X-gal. Trong môi trường chọn lọc này, theo lý thuyết thì các khuẩn lạc E. coli mang vectơ tái tổ hợp sẽ có màu trắng trong khi đó các khuẩn lạc mang vector pCR 2.1 gốc (không đính thêm đoạn ADN ngoại lai) sẽ có màu xanh. Kết quả biến nạp và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc cho phép chúng tôi chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc mầu trắng. 3.4. Chọn lọc các dòng mang plasmit tái tổ hợp Chúng tôi nhặt ngẫu nhiên 12 khuẩn lạc mầu trắng trên đĩa thạch nuôi cấy chọn lọc và cấy mỗi khuẩn lạc vào 2 ml môi trường LB lỏng có bổ sung chất kháng sinh Ampicillin
(nồng độ 100 g/ml). Lắc qua đêm ở nhiệt độ 370C, 200 vòng/phút. Kết quả tách chiết ADN plasmit trình bày trên hình 3. Hình 3: Điện di ADN plasmit trên gel agaroza 1% Kênh 1-12 là các mẫu ADN plasmit của các khuẩn lạc riêng biệt. Sản phẩm PCR được gắn vào vectơ pCR2.1 theo liên kết T-A giữa hai vị trí cắt của enzym cắt hạn chế E.coR I, vì vậy để khẳng định chắc chắn đoạn ADN, sản phẩm PCR, đã gắn vào vectơ vectơ pCR2.1, ADN plasmit nhận được cắt với enzym cắt hạn chế E.coR I sau đó kiểm tra bằng điện di trên gen agaroza. Kết quả kiểm tra việc cắt ADN plasmit bằng enzym EcoR I được trình bày trên hình 4.
Hình 4: Điện di kiểm tra ADN plasmit tái tổ hợp sau khi xử lý với EcoR I. Kênh 1-5: Sản phẩm cắt ADN plasmit tái tổ hợp bằng enzym EcoR I Kênh 6: Chỉ thi phân tử ADN. Từ ảnh điện di ở hình 4 ta thấy mẫu ADN plasmit sau khi xử lý với enzym EcoR I đều xuất hiện một băng mới có kích thước tương đương với kích thước của sản phẩm PCR đã nhận được. Điều này cho phép ta khẳng định sản phẩm PCR đã đưgợc gắn vào vectơ pCR2.1. 3.5. Kết quả xác định trình tự đoạn gen 16S ARNr Sau khi tách dòng đoạn gen 16S ARNr của chủng Abaena azotica được xác định trình tự, kết quả như sau:
3.6. Thảo luận Như đã trình bầy ở phần trên việc xác định trình tự một phần hoặc toàn bộ gen 16S ARNr là một bằng chứng khoa học góp phần phân loại các loài một cách chính xác hơn, đặc biệt đối với những trường hợp phức tạp khi sử dụng các phương pháp phân loại truyền thống. Trình tự đoạn gen 16S ARN ribosom của chủng vi khuẩn lam Anabaena azotica mà chúng tôi đã tách dòng có chiều dài 1215 bp đã được so sánh với trình tự gen 16S ARNr của
các chủng vi khuẩn lam trong khác trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế bằng chương trình phần mềm PC/gene. Từ kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S ARNr của các chủng vi khuẩn lam chúng tôi đã xây dựng được cây phát sinh chủng loại, kết quả được nêu ở hình 5. Chủng vi khuẩn lam sử dụng trong thí nghiệm này được xác định là Anabaena azotica theo phương pháp phân loại truyền thống. Mặt khác, trong ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế chưa có trình tự gen 16S ARNr của chủng Anabaena azotica. Như vậy, trình tự đoạn gen 16S ARNr của vi khuẩn lam Anabaena azotica lần đầu tiên đã được chúng
tôi xác định và công bố. Số đăng ký của trình tự này trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế là: AJ488603 4. KẾT LUẬN Đã tách dòng được đoạn gen 16S ARNr của chủng 1. Anabaena azotica. Trình tự đoạn gen 16S ARNr của chủng Anabaena azotica mà chúng tôi tách dòng được có kích thước là 1215 bp. Đã so sánh, xác định vị trí phân loại của chủng 2. Anabaena azotica so với một số chủng vi khuẩn lam khác dựa trên trình tự gen 16S ARNr TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Knut Rudi, Olav M. Skulberg, Randi Skulberg and K.S. Jackobsen, 2000, Application of Sequence-Specific Labeled 16S rRNA Gen Oligonucleotide Probes for Gentic Profiling of Cyanobacterial Abundance and Diversity by Array Hybridization, App. Environ. Microbiol. Vol.66 (9),
p. 4004-4011. 2. Li Shang Hao, 1981, Role of N2-fixing blue-green algae in rice cultivation in China, In Current perpectives in nitrogen fixation add. Gibson A.H., Newton W.E., Australia Acad.Sci. Canbena (Aushalion), p.500. 3. Pace NR, Olsen GJ and Woese CR (1986) Ribosomal RNA phylogeny and the primary lines of evolutionary descent. Cell 45: 325-326 4. Patterson, G. M. L., Baker, K. K., Baldwin, C. L., Bolis, C. M., Caplan, F. R., Larsen, L. K., Levine, I. A., Moore, R. E., Nelson, C. S., Tschappat, K. D., Tuang, G. D., Boyd, M. R., Cardellina II, J. H., Collins, R. P., Gustafson, K. R., Snader, K. M., Weislow, O. S. & Lewin, R. A. (1993). Antiviral activity of cultured blue-green algae (Cyanophyta) J Phycol 29, 125-130. 5. Patterson, G. M. L., Larsen, L. K. & Moore, R. E. (1994). Bioactive natural products from blue-green algae. J Appl Phycol 6, 151-157. 6. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdmann, M. and Stanier, Y. 1979. Genric assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria.
Journal of Genral Microbiology 111:1-61 7. Stanier, R. Y., Sistrom, W. R., Hansen, T. A., Whitton, B. A., Castenholz, R. W., Pfennig, N., Gorlenko, V.N., Kondratieva, E. N., Eimhjellen, K. E., Whittenbury, R., Gherna, R. L. and Truper, H. G. 1978. Proposal to place the nomenclature of the cyanobacteria (blue-green algae) under the rules of the International Code of Nomenclature of Bacteria. Int. J. Syst. Bacter. 28:335-336. Tiến D. Đ. Phân loại vi khuẩn lam ở Việt nam NXB 8. Nông ngiệp, Hà nội 1996. tr. 251 9. Tran Van Nhi, 1990, Study on physio-biochemistry of free-living blue-green algae for rice production in Vietnam, Dr. Sci. Thethis, Moscow, p.417. (Rus). SUMMARY Cloning and sequencing of 16S rRNA of cyanobacteria Anabaena azotica, collected from Hanoi Vietnam Le Quang Huan et al.
Institute of Biotechnology Cyanobacteria (formerly known as blue-green algae) are an ancient group of prokaryotes and are unique in being capable of both oxygenic photosynthesis and N2 fixation. A number of research works on nitrogen fixation have been carried out in free-living and symbiotic cyanobacteria. Most laboratories deal with microbial model such as heterocystous Anabaena spp. or with natural populations of free-living cyanobacteria such as Gloeothece, Nostoc, Oscillatoria, Trichodesmium, Nodularia and Calothrix. The gentical aspects to the ecological contribution of nitrogen- fixing cyanobacteria such as regulation, diversity, signal transduction and the involvment of specific gens and proteinsbeen considerably interested. However, the technology required is in its infancy so this research may be classified as fundamental, with extensive application likely to be years away. With traditional taxonomy, the molecular taxonomy has been widely used to study on taxonomy of cyanobacteria. Here, we report the
using of 16S rRNA gene of cyanobacteria in classify our cyanobacteria collections. Recently, fragment of gene 16S rRNA of Anabaena azotica obtained by PCR having 1215 base in length was sequenced. This sequence has been submitted into EMBL Gene Bank Database with Accession#: AJ488603. The phylogenetic tree has been also constructed on the base of the sequenced 16S rRNA gene fragment. Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Đinh Duy Kháng.