Báo cáo: Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp Enzym glucose oxidaza (god) và ứng dụng trong công nghiệp chế biến một số sản phẩm từ quả nhằm đảm bảo ổn định chất lượng chống biến màu, hạn chế mất mùi sản phẩm

Chia sẻ: Nguyen Khanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:153

Thêm vào BST

Báo xấu

237
lượt xem 48
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Báo cáo: Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp enzym glucose oxidaza (god) và ứng dụng trong công nghiệp chế biến một số sản phẩm từ quả nhằm đảm bảo ổn định chất lượng chống biến màu, hạn chế mất mùi sản phẩm. Mời các bạn cùng tham khảo bài báo cáo dưới đây.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo: Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp Enzym glucose oxidaza (god) và ứng dụng trong công nghiệp chế biến một số sản phẩm từ quả nhằm đảm bảo ổn định chất lượng chống biến màu, hạn chế mất mùi sản phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH TỔNG HỢP ENZYM GLUCOSE OXIDAZA (GOD) VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP CHẾ BIẾN MỘT SỐ SẢN PHẨM TỪ QUẢ NHẰM ĐẢM BẢO ỔN ĐỊNH CHẤT LƯỢNG CHỐNG BIẾN MÀU, HẠN CHẾ MẤT MÙI SẢN PHẨM Chủ nhiệm đề tài: THS. TRẦN THỊ CHÂU 7860 08/4/2010 HÀ NỘI – 2010
MỞ ĐẦU Glucooxydaza (GOD) – một trong những enzym oxy hóa khử, được sử dụng khá rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và chuẩn đoán trong y học. Chúng xúc tác một cách đặc hiệu cho phản ứng giữa glucoza với oxy. Glucoza bị oxi hóa thành axit gluconic và oxy được tiêu thụ. Vì thế, GOD có thể được ứng dụng để lọai bỏ oxy và để định tính và định lượng glucoza. Enzym GOD còn được gọi là β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase hay EC 1.1.3.4. Trong tự nhiên enzym GOD được tìm thấy trong các mô động vật, thận, gan trong canh trường của nấm mốc, nhất là các loài A. niger, P. amagasakiense, P. chrysogenum, P. vitale, P. notatum và một số loài Penicillium khác [1]; [12]; [30]. Enzym GOD được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: Công nghiệp thực phẩm, trong y học và trong phân tích. Trong công nghiệp thực phẩm GOD được sử dụng như một chất bảo quản không độc, có nguồn gốc tự nhiên và an toàn (để loại bỏ glucoza và oxy khỏi thực phẩm và đồ uống) như: Bảo quản dịch ép các loại quả nhiệt đới, bảo quản rượu vang. Đồng thời, enzym GOD còn được dùng để loại bỏ glucoza khỏi lòng trắng trứng trước khi sấy khô làm nguyên liệu để sản xuất bánh ngọt [64]; [65];[66];[70]. Trong y học GOD được sử dụng để xác định hàm lượng glucoza trong dịch của cơ thể (xác định hàm lượng glucoza trong máu hoặc nước tiểu của các bệnh nhân tiểu đường). Ngoài ra enzym GOD còn được dùng để đánh dấu các kháng thể và để phát hiện các kháng thể đánh dấu của khối u và các kháng thể của virut. Trong phân tích, enzym GOD được sử dụng rộng rãi để sản xuất các KIT thử sinh học nhằm xác định hàm lượng glucoza có trong mẫu [9]; [88];[90]. GOD có thể được tổng hợp bằng phương pháp lên men chìm từ nguồn cacbon là glucoza, saccaroza, tinh bột và một số chất dinh dưỡng với sự có mặt của oxy bởi các chủng nấm mốc hoặc nấm men [1]; [11];[13]. Ở Việt nam, cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu về GOD nào được công bố. Do vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp enzym GOD ứng dụng trong bảo quản các sản phẩm thực phẩm sẽ rất có ý nghĩa, nó mở ra một triển vọng mới trong việc thay thế các chất bảo quản có nguồn gốc hóa học, góp phần nâng cao chất lượng thực phẩm, đảm bảo vệ sinh an toàn cho người tiêu dùng. Mục đích của nghiên cứu. Quá trình sinh tổng hợp GOD bằng chủng A. niger sẽ được nghiên cứu ở ba mức độ khác nhau: Nuôi lắc trong bình tam giác, trong bình lên men 5 lít và qui mô pilot. Nghiên cứu tập trung vào những nhiệm vụ sau: 1
1. Lựa chọn chủng giống - Lựa chọn chủng giống A. niger. - Nghiên cứu đặc điểm hình thái. - Kiểm tra độ an toàn của chủng giống (dựa trên kết quả kiểm tra độc tố aflatoxin B1,B2,G1,G2). - Định tên chủng giống chọn lựa 2. Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp enzym GOD - Xác định ảnh hưởng của các ion kim loại đến quá trình sinh tổng hợp enzym (Sắt, đồng, kẽm, mangan, coban v.v). - Xác định thành phần môi trường sinh tổng hợp enzym (các bon, nitơ, khoáng, chất có hoạt tính bề mặt tween 80, EDTA v.v.) - Xác định điều kiện nuôi cấy để sinh tổng hợp enzym GOD (pH, nhiệt độ, tốc độ đảo trộn môi trường v.v). - Nghiên cứu động học của quá trình sinh tổng hợp GOD. - Sản xuất thử nghiệm enzim GOD quy mô xưởng thực nghiệm 3. Thu nhận, tinh sạch enzym và xác định đặc tính của chế phẩm - Lựa chọn phương pháp phá vỡ tế bào - Thu nhận và tinh sạch enzym. - Nghiên cứu đặc tính của enzym GOD sinh tổng hợp được 4. Nghiên cứu đặc tính sinh hóa và độ an toàn của chế phẩm enzym 5. Nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp trong quá trình sử dụng enzym GOD trong chế biến quả quy mô phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm (nước quả và rượu vang) 6. Nghiên cứu áp dụng thử nghiệm GOD trong công nghiệp chế biến nước quả và rượu vang 2
CHƯƠNG I TỔNG QUAN I. GIỚI THIỆU VỀ ENZYM GOD I.1 Lịch sử phát hiện enzym GOD Enzym GOD (GOD) là một enzym chống oxi hóa được sinh tổng hợp từ những năm 1950. Năm 1904, Maximow đã phát hiện ra một hệ thống enzym tiêu thụ oxy trong dịch chiết nấm mốc. Năm 1926, D.Mueller đã xác định lại hệ thống này và ông ta đặt tên cho enzym này là glonga oxidaza. GOD được chiết tách lần đầu tiên từ hệ sợi nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium glaucum do nhà khoa học Muller (năm 1928). Kể từ sau lần đầu được phát hiện và tách chiết nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu enzym GOD. Năm 1946, Keilin và Haitree chứng minh rằng GOD là một flavinprotein với một nhóm ngoại (prosthetic) FAD và có đặc tính kháng khuẩn “antibiotic" (do tạo thành hydro peroxit H2O2) [9]. Tiếp theo là báo cáo của Keston năm 1956 về cặp phản ứng giữa GOD, peroxidaza và một chất tạo mầu. Trên nguyên tắc này “que nhúng” định lượng glucoza đã xuất hiện để xác định hàm lượng glucoza trong nước tiểu. Cũng trong năm 1956, dựa trên bài báo của Teller, Worthington lần đầu tiên đã đưa ra hệ thống enzym định lượng để xác định hàm lượng glucoza bằng phương pháp so mầu. Các chủng nấm mốc Aspergillus niger, Penicillium glaucum và nấm men Saccharomyces cerevisiae là nguồn vi sinh vật có khả năng sản xuất ra GOD tốt nhất. Enzym GOD thu được dưới dạng enzym nội bào (Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae) hay ngoại bào (Penicillium glaucum) được làm sạch với các mức độ khác nhau, tùy theo mục đích sử dụng. Enzym GOD tinh sạch đã loại bỏ các polysaccharit tạp này đã được giới thiệu cho mục đích bảo quản thực phẩm, y học chuẩn đoán và phân tích. I. 2. Cấu tạo của enzym GOD Cũng giống như mọi enzym khác GOD có bản chất là protein.. GOD là một protein có cấu trúc đối xứng, gồm hai monomer giống nhau có trọng lượng phân tử vào khoảng 80,000 daltons, liên kết đồng hóa trị với nhau nhờ các cầu nối disulfit. 3
Trọng lượng phân tử của enzym GOD khoảng 160.000 dalton. Kích thước phân tử của GOD thu nhận từ các nguồn khác nhau là khác nhau (khối lượng phân tử GOD thu được từ Aspergillus niger là 186.000 Da. từ Penicillium notatum là 152.000 Da) [39]. Để có thể làm việc như một chất xúc tác, mỗi một monomer của GOD cần một nhân tố phụ trợ là FAD (flavin adenine dinucleotide). Trong phản ứng oxy hóa khử do enzym GOD xúc tác, FAD đóng vai trò như chất nhận điện tử ban đầu và khử thành FADH2 sau đó FADH2 được oxy hóa bởi chất nhận điện tử cuối cùng là một phân tử oxy (O2) vì oxy có thế oxy hóa khử cao hơn. Sau đó oxy được khử thành hydro peroxit (H2O2). FAD được gắn với protein bởi liên kết không đồng hóa trị và có thể bị giải phóng khỏi cấu trúc protein khi bị biến tính. Enzym GOD được gắn với 16% (w/w) hydratcacbon. 80% (w/w) hydratcacbon là mannoza. Đường mannoza có thành phần nitơ và oxy liên kết với các axit amin: Arginin, threonin và serin. Mạch hydratcacbon trong phân tử GOD không tham gia vai trò xúc tác của phản ứng enzym và cấu tạo của nó cho tới nay vẫn chưa được xác định rõ ràng [23]. Enzym GOD được sinh tổng hợp từ A. niger có cấu tạo bởi 583 axit amin. Enzym GOD có tính đặc hiệu rất cao. Một thay đổi nhỏ trong cấu trúc đã có tác động lớn tới hoạt lực oxy hoá của enzym. Gốc glucoza trong phân tử của enzym ở dạng β- D- glucoza có hoạt tính oxy hoá mạnh hơn α- D- glucoza 157 lần [39]. Hình 1.1. Cấu trúc không Hình 1.2. Cấu trúc tiểu đơn gian ba chiều của GOD vị của GOD (mầu đỏ là FAD) 4
I.3. Tính chất của enzym GOD [8];[39];[92] Tính chất vật lý - Phân tử protein tan dễ dàng trong dung dịch potassium phosphate 0.1M, pH 7.0 cho dung dịch mầu vàng, trong suốt. Hệ số phân li của dung dịch GOD 1% (w/v) ở bước sóng 280 nm là 13.8. - Enzym thể hiện mức độ chuyên hóa rất cao đối với β-D glucoza mặc dầu 2- deoxy-D-glucoza, D-mannoza và D-fructoza cũng bị oxy hóa. - Protein của bản thân enzym là có tính axit và có điểm đẳng điện (pI) là 4.2. pH tối ưu - pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzym và độ bền của protein enzym. Đa số các enzym đều bền trong giới hạn pH từ 5- 9. Độ bền của enzym đối với môi trường cũng có thể tăng lên khi có cơ chất coenzym và ion Ca++. - pH tối thích (pHopt) cho hoạt động của GOD thu được từ các nguồn khác nhau là khác nhau. Giá trị pH không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ v.v. pH thích hợp cho hoạt động của GOD vi sinh vật trong khoảng 4 –7, tối ưu nhất là 5.6. Tính đặc hiệu Enzym có đặc tính chuyên hóa cao đối với β-D-glucoza. Với đồng phân α -D- glucoza enzym không có tác dụng. Với các cơ chất như 2-deoxy-D-glucoza, D- mannoza và D-galactoza enzym GOD thể hiện hoạt tính rất thấp. Các chất ức chế - Ức chế bởi: D- arabinoza và 2- deoxy-D-glucoza. - Ức chế hoàn toàn bởi: ρ- cloromercuribenzoat. - Ức chế một phần bởi: 8- hydroxycholin, semicarbazit - Bị mất hoạt lực bởi: H2O2 - CO, HCN, NaF không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym. Các chất kìm hãm Các ion kim loại Ag+, Hg2+, Cu2+ có ảnh hưởng kìm hãm đến hoạt tính enzym GOD. Sự gắn kết của FAD bị kìm hãm bởi một vài nucleotit. 5
Điều kiện bảo quản Enzym GOD dạng khô là ổn định trong nhiều năm khi bảo quản ở chỗ mát. Các dạng dung dịch tính ổn định phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bảo quản. I.4. Cơ chế hoạt động cña enzym GOD [77] Enzym GOD (còn gọi là β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là một enzym oxi hóa khử β-D glucoza bị oxi hóa thành axit gluconic và oxi bị tiêu thụ. GOD Phản ứng tổng quát: C6H12O6 + ½ O2 C6H12O7 Trước tiên, β-D-glucoza bị loại nước thành D-glucono-1,5-lacton và FAD bị khử thành dạng FAD khử. Sau đó D-glucono-1,5-lacton bị kết hợp với nước tạo thành axit gluconic và FAD khử phản ứng với oxy tạo thành hydro peroxit (H2O2). Nếu có mặt enzym catalaza hydro peroxit (H2O2) sẽ bị phân hủy thành nước và oxy. Phương trình phản ứng như sau: GOD C6H12O6 + FAD C6H10O6 + FAD~H2 gluconolacton +O2 +H2O C6H12O7 H2O2 H2O + ½ O2 + FAD Sự tạo thành axit gluconic làm giảm pH môi trường nên trong quá trình phản ứng đồng thời phải bổ sung kiềm để điều chỉnh pH. Theo cơ chế hoạt động xúc tác của của enzym GOD, quá trình oxy hoá glucoza luôn có sự hình thành H2O2 chính sản phẩm phụ này lại ức chế ngược hoạt động của enzym GOD. Hoạt lực của enzym GOD luôn biểu hiện giảm mạnh sau 5 giờ phản ứng. Các kết quả đều cho thấy hoạt lực của GOD giảm tỷ lệ nghịch với sự tăng của nồng độ H2O2 [45]. 6
I. 5. Chỉ tiêu chất lượng của một số chế phẩm GOD [8]. Hoạt tính riêng Dựa vào hoạt tính riêng của GOD mà chia enzym này thành 4 loại: - Loại I khoảng 210 U/mg - Loại II khoảng 70 U/mg - Loại III khoảng 20 U/mg - Loại IV khoảng 1.5 U/mg Mức độ tinh sạch - Loại I: amylaza, sacaroza – mỗi loại < 0.01%, catalaza
các enzym khác như amylaza, maltaza, saccharaza. Williams và cộng sự (1976), Auses và cộng sự (1975) đã tiến hành xác định hàm lượng glucoza bằng enzym GOD đã được tinh sạch với sự có mặt H2O2 và chất chỉ thị màu luminol. Greenfeld và cộng sự (1975), Lahoda và cộng sự (1975) đã sử dụng enzym GOD cố định trong chuẩn đoán bệnh tiểu đường. Năm 1997, enzym GOD đã được Janser sử dụng để bảo quản dịch ép các loại quả nhiệt đới. Pickering (2000) đã sử dụng GOD trong bảo quản rượu vang [64]; [65];[66];[70]. Chính vì tính chất ưu việt của GOD mà các công trình nghiên cứu về enzym này vẫn được tiếp tục công bố. Akulova và cộng sự (1978) đã nghiên cứu động học của quá trình sinh tổng hợp và tính ổn định của enzym GOD từ chủng Penicillium vitale. Li (1996) đã nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp GOD từ chủng Streptomyces sp. Năm 2001, các tác giả Kapat, A., Jung, J.K., Park, Y.H đã nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp GOD từ chủng Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp. Cùng thời gian này Rinas và cộng sự đã sản xuất GOD từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp và sử dụng các nguồn cacbon không phải glucoza. Gần đây có nhiều công trình công bố điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh tổng hợp GOD, sinh tổng hợp catalaza (CAT) và kích thích sinh tổng hợp cả hai enzym.[34], [39], [69];[71]. Năm 2003, Hafiz và cộng sự đã tiến hành tối ưu hoá các thông số khác nhau của quá trình sản xuất GOD trên môi trường tinh bột sử dụng chủng Aspergillus niger [36]. Rhinas và cộng sự (2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của sự thông khí đến hình thái sợi nấm, sự tạo thành viên và sự sản xuất enzym GOD của chủng tái tổ hợp Aspergillus niger. Theo tác giả này, trong nuôi cấy chìm khi tốc độ thông khí tăng từ 200 – 800 v/p, hình thái sinh trưởng của A. niger thay đổi từ hạt kích thước lớn (đường kính trung bình 1500 µm) đến hạt kích thước nhỏ. Có một sự tương quan giữa cường độ thông khí với hình thái sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym GOD. Khả năng tổng hợp enzym tăng lên khi thay đổi hình thái sinh trưởng từ dạng viên đến dạng sợi mảnh. Tuy nhiên, dạng sợi mảnh có sức căng bề mặt lớn hơn, cần thông khí mạnh hơn và lượng sinh khối thu được ít hơn [63];[69]. Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về GOD được công bố. 8
II.1. Chủng vi sinh vật trong sản xuất enzym GOD Chủng giống là điều kiện tiên quyết quan trọng nhất trong sản xuất enzym công nghiệp bằng kỹ thuật lên men. Việc lựa chọn chủng giống đang ngày càng đóng vai trò quan trọng trong sản xuất enzym. Một chủng giống tốt không chỉ giúp tăng sản lượng của sản xuất enzym, tăng tốc độ sử dụng nguyên liệu thô mà còn liên quan đến tính đa dạng của các enzym, rút ngắn quá trình sản xuất, cải thiện quá trình lên men và tách chiết. Nấm sợi là vi sinh vật hoại sinh điển hình, chúng tiết ra một loạt các enzym tham gia vào việc phân hủy các polyme sinh học của các mô động vật và thực vật. Đại bộ phận các enzym này là enzym thủy phân và đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng của nấm mốc, giải phóng cacbon và nitơ liên kết trong các đại phân tử để cung cấp dinh dưỡng cho nấm mốc. Điều này làm cho nấm sợi như là vật chủ để sản xuất các enzym [12]. Khả năng của nấm sợi trong việc bài tiết protein ở mức cao là một trong những đặc điểm then chốt trong việc xem xét chúng như là vật chủ giàu tiềm năng để sản xuất các protein tái tổ hợp có giá trị cao dùng trong y học [23]. Khả năng sinh tổng hợp GOD được phát hiện ở nhiều chủng nấm mốc như Penicilium (P. notatum, P. chrysogenum, P. .vitale), Aspergillus (A. niger), nấm men (Saccharomyces sp) và vi khuẩn (Streptomyces sp) [71]. Tuy nhiên, enzym GOD được sản xuất chủ yếu từ các chủng A. niger, P. notatum, P. glaucum, P. amagasakiense, P. purpurogenum, P. variablile và Alternaria alternate [30]. Trong một vài năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh hợp GOD của chủng nấm mốc A.niger đã được công bố. Trong số các chủng nấm mốc được sử dụng để sản xuất enzym qui mô công nghiệp thì chủng Aspergillus niger là được sử dụng nhiều hơn cả nhờ sự đa dạng về trao đổi chất của chủng này. Việc sử dụng chủng A. niger để sinh tổng hợp enzym GOD có những ưu điểm sau [30]: • A. niger có thể tạo ra các enzym nhất định với với số lượng vài kg/1 m3 ở điều kiện thích hợp. • A. niger có lịch sử lâu đời về ứng dụng trong công nghiệp lên men và nhìn chung chúng được coi là an toàn. 9
• Các ngành công nghiệp lên men là tương tự nhau về các điều kiện cần thiết để cực đại hóa việc sản xuất các protein đồng hình của Aspergillus. Vì vậy, nó cung cấp điểm khởi đầu tốt nhất để nhận biết các ảnh hưởng hóa lý đối với việc sản xuất và bài tiết các protein dị hình khi dùng một chủng tương tự. • Các loài Aspergillus là các nhà máy bài tiết protein hiệu quả, với số lượng cao gấp nhiều lần so với trong tự nhiên. Chúng không có khuynh hướng tích lũy một số lượng lớn protein nội bào dưới dạng cấu trúc cơ thể như vi khuẩn và nấm men. • Aspergillus là một hệ thống sản xuất hữu ích các protein dị hình nhận được từ các nấm sợi khác. • Tính ổn định của các biến đổi di truyền là khá cao vì vậy, mối đe dọa của sự lại giống hầu như không được nhắc tới. II. 2. Định tên chủng nấm mốc Aspergillus niger là một trong những loài nấm mốc được nghiên cứu nhiều nhất. Tuy nhiên, các cơ sở để phân loại chúng là chưa thật chắc chắn. Thông thường tên A. niger có thể được sử dụng cho bất kỳ thành viên nào thuộc nhóm này bởi vì chúng rất khó phân biệt. Các đặc điểm về hình thái của chúng là rất giống nhau và rất khó phân biệt các loài trong cùng một nhóm A. niger [16]. Theo Al-Musallam (1981) và Samson (2004) thuộc nhóm A. niger gồm có 8 loài: A. niger, A. tubingensis, A. foedidus, A. piperis, A. brasiliensis, A. vadensis, A. costaricensis và A. lacticoffeatus. Cho đến năm 1991 bằng kỹ thuật gen dựa trên kết quả đọc trình tự các đoạn gen ITS, β-tubilin, calmodulin, IGS và cox1 đã cho phép phân biệt chính xác hơn các loài trong nhóm A. niger [46]. Theo Varga và cộng sự, 1993; 1994; Accensi và cộng sự, 1999; 2001, nếu chỉ dựa trên phương pháp phân loại nấm mốc cổ điển, không thể phân biệt được đã phân biệt được A. tubingensis và A. niger. Hai loài này có độ tương đồng về hình thái rất cao và A. tubingensis được xem như là loài phụ của A. niger. Việc sử dụng các phương pháp phân tử cho phép phân biệt chính xác hơn các loài trong nhóm A. niger và đã phân loại được A. niger và A. tubingensis là hai loài riêng biệt [16]; [83]; [84]. Sự phân biệt chính xác A. niger và A. tubingensis là rất có ý nghĩa bởi vì A. niger được công bố 10
là có sinh độc tố ochratoxin A (OA) trên hạt cafe, trong khi A. tubingensis là loài không sinh độc tố vi nấm này [16]. II.3. Độc tố nấm mốc [3];[4]; [7]; [14];[17] Một số chủng nấm mốc thuộc nhóm Aspergillus trong quá trình sinh trưởng ở điều kiện nuôi cấy nhất định có sinh ra độc tố vi nấm. Trong số các độc tố do nấm mốc sinh ra thì aflatoxin là độc tố gây nguy hiểm nhất, nó ảnh hưởng xấu tới gan và là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư gan. Chỉ với một hàm lượng rất nhỏ (10 mg) mà con người ăn phải cũng có thể gây tử vong. Bảng 1. 1. Các loài thuộc chi nấm cúc Aspergillus và các độc tố nấm TT Loài nấm Độc tố nâm mốc 1 A. amstelodami catenarin, entocroxin 2 A. avenaceus x 3 A. elavatus aflatoxin (k), patulin (k), ascladiol 4 A. candidus x 5 A. carneus x 6 A. claviforme x 7 A. flavus aflatoxin (k), axit koji, axit nitro-propionic, tremorgen, aspertoxin, metylstergmatocystin, axit aspergillic 8 A.. fumigatus aflatoxin (k), fumigacillin, gliotoxin 9 A.. flacipes aflatoxin (k) 10 A. giganteus patulin (k) 11 A. glaucus axit koji 12 A. mangnini aflatoxin (k) 13 A. nidulans sterigmatocystin (k), axit koji, nitulin, nitulotoxin 14 A. niger aflatoxin (k) 15 A. niveus citrinin 16 A. ochraceus ochratoxin A, B, C, aflatoxxin (k) 17 A. oryzae oryzacillin, axit koji 19 A. parasitieus aflatoxin (k) 20 A. ruber aflatoxin (k), parietin 21 A. sydowii x 22 A. terreus patulin (k), citrin, axit terreic 23 A. ustus axit ustinic 24 A. varsicolor sterogmatocystin (k), aversin, versicolorin A, B, C 25 A. wentii aflatoxxin (k), x Chú thích: x: độc tố nấm mốc chưa biết; k: độc tố nấm mốc gây ung thư gan; 11
Cho đến nay, người ta đã phát hiện được tất cả 16 aflatoxin. Trong 16 aflatoxin đã được phát hiện, cần đặc biệt chú ý đến các aflatoxin B1, G1, B2, G2 vì các aflatoxin này có độc tính cao nhất, đồng thời cũng là các aflatoxin được tạo thành với số lượng nhiều nhất, cả trong các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm cũng như trong môi trường lên men. II. 4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym II. 4. 1. Ảnh hưởng của các ion kim loại và khoáng chất Các ion kim loại và khoáng chất trong môi trường có ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp các chất chuyển hóa của tế bào. Tùy theo nhu cầu của vi sinh vật đối với các ion kim loại và khoáng chất mà chúng được chia thành các nguyên tố đại lượng (như P, K, S, Ca, Mg, Fe.v.v) hay nguyên tố vi lượng (như Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni.v.v). Nhu cầu về các nguyên tố đại lượng hay vi lượng thay đổi tuỳ thuộc vào từng loại nấm và vào điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy [2]. Nồng độ cần thiết của các muối khoáng đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn thường thay đổi theo các phạm vi sau đây: Bảng 1. 2. Nhu cầu của vi sinh vật về các loại muối khoáng [2] Muối khoáng Nồng độ cần thiết (g/l) Vi khuẩn Nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn K2HPO4 0.2 – 0.5 1-2 KH2PO4 0.2 – 0.5 1-2 MgSO4.7H2O 0.1 – 0.2 0.2 - 0.5 MnSO4.4H2O 0.005 – 0.01 0.02 – 0.1 FeSO4.7H2O 0.005 – 0.01 0.05 – 0.2 Na2Mo.O4 0.001 – 0.003 0.01 – 0.02 ZnSO4.7H2O - 0.02 – 0.1 CoCl2 tới 0.03 tới 0.06 CaCl2 0.01 - 0.03 0.02 – 0.1 CaSO4.5H2O 0.001 – 0.005 0.01 – 0.05 Các ion kim loại có mặt trong môi trường với hàm lượng rất nhỏ, dưới dạng các nguyên tố vi lượng nhưng chúng có vai trò quan trọng đối với các quá trình xúc tác 12
sinh học trong tế bào nấm. Một số nguyên tố tham gia vào cấu trúc của các enzym kim loại. Một số nguyên tố kim loại khác tuy không tham gia vào cấu trúc của enzym nhưng cũng có ảnh hưởng rất quan trọng đối với hoạt động của nhiều enzym [2]. Lưu huỳnh cũng là một nguyên tố khoáng quan trọng trong tế bào vi sinh vật. Lưu huỳnh có mặt trong thành phần một số axit amin (systin, systein và một tripeptide là glutathion). Ngoài ra, lưu huỳnh còn có vai trò quan trọng trong các quá trình oxi hóa khử. Việc chuyển nhóm sulphidrin thành nhóm disulphit có vai trò rất lớn trong quá trình chuyển điện tử từ nguyên liệu hô hấp đến oxi phân tử. Các hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh ở dạng oxy hóa thường có tác dụng độc đối với tế bào vi sinh vật, trong khi các muối sulphat vô cơ lại được vi sinh vật đồng hóa rất tốt [2]. Sắt là nguyên tố rất cần thiết để giúp vi sinh vật có thể tổng hợp một số enzym chứa sắt như: xitocrom, xitocrommoxidaza, peroxidaza, catalaza v.v. Trong sinh tổng hợp enzym GOD và peroxidaza từ A. niger nguồn Fe thích hợp nhất là FeSO4.7H2O [2],[35],[48]. Magiê là nguyên tố được vi sinh vật đòi hỏi với hàm lượng khá cao (10-3 – 10- 4 M). Magiê đóng vai trò một cofacto, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzym có liên quan đến các quá trình photphoril hóa (chuyển H3PO4 từ một hợp chất hữu cơ này sang một hợp chất hữu cơ khác). Mg2+ có thể làm hoạt hóa các enzym hexokinaza, ATP-aza, pirophotphataza, phophopheraza, transaxetilaza, photphoglucomutaza, cacboxylaza, enolaza, các enzym trao đổi protein, các enzym oxi hóa khử của chu trình Crep. Mg2+ còn có vai trò quan trọng trong việc làm iên kết các tiểu phần riboxom với nhau. Nguồn Mg, S được dùng phổ biến là MgSO4 [2], [36]. Canxi có vai trò trong việc xây dựng các cấu trúc tinh vi của tế bào. Canxi đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng của tế bào sống (như giữa ADN và protein trong nhân, giữa các nucleotit với nhau, giữa ARN và protein trong ribôxom). Canxi rất cần thiết đối với việc hình thành các cấu trúc không gian ổn định của nhiều bào quan như riboxom, ti thể, nhân v.v. Trong quá trình tổng hợp GOD từ nấm mốc A. niger, muối canxi cacbonat có tác dụng kích thích quá trình sinh tổng hợp cả enzym GOD và catalaza trong khi canxiclorua lại có tác dụng kìm hãm chúng [36], [54]. 13
Kẽm cũng là một cofacto tham gia vào nhiều hoạt động của enzym. Zn có vai trò đáng kể trong việc hoạt hóa các enzym như cacboanhydraza, enolaza, photphataza kiềm, pirophotphataza, lơxitinaza v.v [2]. Mangan tham gia vào cấu trúc của một số enzym hô hấp. Mangan có vai trò quan trọng trong việc làm hoạt hóa một số enzym như phophomonoesteraza, cacboxylaza, ATP-aza, hydroxylamin reductaza, acginaza, aminopeptidaza, enolaza, photphoglucomutaza v.v [54]. Kali là nguyên tố chiếm tỷ lệ khá cao trong thành phần khoáng của tế bào vi sinh vật. Kali thường tồn tại dưới dạng ion K+ ở mặt ngoài của màng tế bào. Một lượng đáng kể ion K+ tồn tại ở trạng thái liên kết hóa lý không bền với protein và các thành phần khác của nguyên sinh chất. Kali làm tăng độ ngậm nước của các hệ thống keo do đó ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất, nhất là các quá trình tổng hợp. Nguồn kali thường dùng dưới dạng muối KH2PO4, K2HPO4 hoặc K2SO4 [36]. Trong tế bào vi sinh vật, các ion kim loại có sự tương tác với nhau, một enzym có thể bị hoạt hóa bởi nhiều ion kim loại khác nhau, cũng có trường hợp một ion kim loại này lại có tác dụng đối kháng đối với một ion kim loại khác [2]. Bình thường trong nuôi cấy vi sinh vật, người ta không cần bổ sung các nguyên tố vi lượng, các nguyên tố này thường có sẵn trong nước máy hoặc trong các hóa chất dùng làm môi trường. Tuy nhiên, trong một số trường hợp cụ thể phải bổ sung một số nguyên tó vi lượng vào môi trường nuôi cấy như bổ sung Zn vào môi trường nuôi cấy nấm mốc, bổ sung Co vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn sinh tổng hợp B12, bổ sung B và Mo vào môi trường nuôi cấy các vi sinh vật cố định đạm v.v [2]. Sự tồn tại dư thừa các ion kim loại và các nguyên tố khoáng là không cần thiết và có thể dẫn đến những ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym. II.4.2. Ảnh hưởng của dinh dưỡng cacbon, nitơ, photpho và các chất có hoạt tính bề mặt Sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của nấm mốc không chỉ bị ảnh hưởng bởi các ion kim loại và muối khoáng mà còn bị ảnh hưởng rất lớn bới thành phần dinh dưỡng cacbon và nitơ. 14
Nguồn dinh dưỡng cacbon [10];[36],[68]; [69] Để sản xuất enzym GOD qui mô thương mại bằng chủng A. niger và phương pháp lên men chìm, có thể sử dụng những nguồn thức ăn cacbon rất khác nhau. Các nguồn hydratcacbon được A. niger sử dụng làm nguồn năng lượng để sinh tổng hợp GOD có thể kể đến: Glucoza, sacaroza, maltoza, fructoza, rỉ đường, dịch chiết khoai tây và một vài loại tinh bột. Khi phát triển trên môi trường có nguồn cacbon là glucoza, thời kỳ tiền phát thường rút lại rất ngắn và hệ sợi nấm rất nhanh chóng được tích lũy trong môi trường nuôi cấy. Đối với các nguồn cacbon cao năng khó phân huỷ như tinh bột, thì trước hết nấm mốc phải sinh ra các enzym để phân huỷ các hợp chất này thành các chất đơn phân tử sau đó mới đồng hoá được chúng [2]. Theo Fiedurek. J (1997) trên môi trường có 6% bột mì được sử dụng như nguồn cacbon duy nhất, chủng A. niger GIV 10 có thể sinh tổng hợp enzym GOD nội bào và ngoại bào với hoạt tính enzym đạt cao nhất [29]. Theo J. Mirón và cộng sự (2002), khi nghiên cứu sản xuất GOD từ chủng A. niger, họ đã phát hiện ra rằng axit gluconic được sinh ra từ glucoza nhờ hoạt động của enzym cũng có thể được coi như nguồn cacbon dùng cho sinh trưởng, mà không hề cản trở quá trình sinh tổng hợp GOD mặc dầu axit gluconic được sinh ra do hoạt động của enzym GOD [51],[59],[66]. Ngoài ra, enzym GOD cũng có thể được tổng hợp từ chủng A. niger trên môi trường có nguồn cacbon là glycerol, đường riboza, arabinoza, xyloza, rhamnoza, mannoza, galactoza và hỗn hợp của xyloza/xilan [69]. Nguồn dinh dưỡng nitơ Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên quá trình sinh tổng hợp GOD từ A. niger bằng phương pháp lên men chìm đã được nghiên cứu sâu. Nguồn nitơ dùng cho sinh tổng hợp GOD từ chủng A. niger bao gồm các nguồn nitơ vô cơ khác nhau như muối nitrat của canxi, natri, amoni, kali và nguồn nitơ hữu cơ như dịch chiết nấm men, nước chiết malt, peptone, dịch chiết ngô, nước chiết đậu tương [47]. Natri nitrat và cao nấm men là nguồn nitơ phổ biến nhất được dùng để sinh tổng hợp GOD. Tuy nhiên, theo Kona. R.P và cộng sự (2000) để sản xuất GOD từ A. niger, trong số các nguồn nitơ như canxi nitrat, natri nitrat, amoni nitrat, kali nitrat, dịch chiết nấm men và pepton thì natri nitrat cho hoạt lực enzym GOD cao nhất (đạt 595 ± 30 Unit/ml) trong khi sử dụng dịch chiết 15
ngô như nguồn nitơ duy nhất với hàm lượng 20ml/l hoạt lực enzym cao hơn hẳn (đạt 640 ± 36 Unit/ml) [47]. Nguồn dinh dưỡng photpho Photpho luôn luôn chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật. Photpho có mặt trong cấu tạo của nhiều thành phần quan trọng của tế bào (như axit nucleic, photphoprotein, photpholipit, trong nhiều coenzym quan trọng như ATP, ADP, UDP, UTP, XDP, XTP, NAD, NADP, flavin v.v.), trong một số vi tamin như thiamin, biotin v.v. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng photpho người ta thường sử dụng các loại photphat vô cơ. Việc bổ sung photphat vào môi trường dinh dưỡng ngoài việc cung cấp photpho còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường. Với các tỷ lệ thích hợp, hỗn hợp muối KH2PO4 và K2HPO4 có thể tạo ra những mức pH ổn định trong khoảng pH 4.5 – 8.0. Trong môi trường axit K2HPO4 tạo ra ion OH- còn trong môi trường kiềm KH2PO4 sẽ tạo ra ion H+. Trong quá trình sinh tổng hợp GOD từ A. niger, nguồn photpho có thể dùng dưới dạng muối KH2PO4, K2HPO4 hoặc (NH4)2HPO4, NH4H2PO4, trong đó KH2PO4 và K2HPO4 là thích hợp hơn cả [36]; [40], [41]. Ảnh hưởng của các chất có hoạt tính bề mặt [2]; [37]; [40] Khi sinh trưởng trong môi trường dịch thể vi sinh vật chịu ảnh hưởng của sức căng bề mặt của môi trường. Đa số các môi trường dịch thể dùng trong phòng thí nghiệm có sức căng bề mặt khoảng 0,57 – 0,63mN/cm. Những thay đổi mạnh mẽ sức căng bề mặt có thể làm ngừng sinh trưởng và làm tế bào chết. Khi sức căng bề mặt thấp, các thành phần của tế bào chất bị tách khỏi tế bào. Điều này chứng tỏ màng tế bào chất bị tổn thương. Các chất làm tăng sức căng bề mặt đa số là các muối vô cơ. Các chất làm giảm sức căng bề mặt chủ yếu là các axit béo, alcohol, saponat và các chất có chuỗi cacbon dài, thẳng và thơm. Các chất nói trên được gọi là các chất có hoạt tính bề mặt. Tác dụng của chúng thể hiện trong việc làm thay đổi các đặc tính bề mặt của vi sinh vật, trước hết là nâng cao tính thấm của tế bào. Trong thực tế người ta sử dụng hiện tượng này trong việc nuôi cấy các vi khuẩn kháng axit. Khác với các vi khuẩn khác, vi khuẩn kháng axit có bề mặt kỵ nước và việc giảm sức căng bề mặt của môi trường sẽ kích thích sự sinh trưởng của chúng. Sức căng bề mặt thấp còn ngăn cản vi khuẩn gắn vào bề mặt cứng, tránh cho chúng khổi cạnh tranh sinh trưởng. Việc 16
thêm một lượng nhỏ chất có hoạt tính bề mặt như Tween 80 vào môi trường nuôi cấy giúp cho vi khuẩn sinh trưởng khuyếch tán đồng đều trong dung dịch [2]. Các chất có hoạt tính bề mặt cũng được dùng để sát trùng, tẩy uế. R.P Kona (2001), khi nghiên cứu sinh tổng hợp enzym GOD từ chủng nấm mốc Aspergillus niger đã sử dụng dung dịch 0,5g/l tween 80 để thu bào tử [47]. Hao Peng (2004), khi nghiên cứu ảnh hưởng của EDTA đến quá trình tổng hợp enzym GOD của chủng Penicillium sp. JW 8312 cho thấy, nồng độ EDTA bổ sung thích hợp nhất là 290ppm, trong khi nồng độ 580ppm kìm hãm sinh trưởng và làm giảm hoạt tính enzym [40]. II. 4.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy Việc sản xuất enzym GOD từ chủng A. niger chịu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, thời gian, chế độ thông khí v.v. Để đạt được sản lượng GOD cao người ta cần phải nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, chế độ thông khí thích hợp cho sinh trưởng của chủng vi sinh vật sử dụng. Tuy nhiên, điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển từng loài có thể không trùng với điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp enzym. pH Hoạt động chuyển hóa của nấm mốc rất nhậy cảm với pH của môi trường. Hầu hết nấm mốc phát triển tốt trong môi trường hơi axit, giá trị pH từ 3 đến 6, nhưng một số loài có thể sinh trưởng ở giá trị pH dưới 2, có tác dụng rất tốt để ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Tác dụng của pH có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của tế bào. pH cần cho hoạt động của nhiều enzym. Nồng độ ion H+ còn ảnh hưởng trực tiếp đến độ hoà tan của một số khoáng K, Na, Mg.... pH môi trường còn ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ các nguồn hydrat cacbon, nitơ của sinh vật [2]. Để sản xuất enzym GOD từ A. niger khoảng pH ban đầu của môi trường trong khoảng từ 5-7 [ 42];[47];[73]. Nhiệt độ [42] Nhiệt độ lên men thích hợp cần phải được duy trì mặc dầu vi sinh vật trong quá trình hoạt động trao đổi chất cũng sinh nhiệt. Nhiệt độ có vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng của sợi nấm, việc sản sinh bào tử và sự nảy mầm của chúng. Khi nuôi cấy ở nhiệt độ dưới nhiệt độ tối thích, sự sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa bị 17
chậm lại. Khi nuôi cấy nấm mốc ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối thích, kết quả là làm ức chế và biến tính enzym và sự sinh trưởng bị dừng lại. Mặc dầu hầu hết nấm sợi là có nhiệt độ tối thích giữa 250C và 350C, một số loài có thể phát triển mạnh ở 500C. Ở nhiệt độ 400C được coi là nhiệt độ tối thích cho việc sản xuất các chất trao đổi và tiêu thụ đường của chủng A. niger ACTT 10577. Chế độ thông khí Trong quá trình sinh tổng hợp GOD từ A. niger nấm mốc đều cần oxy để sinh trưởng và tổng hợp enzym. Nhu cầu oxy sẽ khác nhau tuỳ theo giai đoạn. Nồng độ oxy hòa tan tới hạn (DO) xác định khả năng thích hợp nhất của vi sinh vật tùy thuộc vào sản phẩm mong muốn cuối cùng. Việc sinh tổng hợp enzym GOD bị ảnh hưởng đáng kể bởi hàm lượng oxy hòa tan. Nồng độ DO 100% thể hiện là nồng độ ngưỡng để tăng sản lượng enzym lên vài lần [61]. Sự giao động của DO trong quá trình lên men theo chu kỳ hình sin cho thấy đường DO thổi vào bình lên men qui mô công nghiệp qua ống dẫn khí là rất thuận lợi cho việc sản xuất GOD. Ngoài ra, Michael Trager đã chứng minh rằng, ở nồng độ DO kém tối ưu và ở giai đoạn nhất định A. niger đã tiết enzym vào môi trường [61];[63]. Tốc độ sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym GOD của chủng A. niger ở tốc độ khuấy 700v/p là cao hơn ở tốc độ khuấy 460v/p [55]. Hơn nữa, việc tăng tốc độ khuấy không chỉ làm tăng tốc độ sinh trưởng của A. niger mà còn nâng cao hoạt tính GOD. Hoạt tính enzym GOD đạt cao nhất ở nồng độ đường của môi trường là 5% (tốc độ khuấy 700v/p) và hoạt tính enzym không cao hơn khi nồng độ đường trong môi trường tăng lên 7%. Khi cung cấp oxy tinh khiết vào bình lên men, tốc độ sinh trưởng của A. niger (ở pha ổn định) là 95mg sợi nấm khô/100ml/giờ và sinh khối chỉ đạt 61 mg khi oxy tinh khiết được thay bằng không khí [63]. Hoạt tính glucooxidaza trong nuôi cấy cấp oxy cao gấp đôi trong nuôi cấy thông khí. Độ nhớt của dịch nuôi cấy sẽ cao hơn khi nồng độ sợi nấm tăng lên. Độ nhớt của dịch nuôi cấy cung cấp oxy là thấp hơn độ nhớt của dịch nuôi cấy thổi không khí. II.5. Thu hồi và tinh sạch enzym Sản xuất enzym GOD (GOD) bằng chủng A. niger được biết đến từ lâu. Tuy nhiên, các nghiên cứu sự phân bố enzym trong các chủng nấm mốc còn ít được quan tâm. Clarke và cộng sự đã nghiên cứu định lượng enzym GOD ngoại bào, trong màng 18
tế bào, tế bào chất và trong các thành phần khác của nấm mốc A. niger NRRL-3 nuôi cấy trên môi trường thạch nước chiết malt (MEA). Các tác giả đã tách được các thành phần riêng rẽ và xác định được hoạt tính enzym GOD, trong đó GOD ngoại bào chiếm 38% hoạt động tổng thể, 60% còn lại ở trạng thái liên kết trong sợi khuẩn ty bao gồm: màng tế bào, tế bào chất và chất dịch khác chiếm tỷ lệ tương ứng 34, 12 và 16% [59]. Witteveen và cộng sự đã nghiên cứu định vị hoạt động của GOD và catalaza của A. niger N 400 (CBS 120.49) theo phương pháp hoá học miễn dịch và cũng xác định GOD tập trung ở màng tế bào [59]. Đối với trường hợp enzym tiết ra môi trường, để thu dịch enzym người ta thường tách sinh khối và các chất cặn bã ra khỏi canh trường bằng ly tâm hoặc lọc ép với việc sử dụng thêm các chất trợ lọc hoặc các chất tạo kết tủa. Đối với enzym còn nằm trong tế bào thì việc phá vỡ tế bào là rất cần thiết. II.5.1. Cơ chế của việc giải phóng enzym nội bào [27]; [52] Việc giải phóng các enzym nội bào ra khỏi tế bào thực chất là quá trình làm tổn thương tế bào. Có hai cách để có thể làm thay đổi màng tế bào dẫn đến việc giải phóng enzym là làm cạn kiệt năng lượng hoặc làm tổn thương màng tế bào. II. 5.1.1 Cơ chế làm cạn kiệt năng lượng Sự ức chế quá trình chuyển hóa năng lượng là làm cạn kiệt năng lượng ATP dẫn đến sự giải phóng liên tục các các ion Na+, K+ và Cl- trên màng và dẫn đến làm phồng màng tế bào. Hậu quả của sự thâm nhập các ion Ca2+ vào bên trong tế bào là kích hoạt các enzym phospholipaza, kết quả của những phản ứng do enzym phospholipaza xúc tác đã gây ra những tổn thương cho màng tế bào. Khi các lỗ thủng nhỏ trên màng được khắc phục nhờ sự hàn gắn lại trong pha thuận nghịch thì chỉ một phần rất nhỏ enzym được giải phóng ra, nhưng khi năng lượng ATP đã giảm đến mức thấp, tính toàn vẹn của màng bị phá vỡ nghiêm trọng, sự tổn thương của tế bào là không thể khắc phục thì một lượng lớn enzym được giải phóng. 19