Báo cáo tổng kết đề tài Hợp tác nghiên cứu Khoa học và Công nghệ với nước ngoài: Tăng cường tính chống chịu và cải tiến giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật

Chia sẻ: Trần Đức Anh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:157

Thêm vào BST

Báo xấu

42
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài tìm kiếm, đánh giá, phân lập và sử dụng các gen nhằm nâng cao khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa và chất lượng tinh bột của hạt gạo thông qua các kỹ thuật phân tử và biến nạp gen.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo tổng kết đề tài Hợp tác nghiên cứu Khoa học và Công nghệ với nước ngoài: Tăng cường tính chống chịu và cải tiến giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật

ViiÖn khoa häc Bé khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam vµ c«ng nghÖ ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc 18 Hoµng Quèc ViÖt, CÇu GiÊy, Hµ Néi V.KHCNVN V.KHCNVN V.CNSH V.CNSH V.KHCNVN V.CNSH B¸o c¸o tæng kÕt §Ò tµi Hîp t¸c Nghiªn cøu KH&CN víi n−íc ngoµi Chñ nhiÖm ®Ò tµi: PGS. TS. Lª TrÇn B×nh 6288 25/01/2007 Hµ Néi, 2006
ViiÖn khoa häc Bé khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam vµ c«ng nghÖ ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc ---------------------------------- V.KHCNVN V.KHCNVN V.CNSH V.CNSH V.KHCNVN V.CNSH B¸o c¸o tæng kÕt §Ò tµi Hîp t¸c Nghiªn cøu KH&CN víi n−íc ngoµi T¨ng c−êng tÝnh chèng chÞu vµ c¶i tiÕn chÊt l−îng gièng lóa b»ng c«ng nghÖ sinh häc thùc vËt Chñ nhiÖm §Ò tµi: PGS. TS. Lª TrÇn B×nh C¬ quan chñ tr×: ViÖn C«ng nghÖ sinh häc C¬ quan chñ qu¶n: ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam Thêi gian thùc hiÖn: 2002 - 2005 Hµ Néi, 2006
LLờ ờii ccảảm mơơnn Trong khuôn khổ hợp tác song phương về khoa học và công nghệ giữa CHLB Đức và Việt Nam thì lĩnh vực công nghệ sinh học được chú trọng như một lĩnh vực ưu tiên. Tuy nhiên, hầu hết các nội dung hợp tác giữa các đối tác Việt Nam và đối tác Đức nổi bật vẫn là những nội dung nặng về chuyển giao công nghệ và đào tạo nguồn nhân lực. Lần đầu tiên trong lĩnh vực công nghệ sinh học có một đề tài mà cả hai bên đối tác đều muốn tập trung khai thác những thành tựu mới nhất của thế giới về Giải mã genom cây lúa nước. Đó cũng là lý do vì sao một quốc gia như Đức, không trồng một cây lúa nước nào ở ngoài đồng ruộng tự nhiên mà lại quan tâm đến những nghiên cứu rất cơ bản về cây lúa nước. Vì thế việc xây dựng một đề tài đối ứng với một Viện đầu ngành về sinh học phân tử thực vật như Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử, Golm là một cơ hội lớn cho Viện Công nghệ sinh học nhằm học hỏi cách thức tiếp cận tiến hành nghiên cứu khoa học tân tiến. Chủ nhiệm đề tài xin trân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ Liên bang về Đào tạo và nghiên cứu, CHLB Đức đã hỗ trợ sự hợp tác này. CƠ QUAN CHỦ TRÌ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÓ VIỆN TRƯỜNG CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI PGS.TS. Trương Nam Hải PGS. TS. Lê Trần Bình Đề tài hợp tác Việt - Đức i
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic axít ADC Arginindecarboxylase APS Ammonium persulfate RNAse RNA polymerase ATP Adenosine triphosphate BSA Bovine serum albumin Bc Bacillus cereus bp base pair Bt Bacillus thuringiensis CaMV35S- P Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor cDNA Complementary DNA CHLB Cộng Hoà Liên Bang CGS Cystathionin gamma-Synthase cry Crystal gene = Gen mã hoá protein tinh thể độc tố diệt côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis DNA Deoxyribonucleic axít DAO Diaminoxidase DNAse DNA polymerase EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit Et-Br Ethidium Bromide FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-TOF-MS Gas Chromatograph/time-of-flight mass spectrometers GCN Guanidium thiocyanate GUS β-Glucuronidase gene = gen mã hoá β-Glucuronidase HSK Homoserine kinase HPLC High Performance Liquid Chromatography = sắc ký lỏng cao áp IRRI International Rice Research Institute = Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IPTG Isopropylthio-o-D-galactoside Kb Kilobase KDa Kilo dalton KN&CN Khoa học và Công nghệ Km Kanamycine KO Knock out LB Luria và Bertani mRNA Messenger RNA MPI Viện Sinh lý Phân tử thực vật Max - Planck Đề tài hợp tác Việt - Đức ii
MS Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog MST Mass Spectral Target = Chất mục tiêu NCS Nghiên cứu sinh NhaA Na+/H+ antiporter NOS-P Nopaline Synthase Promotor Neomycine phosphotransferase II gene=Gen mã hoá neomycine nptII phosphotransferase II OAT Ornithine Aminotransferase OD Optical density PA Polyamin PAM Chlorophyll Fluorometers to measuring systems of plant Gas Exchange = Hệ thống đo huỳnh quang diệp lục PAO Polyaminoxidase PCR Polymerase Chain Reaction PGS.TS Phó Giáo sư. Tiến sĩ QA, QB Quinon A, Quinon B RNA Ribonucleic axít RT-RT-PCR Real Time-Reverse Trascription-Polymerase Chain Reaction = PCR định lượng SAMDC S-Adenosylmethionin-decarboxylase SAT Serine acetyltransferase SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis = Điện di biến tính trên gel polyacrylamide SPD Spermidinsynthase T-DNA Transfer-DNA = DNA chuyển TF Transcription factor = Yếu tố điều khiển phiên mã Ti-plasmit Tumor inducing plasmid = Plasmit gây khối u thực vật Vip Vegetative insecticidal protein = protein sinh dưỡng diệt côn trùng Vir Virulence Region = Vùng gây độc có khả năng tạo khối u X-gal 5-bromo-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide Đề tài hợp tác Việt - Đức iii
MỤC LỤC BÀI TÓM TẮT .......................................................................................................................... 1 LỜI MỞ ĐẦU …………………………………………………………………………………………. 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ………... 5 1.1. Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước ………………………………………………………. 5 1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước ………………………………………………………. 6 1.3. Mục tiêu của đề tài .......................................................................................................... 7 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………....................... 8 2.1. Đối tượng và thiết bị nghiên cứu ................................................................................... 8 2.1.1. Các giống lúa ........................................................................................................... 8 2.1.2. Các thiết bị chính ..................................................................................................... 9 2.2. Nội dung nghiên cứu …………………………..............................................................… 9 2.2.1. Tìm kiếm và phân lập các gen làm gia tăng hàm lượng polyamin thông qua kỹ thuật ức chế gen bằng RNA ……………………………………………………………. 9 2.2.2. Phát hiện các gen điều khiển tính chịu hạn và muối bằng phổ phiên mã RNA .............. 10 2.2.3. Kỹ thuật sao chép gen …………………………………………………………………… 10 2.2.4. Kỹ thuật phân tích phổ chất bằng sắc ký khí/quang phổ khối .................................. 11 2.2.5. Tối ưu phương pháp chuyển gen vào một số giống lúa Việt Nam ........................... 11 2.3. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………………………. 12 2.3.1. Phương pháp sinh lý học thực vật ……………………………………………………… 12 2.3.2. Phươn g pháp sinh học phân tử thực vật ……………………………………………… 18 2.3.3. Phương pháp phân tích …………………………………………………………………. 22 2.3.4. Phương pháp biến nạp gen vào cây lúa ………………………………………………. 23 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………………………………………… 31 3.1. Vai trò của Polyamin đối với tính chịu hạn và chịu mặn ……………………………..... 31 3.1.1. Đánh giá tính chịu mặn ………………………………………….............................…. 31 Đề tài hợp tác Việt - Đức iv
3.1.2. Đánh giá tính chịu hạn......……………………………………………………………….. 32 3.1.3. Phân tích polyamin và biểu hiện gen …………………………………………………... 35 3.2. Xác định gen điều khiển mới kiểm soát tính chịu mặn và chịu hạn ........................... 39 3.2.1. Thiết lập …………………………………………………………………………………… 39 3.2.2. Xây dựng phương pháp ........................................................................................... 41 3.2.3. Xử lý hạn .................................................................................................................. 41 3.2.4. Xử lý muối ................................................................................................................ 41 3.2.5. Xây dựng ngân hàng dữ liệu về Tác nhân phiên mã ở lúa ...................................... 47 3.3. Các chất trao đổi trong rễ ở trạng thái ổn định và chuyển trạng thái khi bị xử lý stress ....... 47 3.3.1. Xây dựng phương pháp nuôi trồng và chuyển gen lúa ở các giống thuộc loài phụ Indica … 47 3.3.2. Xử lý hạn ………………………………………………………………………………….. 47 3.3.3. Xử lý muối ………………………………………………………………………………… 48 3.3.4. Thiết lập một ngân hàng các chất trao đổi của lá và rễ lúa khi phân tích phổ …….. 48 3.3.5. Xác định bằng khối phổ các chất chưa biết ............................................................. 49 3.3.6. Xác định và phân tích chất chỉ thị khi xử lý mặn ...................................................... 50 3.3.7. Phân tích tương quan trong xác định chất chỉ thị …………………………………….. 51 3.3.8. Đề xuất bổ sung ....................................................................................................... 55 3.4. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.................................... 55 3.4.1. Chuyển gen tăng cường khả năng chịu hạn và mặn ............................................... 55 3.4.2. Chuyển gen cải thiện thành phần aminoacid trong lúa gạo ..................................... 56 3.4.3. Đề xuất bổ sung ....................................................................................................... 66 CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC................................ 68 41. Kết quả về khoa học ......................................................................................................... 68 4.2. Kết quả nổi bất và khả năng áp dụng ............................................................................ 70 4.3. Trình độ công nghệ ......................................................................................................... 72 4.4. Khả năng áp dụng ........................................................................................................... 72 4.5. Đào tạo ............................................................................................................................. 74 4.6. Sản phẩm khoa học của đề tài ...................................................................................... 75 Đề tài hợp tác Việt - Đức v
4.7. Hợp tác quốc tế ............................................................................................................... 76 4.8. Tình hình sử dụng kinh phí ............................................................................................ 76 4.9. Danh sách các công trình công bố ................................................................................ 77 4.10. Hạn chế của đề tài ......................................................................................................... 78 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................... 79 5.1. Kết luận ............................................................................................................................ 79 5.2. Đề nghị ............................................................................................................................. 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................ 82 PHỤ LỤC ĐỀ TÀI 83 Báo cáo tình hình sử dụng và Quyết toán kinh phí Bản thuyết minh đề cương đề tài Quyết định của Bộ trưởng về việc phê duyệt các nhiệm vụ hợp tác khoa học Công văn gia hạn sử dụng kinh phí đề tài Quyết định thành lập và Biên bản đánh giá của Hội đồng nghiệm thu cấp Cơ sở Các báo cáo khoa học đăng trên tạp chí trong nước Các báo cáo khoa học đăng trên tạp chí quốc tế Poster Danh sách các gen tìm được trong ngân hàng các dòng KO So sánh trình tự các gen thiết kế với Genbank Danh sách các giống lúa làm nguyên liệu Trang web Ngân hàng dữ liệu về tác nhân phiên mã ở lúa Trang web của Viện IRRI - Phân loại khả năng chống chịu của các giống lúa theo tiêu chuẩn của IRRI Đề tài hợp tác Việt - Đức vi
MỤC LỤC BẢNG Bảng 2.1: Các giống lúa được sử dụng trong các nghiên cứu đề tài co nguồn gốc từ các quốc gia khác nhau, chủ yếu là các giống của Việt Nam ...................... 8 Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy trong chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens …………………………………………………………………. 26 Bảng 3.1: Kết quả đánh giá tính chịu mặn của các giống lúa tham gia thí nghiệm tổng hợp theo IRRI trong điều kiện sử dụng nồng độ muối là 100mM NaCl (5,8 g/l), thí nghiệm 3 lần với 5 lần nhắc lại …………………………………………………. 31 Bảng 3.2: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa. Thí nghiệm với 5 lần nhắc lại. Nhóm được phân theo mức 30% và 70% chênh lệch …………… 33 Bảng 3.3: Kết quả xử lý hạn nhẹ kéo dài và xử lý hạn khắc nghiệt …………………………. 53 Bảng 3.4: Kết quả chọn lọc và tái sinh cây lúa chuyển gen nhaA ……………………………. 55 Bảng 3.5: Tiến độ chuyển các gen cải thiện chất lượng amino acid gồm Cystathionin gamma-Synthase (CGS), Serinacetyltransferase (SAT), Homoserinkinase (plastid, SSUHSK), Homoserinkinase (cytosolic, HSK) và Glucoronidase (GUS) của gạo vào cây lúa …………………………………………………………………… 58 Bảng 3.6: Điều kiện thuỷ phân protein bằng lò vi sóng MAR5 …………………………………. 64 Bảng 4.1: Báo cáo tóm tắt kết quả thực hiện từ 12/2001 - 12/2005 ……………………….. 70 Bảng 4.2: Khả năng áp dụng của đề tài ……………………………………………………………….. 72 Bảng 4.3: Danh sách các học viên được đào tạo …………………………………………………… 74 Bảng 4.4: Danh sách các cán bộ được nâng cao trình độ ………………………………………. 74 Bảng 4.5: Nội dung hợp tác quốc tế …………………………………………………………………….. 76 Bảng 4.6: Tình hình sử dụng kinh phí ………………………………………………………………….. 76 Đề tài hợp tác Việt - Đức vii
MỤC LỤC HÌNH Hình 2.1: Hiện tượng dịch chuyển điện tử quang hợp trong các tâm phản ứng của hệ quang hóa II …………………………………………..…………………………………………… 14 Hình 2.2: Nguyên lý cường độ phát quang ……………………………………………………………… 18 Hình 2.3: Sản phẩm PCR tăng dần theo chu kỳ phản ứng ………………………………………… 19 Hình 2.4: Mẫu dò lai …………… ………………………………………………………………………………. 20 Hình 2.5: Mẫu dò thủy phân (TaqMan probe) …………………………………………………………. 20 Hình 2.6: Định lượng (I), xác định đột biến với hybrydzation probes (II), xác định đột biến với TaqMan probes (III), Định tính ví dụ xác định gen nào thuộc loài nào (IV) ………………………………………………………………………………………………… 21 Hình 2.7: Cấu trúc vector pCAMBIA1300 dùng để thiết kế gen nhaA, OAT 21 Hình 2.8: Cấu trúc vector pCAMBIA1390/Ubill dùng để thiết kế gen CGS 22 Hình 2.9: Phân tích protein tổng số ........................................................................... 22 Hình 2.10: Sơ đồ các bước chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens ……….. 23 Hình 3.1: Sơ đồ các bước chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.. 32 Hình 3.2: Các giống lúa được trồng trong phytotron.................................................... 32 Hình 3.3: Lượng nước mất đi ở mỗi cây/ 1 ngày ......................................................... 33 Hình 3.4: Sự biến động về số nhánh/ cây, chiều dài lá, trọng lượng tươi, khô của các 34- giống ........................................................................................................ 35 Hình 3.5: Hàm lượng Putresine ở các giống xử lý mặn................................................. 35 Hình 3.6: Hàm lượng Spermidine và Spermine ở các giống xử lý mặn........................... 36 Hình 3.7: Hàm lượng Putresine, Spermidine và Spermine ở các giống xử lý hạn ........... 37 Hình 3.8: Hàm lượng Putresin đo được trong mẫu lá các giống lúa và sự thay đổi của chúng khi xử lý sau 14 ngày với các nống độ NaCl tăng dần từ 0 lên 50 và 100 mM .................................................................................................... 38 Hình 3.9: Biểu hiện của gen Arginindecarboxylase (ADC) trong 7 giống lúa có mức độ chịu mặn khác nhau..................... ……………………………………………………………. 39 Hình 3.10: Hiệu quả hoạt động của các cắp mồi dùng trong phản ứng RT-PCR khi nhân những đoạn gen điều khiển bằng RNA tách chiết từ lúa ............................... 39 Đề tài hợp tác Việt - Đức viii
Hình 3.11: Độ nhạy của phản ứng RT-RT-PCR với các mẫu RNA thu được từ thân (trái) và rễ (phải) cây mạ ................................................................................... 40 Hình 3.12: Đánh giá mức độ biểu hiện của gen điều khiển liên quan đến tính chịu mặn trong cây lúa bằng kỹ thuật RT-RT-PCR với 6 cặp mồi đặc hiệu thiết kế theo số liệu thu được từ ngân hàng gen cây lúa .................................................. 40 Hình 3.13: Kiểm tra đánh giá chất lượng các cặp mồi dùng cho phản ứng mức độ đặc hiệu và hiệu quả nhân các đoạn gen điều khiển bằng cDNA từ RNA cây mạ. Biểu đồ phản ứng theo thời gian ...................................... 41 Hình 3.14: Kiểm tra đánh giá chất lượng các cặp mồi dùng cho phản ứng mức độ đặc hiệu và hiệu quả nhân các đoạn gen điều khiển bằng cDNA từ RNA cây mạ. Biểu đồ tốc độ phản ứng .................................................. 42 Hình 3.15: Hiệu quả hoạt động của các cặp mồi chuyên dụng dùng trong phản ứng RT- RT-PCR khi đánh giá mức độ biểu hiện của các gen điều khiển bằng RNA tách chiết từ hai giống lúa khi xử lý mặn ..................................................... 43 Hình 3.16: Tần suất lặp lại của kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của các gen điều khiển bằng RNA tách chiết từ hai giống lúa khi xử lý nặm bằng phản ứng RT- RT-PCR khi đánh giá .................................................................................. 43 Hình 3.17: Sự phân bố tần xuất gen „cảm ứng do tiếp xúc“ ở các giống lúa tham gia thí nghiệm tại điều kiện đối chứng không có muối vào thời điểm 30&180 phút ... 44 Hình 3.18: Sự phân bố tần xuất gen chịu tác động „cảm ứng“ và „ức chế“ bởi tác động của mặn ở các giống lúa tham gia thí nghiệm tại điều kiện có muối (100 mM) vào thời điểm 30 và 180 phút............................................. ........................ 45 Hình 3.19: Mức độ biểu hiện của những gen điều khiển hoạt động có tính đặc thù riêng của giống khi chịu tác động mặn …………………………………………………………….. 46 Hình 3.20: Tác động của mặn (NaCl) lên độ dẫn điện của dịch bào ở cây mạ hai giống DR2 và Chàm khi bị xử lý các thời gian khác nhau từ 0 đến 24 h .................. 47 Hình 3.21: Kho dữ liệu các phổ nhân tạo của các chất trao đổi từ cây mạ (lúa nước) xác định bằng phương pháp GC-TOF-MS làm nguồn so sánh (bên trái) và phổ GC-TOF-MS của một mẫu đại diện (bên phải) .............................................. 49 Hình 3.22: Glycine N,N-di(trimethylsilyl) -, trimethylsilyl ester được đánh dấu tại vị trí 13 C1 và C2 với đồng vị nặng C, cũng như tại vị trí C2 với hai nguyên tử Deuteri (D). .............................................................................................. 50 Hình 3.23: Biến động của hàm lượng Putrescine và Spermidine trong 4 giống lúa đối chứng...............…………………………………………………………………………………….. 51 Hình 3.24: Sự thay đổi về hiệu suất quang hợp của hệ thống quang hoá II trong điều kiện xử lý hạn nhẹ kéo dài ......................................................................... 52 Đề tài hợp tác Việt - Đức ix
Hình 3.25: Sự thay đổi về hiệu suất quang hợp của hệ thống quang hoá II trong điều kiện xử lý hạn khắc nghiệt ......................................................................... 53 Hình 3.26: Sự thay đổi về hiệu suất quang hợp của hệ thống quang hoá II tại các ngày 0, 4, 5, 6, 7, 8 rút nước để hạn .................................................................. 54 Hình 3.27: Kết quả đo hiệu suất quang hợp (PAM) đối với mảnh lá của các giống lúa có mức độ chịu muối khác nhau theo thời gian xử lý tăng dần nồng độ NaCl …… 54 Hình 3.28: Kết quả chọn lọc và tái sinh cây lúa C71 chuyển gen nhaA ........................... 56 Hình 3.29: Kết quả sàng lọc cây chuyển gen OAT bằng PCR ......................................... 56 Hình 3.30: Sơ đồ vector chuyển gen pCAMBIA1390/Ubiqutin/SAT/HSK/CGS ................... 57 Hình 3.31: Qui trình chuyển gen vào lúa giống Tapei .................................................... 57 Hình 3.32: Kết quả sàng lọc cây chuyển gen bằng PCR với mồi đặc hiệu cho gen CGS được chuyển............ ................................................................................. 59 Hình 3.33: Phổ 23 axit amin chuẩn xác định bằng RP HPLC .......................................... 61 Hình 3.34: Phổ các hợp chất thiols chuẩn xác định bằng RP HPLC ................................. 62 Hình 3.35: Chu trình trao đổi chất methionine và các gen tham gia ............................... 62 Hình 3.36: Các mẫu RNA tổng số sau khi xử lý DNAse, không nhận được sự khuyếch đại nào sau 35 chu kỳ phản ứng ...................................................................... 63 Hình 3.37: Nguyên tắc phân tích axit amin tổng số từ protein ....................................... 64 Hình 3.38: Thành phần amino acid của protein chuẩn BSA và của protein gạo toàn phần.......................................................................................................... 65 Hình 3.39: Kết quả chiết rút protein gạo bằng các dịch đệm khác nhau và phân tích trên điện di PAGE (trên) và định lượng bằng Bradford (dưới)................................ 66 Đề tài hợp tác Việt - Đức x
DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN CHÍNH Học hàm, STT Họ và tên Cơ quan học vị 1 Lê Trần Bình PGS.TS Viện Công nghệ sinh học 2 Nông Văn Hải PGS.TS Viện Công nghệ sinh học 3 Trần Phương Liên TS Viện Công nghệ sinh học 4 Lê Thị Thu Hiền TS Viện Công nghệ sinh học 5 Phan Văn Chi PGS.TS Viện Công nghệ sinh học 6 Nguyễn Thu Hà ThS Viện Công nghệ sinh học 7 Nguyễn Thị Tỵ CN Viện Công nghệ sinh học 9 Lê Xuân Đắc ThS Viện Công nghệ sinh học 10 Lê Văn Sơn TS Viện Công nghệ sinh học 11 Nguyễn Phương Thảo ThS Viện Công nghệ sinh học 12 Nguyễn Thị Hồng Châu ThS Viện Công nghệ sinh học 13 Ellen Zuther TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử 14 A. Heyer TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử 15 Bernd Müller-Röber TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử 16 Joachim Kopka TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử 17 L. Willmitzer GS.TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử 18 Rainer Höfgen TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử 19 Nguyễn Hữu Cường NCS Viện CNSH tại Viện MP và SLTVPT 20 Đỗ Thị Phúc NCS Trường ĐHKHTN tại Viện MP và SLTVPT DANH SÁCH CÁC CƠ QUAN PHỐI HỢP THỰC HIỆN STT Cơ quan phối hợp Nội dung phối hợp 1 Đại học Tổng hợp Greifswald Đào tạo NCS 2 Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử Đào tạo NCS, nâng cao trình độ cán bộ khoa học, trao đổi và phân tích mẫu Đề tài hợp tác Việt - Đức xi
BÀI TÓM TẮT Đề tài “Tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật” được thực hiện phối hợp giữa Viện Công nghệ sinh học, Việt Nam với Viện Max Planck về Sinh học Phân tử thực vật, CHLB Đức do sự chủ trì của PGS.TS. Lê Trần Bình nhằm mục tiêu nâng cao tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật. Trong khuôn khổ nghiên cứu, đề tài được thực hiện và thu được những kết quả chính sau đây: Các kết quả nghiên cứu khoa học 1. Bộ sưu tập 68 giống lúa chịu hạn và chịu mặn của Việt Nam đang được nhân và lưu giữ tại Viện Công nghệ sinh học. 2. Tổng số 33 giống lúa trong đó có 29 giống Indica có nguồn gốc từ Việt Nam và 4 giống Japonica đối chứng được đưa vào nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn và chịu mặn thông qua đánh giá các chỉ tiêu sinh lý, xác định hàm lượng polyamin; mối tương quan giữa hàm lượng polyamin và khả năng chống chịu hạn, mặn; đánh giá mức độ biểu hiện các gen điều khiển các gen cảm ứng khi xử lý hạn và mặn, các chất trao đổi trong rễ và trong lá. 3. Hoàn thiện và tối ưu hóa phương pháp xử lý tính chịu muối và hạn đối với các giống lúa phù hợp với điều kiện ở Việt Nam. Kết quả xử lý mặn thu được 5 giống chịu mặn tốt (Chăm, Chăm biển, IR57311, Cườm và Nước mặn), 7 giống chịu mặn trung bình (CR203, Nước mặn 1, Đốc đỏ, Nếp mặn, Đốc phụng, C71 và Cha va) và 6 giống mẫn cảm (C70, DR2, Lúa mặn, Songhua, Taipei và Nipponbare). Kết quả xử lý hạn thu được 7 giống chịu hạn khá tốt (CR203, Khẩu chăm, Trà lĩnh, IR57311, C70, LC-93-1 và Nếp mèn), 7 giống chịu hạn trung bình (LC-93-4, Cườm, C71, Taipei, Lúa mặn, Lốc dâu, K.lúa nương) và 7 giống mẫn cảm (DR2, LC-93-2, Lốc, Khẩu nón, Khẩu hom, Songhua, Nipponbare). 4. Kết quả xử lý mặn cho thấy (i) Giữa các nhóm có sự khác biệt rất rõ về hàm 1
lượng polyamin, (ii) Các giống mẫn cảm có hàm lượng Putrescine cao hơn hẳn, (iii) Hàm lượng Putrescine tỷ lệ thuận với khả năng chịu mặn, (iv) Hàm lượng Putrescine tăng lên khi xử lý với nồng độ NaCl tăng dần. Hoạt động của enzym Arginindecarboxylase (ADC) ở những giống mẫn cảm tăng lên rất rõ rệt. Thí nghiệm chuyển các gen chủ chốt làm thay đổi hàm lượng polyamin đang được tiến hành. 5. Một ngân hàng dữ liệu về các gen điều khiển phiên mã (TF) với 2512 gen gồm 2261 loci mã hóa và sắp xếp thành 44 họ gen khác nhau, được hoàn thành và công bố trên http://ricetfdb.bio.uni-potsdam.de. Thông qua việc thiết kế hàng trăm cặp mồi đặc hiệu và tiến hành kỹ thuật RT-RT-PCR đã đánh giá được mức độ biểu hiện của các đoạn gen điều khiển khi cây mạ bị xử lý mặn tại hai thời điểm. Kết quả cho thấy: với giá trị abs(log2(FoldChange))>3.32 và hệ số biến đổi đạt khoảng 10 lần hoặc kích thích hoặc ức chế thì ở hai giống nghiên cứu là Chàm và DR2 có đến 12%, tức là 313 gen trong số 2512 gen được coi là cảm ứng hoặc ức chế do mặn. 6. Đối với cây mạ, 132 MSTs đã được xác định. Trong đó có 109 chất thuộc các chất trao đổi sơ cấp, một số chất bị biến đổi thành 2 hoặc nhiều dẫn xuất hóa học do hóa chất sử dụng trong kỹ thuật GC-MS. Tuy nhiên, 148 MSTs của cây mạ chưa được xác định. Khẳng định được những chất trao đổi như Spermidine và Putrescine trong rễ và lá lúa khi bị xử lý hạn và mặn có những thay đổi rất đáng kể. 7. Hệ thống nuôi cấy mô tế bào để chuyển gen vào lúa với nguồn vật liệu ban đầu là hạt lúa chín (thay vì phôi non rất khó chủ động) đã được thiết lập. Chuyển được gen CGS và các gen khác như Serinacetyltransferase, Homoserinkinase và Homoserinkinase (cytosolic) nhằm cải thiện thành phần axít amin trong gạo của các giống lúa Việt Nam đang được thực hiện. Bước đầu thu được các dòng cây chuyển gen phục vụ cho các phân tích tiếp theo. 8. Để có thể định lượng chính xác thành phần axít amin trong gạo, phương pháp thủy phân protein tổng số của hạt gạo bằng vi sóng được hoàn thiện kết hợp với việc tách chiết bằng các hệ dịch đệm khác nhau cho phép hình thành một hệ thống gồm nghiền chiết protein từ gạo, thủy phân bằng vi sóng, tạo dẫn xuất và định lượng với HPLC cho phép phân tích được hàm lượng axít amin trong lượng siêu nhỏ (mg) bột gạo. 2
9. Đã có 13 bài báo khoa học trong đó có 7 bài đăng trên tạp chí trong nước, 4 bài đăng trên tạp chí Quốc tế và 2 poster tham dự Hội nghị Quốc tế. Kết quả phục vụ thực tế Những kết quả thu được góp phần định hướng việc chuyển gen nhằm cải tiến tính chịu hạn và chịu mặn của các giống lúa Việt Nam, đồng thời góp phần xác định cách thức cải tiến chất lượng dinh dưỡng thông qua hàm lượng và thành phần axít amin của protein trong gạo Việt Nam. Qui trình chuyển gen vào cây lúa sẽ được áp dụng đối với các cây trồng khác đồng thời sẽ được chuyển giao cho các Viện nghiên cứu. Cây lúa chuyển gen sẽ được trồng và ứng dụng trong điều kiện Việt Nam. Kết quả đào tạo Đào tạo Nghiên cứu sinh: 1. Nguyễn Hữu Cường - NCS tại CHLB Đức 2. Đỗ Thị Phúc - NCS tại CHLB Đức 3. Lê Xuân Đắc - NCS tại Viện Công nghệ sinh học 4. Nguyễn Phương Thảo - NCS về proteomic cây chuyển gen ở Nhật Đào tạo cao học: 1. Nguyễn Thị Hải Yến - Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống chuyển gen ở lúa Kết quả nâng cao tiềm lực khoa học Hoàn thiện hệ thống chuyển gen, phân tích và đánh giá cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm, nhà kính trồng cây đồng thời phân tích năng suất và chất lượng cây lúa chuyển gen. Có thêm 2 Ngân hàng dữ liệu về gen điều khiển và cấu trúc các chất trao đổi của lúa gạo phục vụ công tác nghiên cứu. 3
LỜI MỞ ĐẦU Lúa nước là cây lương thực quan trọng đứng hàng thứ 3 trên thế giới sau lúa mỳ và ngô. Gạo là nguồn lương thực chủ yếu của hơn một nửa dân số thế giới (chủ yếu ở châu Á và châu Mỹ La tinh), điều này làm cho nó trở thành loại lương thực được con người tiêu thụ nhiều nhất. Trong danh sách các cây ngũ cốc như: lúa mỳ, lúa mạch, ngô, cao lương, kê.... thì genome của cây lúa nước được coi là nền tảng cho bộ gen của các cây ngũ cốc khác. Chính vì vậy mà Chương trình giải mã genom cây lúa (Rice Genome Project) được lựa chọn để tiến hành và đã hoàn thành vào tháng 3 năm 2004 mở ra khả năng tiến hành hàng loạt các nghiên cứu hậu genomic, trong đó bao gồm các nghiên cứu về những gen liên quan đến tính chịu mặn và chịu hạn của cây lúa, cũng như các gen liên quan đến chất lượng của hạt gạo. Sử dụng các trang thiết bị phân tích hiện đại như: đo huỳnh quang diệp lục, phân tích khối phổ GC/MS, sắc ký lỏng cao áp, PCR định lượng (RT-RT-PCR), đồng thời với việc khai thác triệt để các Ngân hàng dữ liệu về genom của cây lúa nhằm tìm ra các yếu tố điều khiển, các chất chỉ thị liên quan đến tính chống chịu là một phần nội dung của đề tài. Phần thứ hai là dùng các phương pháp nuôi cấy tế bào, chuyển gen vào cây lúa và khai thác các dòng lúa mang bộ gen bị khiếm khuyết do loại thải (knock-out) nhằm mục tiêu tìm ra cơ chế chống chịu, biện pháp tăng cường tính chống chịu và chất lượng lúa gạo ở mức độ phân tử. Nội dung nghiên cứu của đề tài này mang tính nghiên cứu cơ bản có định hướng sâu sắc và lâu dài, đòi hỏi nhiều thời gian, trang thiết bị tiên tiến, cách tiếp cận hiện đại và phạm vi hợp tác rộng lớn (Ngân hàng dữ liệu gen các tác nhân TF ở lúa và cây khác, Ngân hàng phổ GC/MS và cấu trúc phân tử các chất trao đổi, Ngân hàng các dòng lúa (KO). Kết quả thu được ban đầu là rất khả quan cho thấy cách đặt vấn đề và hướng tiếp cận là phù hợp và mang lại hiệu quả. Tuy nhiên, cần nhiều thời gian tiếp tục nghiên cứu thì mới đi đến được những kết luận chắc chắn, mang tính lý luận và thực tiễn cao. 4
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1.1. Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước Vai trò của một số nhóm chất như: proline, glycine betaine, fructant, manitol... liên quan đến tính chống chịu của thực vật với điều kiện bất lợi của môi trường đặc biệt là hạn và mặn đã được khẳng định. Hiện nay một số gen liên quan đến chất lượng thực phẩm như gen làm tăng hàm lượng methionine (CGS), tryptophan, lysine, cysteine (SAT)... cũng đã được công bố. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen đối với tính chống chịu và cải biến chất lượng ở lúa luôn là những nội dung nghiên cứu chính ở nhiều Viện nghiên cứu lớn trên thế giới. Có khá nhiều phương pháp để tìm kiếm các gen liên quan đến tính chống chịu như: (i) Tìm trên mạng trình tự đã công bố, thiết kế primer và nhân dòng bằng DNA của đối tượng quan tâm, sau đó so sánh trình tự và thiết kế vào vector để sử dụng; (ii) Kỹ thuật sàng lọc cDNA dựa trên nguyên tắc kích thích cho gen cần tìm hoạt động; (iii) Thông qua nghiên cứu hệ proteomics để tìm các protein mới có hoạt tính dưới tác động của điều kiện môi trường hay nhu cầu của các giai đoạn sinh trưởng phát triển bằng kỹ thuật 2D kết hợp với các phân tích khối phổ và so sánh với ngân hàng dữ liệu gen mà biết được trình tự axít amin của protein và trình tự nucleotit của gen đó. Cho đến nay, nhiều gen liên quan đến tính chống chịu đã được phân lập chủ yếu bằng các phương pháp trên và đã được ứng dụng để nâng cao tính chống chịu trên đối tượng cây thuốc lá, lúa mỳ, lúa nước... như: gen nhaA (chịu mặn), gen HAL, gen codA, betA, nhóm gen RAB, gen P5CS, gen OAT (chịu hạn)... Hiện nay Viện Sinh lý Phân tử thực vật Max - Planck, CHLB Đức đang có những nghiên cứu sâu và rất thành công về vai trò của một số hợp chất như polyamin, đường tan, axít béo...dưới điều kiện bất lợi ở lúa thông qua kỹ thuật ức chế gen bằng RNA và các phương pháp phân tích bằng quang phổ khối. Cơ sở của phương pháp như sau: Trường hợp phân lập gen, bao gồm các bước: i) Tách chiết mRNA từ các giống lúa có tính chống chịu ở các vùng sinh thái khác nhau dưới điều kiện stress và không stress. 5
ii) Tạo ngân hàng cDNA bằng enzym sao chép ngược. iii) Tạo các vi bản trên màng chuẩn (15000). iv) Lai với cDNA không xử lý. v) Thu các dòng lai dương tính và nhân bản các dòng lai bằng PCR. vi) Đọc trình tự và thiết kế gen cho mục đích chuyển gen. Trường hợp phân tích phổ chất: i) Tách chiết các chất từ các giống lúa xử lý và không xử lý. ii) Phân tích phổ chất bằng kỹ thuật sắc ký khí hoặc quang phổ kế. iii) So sánh phổ chất giữa giống chống chịu và giống không chống chịu trong điều kiện bất lợi và điều kiện thường. 1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước Hiện nay các kỹ thuật dùng để xác định sự gia tăng một số chất liên quan đến tính chống chịu ở cây lúa như proline và các đường tan... đang được sử dụng rất hiệu quả để đánh giá tính chống chịu của cây trồng đối với điều kiện bất lợi ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới cũng đã được sử dụng ở Việt Nam. Ở Việt Nam, kỹ thuật phân lập gen đi từ cDNA cũng đã được triển khai nghiên cứu tại Viện Công nghệ Sinh học. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu tìm kiếm các gen cũng mới chỉ được tiến hành nghiên cứu ở cây đu đủ đối với bệnh vi rút đốm vòng và tính chịu hạn ở đậu tương song chưa được nghiên cứu cho các giống lúa Việt Nam. Viện Công nghệ sinh học đang xây dựng một dự án hợp tác với Viện Max Planck về Sinh học phân tử thực vật, Trường Đại học Tổng hợp Greifswald, CHLB Đức theo hướng nghiên cứu Tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật. Dự án được Bộ Đào tạo và Nghiên cứu Đức tài trợ về kinh phí. Kinh phí này chủ yếu dành để cán bộ của Việt Nam sang học phương pháp và làm việc ở Đức trên đối tượng là các giống lúa của Việt Nam. Sự hợp tác này là một điểm thuận lợi để chúng ta có thể nhanh chóng tiếp cận với kỹ thuật hiện đại để phân lập tìm kiếm các gen cũng như các phương pháp nghiên cứu phân tích xác định phổ các chất (polyamin, proline, axít béo, ABA...) có liên quan đến tính chịu hạn và mặn nhằm đưa ra được các phương pháp cải biến tính chống chịu ở lúa. Vì thế, việc triển khai kỹ thuật này tại Việt Nam là rất cần thiết, giúp cho Việt Nam có thêm một 6
công cụ hiện đại về Sinh học phân tử để cải biến tính chống chịu của các giống lúa Việt Nam với các điều kiện bất lợi môi trường. Trên cơ sở của những phương pháp này, những nghiên cứu tương tự sẽ được triển khai trên một số đối tượng cây trồng khác như ngô và đậu tương. 1.3. Mục tiêu của đề tài Tìm kiếm, đánh giá, phân lập và sử dụng các gen nhằm nâng cao khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa và chất lượng tinh bột của hạt gạo thông qua các kỹ thuật phân tử và biến nạp gen. Các mục tiêu cụ thể i) Nghiên cứu vai trò của polyamin đối với khả năng chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa thông qua các kỹ thuật ức chế gen bằng RNA. ii) Nghiên cứu phát hiện các gen điều khiển tính chịu hạn và chịu muối bằng phổ phiên mã RNA từ những giống lúa chống chịu. iii) Phân tích phổ trao đổi chất ở rễ của các giống lúa (chống chịu và không chống chịu với hạn và muối) trong điều kiện stress bằng kỹ thuật sắc ký khí/quang phổ khối. iv) Chuyển gen tăng cường tính chịu hạn và mặn, tăng cường hàm lượng axít amin vào cây lúa. Trong nội dung hợp tác của dự án với Đức có phần nghiên cứu thực hiện tại Việt Nam từ 2002 đến 2005. Các nội dung của đề tài được thực hiện tốt nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Bộ dành cho việc đón tiếp chuyên gia bạn sang làm việc và gửi cán bộ sang Đức làm việc để thực hiện các nội dung nghiên cứu tại Việt Nam. 7