Báo cáo y học: "NGHIêN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CHẾ PHẨM PANTOGIN"

Chia sẻ: Nguyễn Lê | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

320
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Pantogin được bào chế từ sâm nhung, là “loại thuốc bổ đầu tay”. Thành phần có hoạt tính chủ yếu của nhân sâm là hỗn hợp 30 triterpenoid saponin, được gọi là các ginsenoside, chúng thể hiện những tác dụng sinh học rất đa dạng trong đó có tác dụng chống oxy hoá. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của chế phẩm có nguồn gốc tự nhiên dựa trên các chỉ tiêu: đo thiobarbituric acid reacted substances (TBA-RS), protein carbonyl trong mô gan chuột thực nghiệm gây độc cho gan bằng carbon tetraclorid (CCl4)....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo y học: "NGHIêN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CHẾ PHẨM PANTOGIN"

NGHIêN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CHẾ PHẨM PANTOGIN Phạm Thành Suôl* Phạm Hùng Lực* Nguyễn Văn Minh** Trịnh Văn Lẩu*** TÓM T¾t Pantogin được bào chế từ sâm nhung, là “loại thuốc bổ đầu tay”. Thành phần có hoạt tính chủ yếu của nhân sâm là hỗn hợp > 30 triterpenoid saponin, được gọi là các ginsenoside, chúng thể hiện những tác dụng sinh học rất đa dạng trong đó có tác dụng chống oxy hoá. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của chế phẩm có nguồn gốc tự nhiên dựa trên các chỉ tiêu: đo thiobarbituric acid reacted
substances (TBA-RS), protein carbonyl trong mô gan chuột thực nghiệm gây độc cho gan bằng carbon tetraclorid (CCl4). * Từ khoá: Pantogin; Tác dụng chống oxy hoá. STUDY OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF PANTOGIN Pham Thanh Suol Pham Hung Luc Nguyen Van Minh Trinh Van Lau SUMMARY As one of the most tonic traditional medications, combination of ginseng and cornu cervi were studied and developed into a modern product
pantogin. The main active ingredients of ginseng contains a mixture of over 30 triterpenoid saponins, commonly referred to as ginsenosides, which have manifested a variety of bio-activities, including antioxydant effects. Methods to evaluate the antioxydant activity of products of natural origin are based on certain criteria such as measuring thiobarbituric acid reacted substances (TBA-RS) and protein carbonyl (PC) contents in hepatic tissues of mice whose liver injury has been induced by CCl4. * Key words: Pantogin; Antioxidant activity. được quan tâm để ứng ĐẶT VẤN ĐỀ Những năm gần đây, dụng trên người. đặc tính chống oxy hóa của các loại thảo dược đã
Pantogin được bào chế là sự kế thừa những từ các dược liệu quý như thành quả của y học Cổ sâm, nhung, là “thuốc bổ truyền và kinh nghiệm đầu tay”. Sản phẩm này * Tr-êng §¹i häc Y D-îc CÇn Th¬ ** Häc viÖn Qu©n y *** ViÖn KiÓm nghiÖm thuèc TW Ph¶n biÖn khoa häc: PGS. TS. Vò M¹nh Hïng
dân gian, đồng thời vận do gây ra. Từ thực tiễn dụng những tiến bộ của trên, chúng tôi thực hiện khoa học hiện đại để đề tài này nhằm góp nghiên cứu, hiện đại hoá phần làm sáng tỏ cơ chế dạng bào chế với mong tác dụng của những muốn giữ được tác dụng thuốc có chứa nhân sâm, vốn có của bài thuốc. để có cơ sở bảo tồn và Thành phần có hoạt tính phát huy những vốn quý chủ yếu của nhân sâm là của nền y dược học Cổ hỗn hợp > 30 triterpenoid truyền Việt Nam, góp saponin thường được gọi phần đáp ứng nhu cầu sử là các ginsenoside, chúng dụng thuốc của nhân dân. có tác dụng sinh học rất đa dạng, trong đó có tác dụng chống oxy hoá, bảo ĐỐI TƯỢNG, vệ tế bào gan tránh khỏi NGUYÊN VẬT LIỆU tổn thương do tác nhân như hoá chất, các gốc tự 19
VÀ PHƯƠNG PHÁP Coomassie (Bradford), 2, NGHIÊN CỨU 4 - dinitrophenylhydrazin 1. Đối tượng, nguyên (2,4-DNPH 0,2%), guanidinchlorid 6M vật liệu nghiên cứu. (pH6,5) (Merck), acid - Pantogin dựa trên thiobarbituric (TBA công thức gồm: nhân 0,5%) (Merck), acid sâm, nhung hươu, sữa trichloroacetic (TCA ong chúa. 20%) (Unichem), carbon - Động vật thử nghiệm: tetrachloride (Unichem), chuột nhắt trắng (đực) chất chuẩn giống DDY, trọng lượng Malonaldehyde bis 22 ± 2 g (5 - 6 tuần tuổi), (Sigma - Aldrich), chất do Viện Pasteur TP. Hồ chuẩn BSA (bovine Chí Minh cung cấp. serum albumin) (Sigma). - Nguyên liệu, hoá chất Đo phổ hấp thu UV của khảo sát tính chống oxy mẫu thử trên máy U- hoá: 20
UV/VIS protein toàn phần trong 1900 Specphotomether 200 V các mẫu thử nghiệm, thực (Hitachi), máy nghiền hiện theo quy trình thử đã đồng thể Sonicator 3080 được công bố. (USA). * Xác định hàm lượng 2. Phương pháp TBA-RS: nghiên cứu. TBA-RS là một trong Đánh giá hoạt tính các sản phẩm trung gian chống oxy hoá dựa theo của quá trình peroxy hóa phương pháp xây dựng lipid màng tế bào, khi đường chuẩn MDA, cho phản ứng với acid protein toàn phần, định thiobarbituric, một phân lượng thiobarbituric acid tử TBA-RS phản ứng với reacted substances (TBA- hai phân tử thiobarbituric RS) và định lượng PC tạo phức màu hồng hấp (protein carbonyl). Tính thu cực đại ở bước sóng toán kết quả theo lượng 532 nm. Phản ứng được 21
thực hiện ở môi trường gian thử khác nhau: pH 2 - 3, nhiệt độ 90 - nghiệm phòng ngừa 7 100oC trong vòng 60 ngày gây độc gan, 10 phút. Đo cường độ màu ngày gây độc gan, 14 của phức suy ra lượng ngày gây độc gan. Tất cả TBA-RS có trong mẫu. chuột được giết, lấy gan Nếu lượng TBA-RS cho thử nghiệm mô học giảm so với mẫu chứng, và hoá sinh: lô 1 mẫu được xác định là có (chứng): nước cất, dầu hoạt tính chống oxy hóa. ôliu; lô 2: nước cất, CCl4; Cách tiến hành: chia lô 3: thuốc thử, CCl4. chuột thành 9 lô, mỗi lô Cân lấy 50 mg gan (vì 10 con và uống nước cất tính toán dựa vào lượng (0,1 ml/10 g), dầu ôliu protein phần) toàn (0,4 ml/kg, SC), CCl4 nghiền mô tạo dịch đồng (0,025 ml/kg, SC). Thử thể 5% trên máy nghiền nghiệm thuốc với thời đồng thể trong dung dịch 22
đệm phosphat buffer Tất cả các giai đoạn từ saline (PBS, pH 7,4). Ly lấy mẫu, cân cho đến tâm (lượng protein đã nghiền mẫu đều được được loại hết) lấy 200 µl tiến hành ở nhiệt độ 0 - dịch, thêm 500 µl nước 40C. cất, 100 µl SDS 10%. Ủ * Xác định hàm lượng hỗn hợp ở 37oC trong 30 protein carbonyl: phút. Thêm 500 µl HCl Protein carbonyl được 0,1 N, lắc kỹ 15 phút. Ly sinh ra trong quá trình tâm, dùng micropipette oxy hóa protein, khi cho hút 1 ml dịch, thêm vào phản ứng với 2,4- 250 µl TBA 0,5%. Đun dinitrophenylhydrazin cách thủy ở 95 C trong o (DNPH) tạo tủa, hoà tan 60 phút. Để nguội đến tủa trong guanidinchlorid nhiệt độ phòng. Đo cho dung dịch có màu quang phổ ở bước sóng vàng, đo quang phổ ở 532 nm. bước sóng 370 nm. 23
* Cách tiến hành: giết THÀNH (µl) (µl) (mM chuột lấy gan (50 mg), PHẦN nghiền mẫu mô tạo dịch 100 mM đồng thể 6,7% trên máy PBS (pH 320 320 nghiền đồng thể trong 7,2) dung dịch đệm PBS pH 80 mM 6,5. Ly tâm lấy dịch. Tất 20 20 FeSO4.7H2O cả các giai đoạn từ lấy mẫu, cân cho đến nghiền 8 mM 20 20 mẫu đều được tiến hành FeCl3.6H2O 20 20 ở nhiệt độ 0 - 4 C. 0 4 M KCl Bảng 1: Hỗn hợp phản 0,4 M 20 20 ứng định lượng protein MgCl2.2H2O 200 200 Mẫu thử carbonyl. Sau phản ứng ỐNG ỐNG ớc ỒNG Nư N cất 120 120 CHỨNG THỬ ĐỘ 24
trong 1,2 ml Tổng cộng 720 720 guanidinchloride 6 M, ly tâm, lấy dịch, đo quang Ủ hỗn hợp ở 30oC phổ ở bước sóng 370 nm. trong 30 phút. Cho vào * Xác định hàm lượng hỗn hợp 720 µl TCA protein toàn phần: phản 20%, ly tâm bỏ dịch. ứng tạo màu của protein Thêm vào ống chứng 720 và coomassie. µl HCl 2 N, ống thử 720 Phương pháp tiến µl 2,4-DNPH 0,2%, lắc hành: pha các mẫu đo nhẹ trong 60 phút. Thêm theo bảng 2. Đo quang vào mỗi mẫu 720 µl phổ ở bước sóng 595 nm. TCA 20%, vortex 10 giây, ly tâm (3.000 vòng Bảng 2: Thành phần x 15 phút). Rửa cắn 3 lần hỗn hợp phản ứng định với 1,5 ml dung dịch lượng protein toàn phần. ethanol/ethyl acetat (tỷ lệ 1:1), để khô. Hòa tan 25
ỐNG ỐNG THÀNH CHỨNG THỬ yếu tố với t-test. Giá PHẦN trị p < 0,05 được xem Nước 500 µl 498 là khác biệt có ý µl Coomassie 500 µl nghĩa thèng kê. 500 Dịch gan * Địa điểm nghiên µl cứu: Bộ môn Dược 2 µl lý, Khoa Dược, Đại 1 ml học Y Dược TP. Tổng cộng 1 ml HCM. * Thời gian nghiên * Xử lý số liệu: cứu: từ tháng 3 ®Õn 6 Xử lý số liệu bằng năm 2009. phương pháp thống kê y * Khảo sát mô học: lấy -.sinh học: phân tích mẫu mô gan ở các lô thử phương sai một nghiệm, nhuộm theo phương pháp 26
hematoxylin-eosin, thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Đại học Y Dược TP. HCM. kÕT QUẢ NGHIÊN CỨU * Kết quả xác định hàm lượng TBA-RS và protein carbonyl: 0.6 0.9 y = 0 .058x + 0.058 y = 0.027x + 0.0118 0.8 2 0.5 R = 0.9995 2 R = 0.9997 0.7 0.4 0.6 0.3 A 0.5 A 0.4 0.2 0.3 0.1 0.2 0 0.1 0 2 4 6 8 10 0 0 5 10 15 20 25 30 35 mg/ml nmol/ml Biểu đồ 1: Phương trình Biểu đồ 2: Phương đường trình đường chuẩn protein toàn phần. chuẩn TBA-RS. 27
Sau khi có kết quả đo độ hấp thu, thay vào đường chuẩn để tính toán hàm lượng TBA-RS (nmol/ml), tương tự thì cũng thay vào đường chuẩn để tính lượng protein toàn phần (mg/ml). Sau đó tính toán lượng TBA-RS theo lượng protein toàn phần. Nmol/ml = nmol/mg Mg/ml Bảng 3: Hàm lượng TBA-RS (nmol/mg protein). HÀM LƯỢNG TBA-RS HTCO(*) (%) (nmol/mg protein) 28
Lô thử nghiệm dự phòng 7 ngày gây độc gan Nước cất + dầu 2,0890 ± 0,2353 ôliu Nước cất + 3,4206 ± 0,3579 0 CCl4 (1) (2) (3) Thuốc + CCl4 1,7279 ± 0,2897 49,49 Lô thử nghiệm dự phòng 10 ngày gây độc gan Nước cất + dầu 1,9142 ± 0,2247 ôliu Nước cất + 3,4341 ± 0,1396 0 CCl4 Thuốc + CCl4 1,647 ± 0,2141 52,04 Lô thử nghiệm dự phòng 14 ngày gây độc gan 29
Nước cất + dầu 2,3300 ± 0,1799 ôliu Nước cất + 0 3,4740 ± 0,2410 CCl4 Thuốc + CCl4 1,3923 ± 0,1323 59,92 HTCO(*) (%): hoạt tính chống oxy hoá tính theo TBA-RS. 4.5 4.5 4 4 3.5 3.5 3 MDA (nmol/mg protein) 3 MDA (nmol/mg protein) 2.5 2.5 2 2 1.5 1.5 1 1 0.5 0.5 TBA-RS TBA-RS 0 0 Dầu oliu CCl4 + thuốc CCl4 Dầu oliu CCl4 + thuốc CCl4 30
Biểu đồ 3: Kết quả Biểu đồ 4: Kết quả khảo khảo sát hàm lượng sát hàm lượng TBA-RS TBA-RS ở thử nghiệm ở thử nghiệm dự phòng dự phòng 10 ngày gây 14 ngày gây độc. độc. So sánh TBA-RS trong gan với HTCO(*) (%) được tính với nhóm gây độc cho gan b»ng CCl4. Nếu xem HTCO(*) (%) của nhóm gây độc cho gan b»ng CCl4 là 0% thì HTCO(*) (%) của thử nghiệm thay đổi như sau: - Sau 7 ngày dùng thuốc dự phòng, thuốc thể hiện HTCO(*) (%) 49,49% (p < 0,05). Sau 10 ngày dùng thuốc dự phòng, HTCO(*) - (%) tăng lên 52,04% (p < 0,01). 31
Sau 14 ngày dùng thuốc dự phòng, thuốc thể - hiện HTCO(*) (%) cao nhất (59,92%) (p < 0,001). Bảng 4: Kết quả xác định hàm lượng protein carbonyl. HÀM LƯỢNG PC LÔ THỬ HTCO(*) (%) (µmol/mg protein) Lô thử nghiệm dự phòng 7 ngày gây độc gan Nước cất + 1,1798 ± dầu ôliu 0,1252 Nước cất + 1,5214 ± 0 CCl4 0,1206 Thuốc + CCl4 30,01 1,0637 ± 32
0,1097 Lô thử nghiệm dự phòng 10 ngày gây độc gan Nước cất + 1,1627 ± dầu ôliu 0,1083 Nước cất + 1,49 ± 0,17 0 CCl4 Thuốc + CCl4 0,883 ± 40,74 0,0538 Lô thử nghiệm dự phòng 14 ngày gây độc gan Nước cất + 1,1571 ± dầu ôliu 0,1079 Nước cất + 1,5441 ± 0 CCl4 0,0893 Thuốc + CCl4 53,66 0,7155 ± 33
0,0459 2 1.8 1.8 PC (nmol/mg protein) 1.6 1.6 PC(nmol/mg protein) 1.4 1.4 1.2 1.2 1 1 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 Dầu oliu CCl4 + thuốc Dầu oliu CCl4 + thuốc CCl4 CCl4 Biểu đồ 5: Thay ®ổi hàm Biểu đồ 6: Thay ®ổi hàm lượng PC trong gan ở thử lượng PC trong gan ở thử nghiệm 10 ngày dự nghiệm 14 ngày dự phòng gây độc. phòng gây độc. So sánh protein carbonyl trong gan với HTCO(*) (%) với nhóm gây độc cho gan b»ng CCl4. Nếu xem HTCO(*) (%) của nhóm gây độc cho gan b»ng CCl4 34