Báo cáo y học: "phát hiện virut viêm gan C trên Bệnh nhân viêm gan cấp tính bằng phản ứng RT-PCR"

Chia sẻ: Nguyễn Phương | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:19

Thêm vào BST

Báo xấu

111
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Từ 7 mẫu huyết thanh của bệnh nhân (BN) được chẩn đoán viêm gan, sử dụng phản ứng RT-PCR phát hiện hệ gen HCV và xác định 3 mẫu huyết thanh anti-HCV dương tính cho kết quả có ARNHCV. Trong 7 mẫu huyết thanh BN viêm gan cấp tính, 3 mẫu xác định có virut viêm gan C thuộc nhóm Hepacivirus trong họ Flaviviridae và 4 mẫu còn lại không chứa ARN-HCV. Qua đó cho thấy, ARN-HCV tồn tại trong huyết thanh cung cấp nguồn gen làm khuôn cho phương pháp RT-PCR, có thể sử dụng chẩn đoán sớm và...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo y học: "phát hiện virut viêm gan C trên Bệnh nhân viêm gan cấp tính bằng phản ứng RT-PCR"

phát hiện virut viêm gan C trên Bệnh nhân viêm gan cấp tính bằng phản ứng RT-PCR Lê Thanh Hà* Hoàng Quang* Lê Thanh Hòa** Tóm tắt Từ 7 mẫu huyết thanh của bệnh nhân (BN) được chẩn đoán viêm gan, sử dụng phản ứng RT-PCR phát hiện hệ gen HCV và xác định 3 mẫu huyết thanh anti-HCV dương tính cho kết quả có ARN- HCV. Trong 7 mẫu huyết thanh BN viêm gan cấp tính, 3 mẫu xác định có virut viêm gan C thuộc nhóm Hepacivirus trong họ Flaviviridae và 4 mẫu còn lại không chứa ARN-HCV. Qua đó cho thấy, ARN-HCV tồn tại trong huyết thanh cung cấp nguồn
gen làm khuôn cho phương pháp RT-PCR, có thể sử dụng chẩn đoán sớm và phát hiện tái nhiễm. * Từ khoá: RT-PCT; Virut viêm gan C; ARN- HCV; Anti-HCV; Viêm gan cấp tính. Detection of hepatitis C virus in patients with acute hepatitis by RT-PCR Le Thanh Ha Hoang Quang Le Thanh Hoa Summary Of 7 plasma samples of patients with hepatitis, RNA- HVC were detected 3 positive anti-HCV plasma samples by RT-PCR and 4 samples were not. HCV in plasma samples belongs to Hepacivirus
group of the family Flaviviridae. This finding showed that RNA-HCV exists in serum providing the RNA genomic source for RT-PCR to detect HCV for early diagnosis and re-infection of HCV. * Key words: RT-PCR; Hepatitis C virus; RNA- HCV; Anti-HCV; Acute hepatitis. nhiễm HCV ở Việt Nam Đặt vấn đề có xu hướng ngày càng tăng, do hệ thống sàng Nhiễm virut viêm gan lọc máu còn lạc hậu và C (HCV) là một trong số người tiêm chích ma những nguyên nhân quan túy dùng chung bơm kim trọng dẫn đến viêm gan tiêm ngày càng gia tăng mạn tính, xơ gan và ung [1, 2]. thư tế bào gan nguyên phát trên thế giới. Tỷ lệ * Bệnh viện 103
** Viện Công nghệ Sinh học Phản biện khoa học: GS. TS. Nguyễn Văn Mùi Hiện nhiều đó mới nhân vùng gen nay, phương pháp khác nhau cần nghiên cứu bằng đã được sử dụng để chẩn phản ứng PCR. Đây là đoán HCV nhưng độ đặc một kỹ thuật xét nghiệm hiệu chưa cao và chỉ phát sử dụng sinh học phân tử hiện được bệnh ở giai nhạy và đặc hiệu, hỗ trợ đoạn muộn. Phản ứng đắc lực cho việc tiên RT-PCR đã giúp phát lượng và đánh giá quá hiện HCV ở giai đoạn trình điều trị viêm gan C sớm, chính xác và đặc [3]. hiệu. Do hệ gen HCV là Phương pháp sinh học ARN, nên trước đó cần phân tử đã được sử dụng có phản ứng chuyển đổi phổ biến ở nhiều nước ARN thành ADN gọi là trên thế giới để phát hiện sao chép ngược (RT), sau virut viêm gan nói chung
và viêm gan C nói riêng phát hiện HCV từ ARN- [5, 6]. ở Việt Nam, việc HCV tồn tại trong mẫu áp dụng sinh học phân tử huyết thanh và khẳng vào chẩn đoán bệnh viêm định đây là một kỹ thuật gan do virut còn rất hạn xét nghiệm phân tử chính chế. Từ nhu cầu thực tiễn xác, có thể ứng dụng trên, đặc biệt đối với trong sàng lọc HCV ở HCV, chúng tôi đặt vấn các mẫu máu/huyết đề nghiên cứu sử dụng thanh. phản ứng RT-PCR phát đối tượng và phương hiện HCV trên BN viêm pháp nghiên cứu gan cấp tính. Trong bài báo này, 1. Đối tượng nghiên chúng tôi giới thiệu kết cứu. quả thực hiện RT-PCR ARN-HCV được tách sử dụng vùng gen 5’UTR từ 7 mẫu huyết thanh của (untranscribed region), 7 BN viêm gan cấp tính.
Phản ứng Phương RT-PCR 2. pháp được sử dụng là phản nghiên cứu. * Phương pháp tách ứng một bước (one-step của RT-PCR) hãng ARN tổng số: QIAGEN [4], với mồi Tách chiết ARN tổng xuôi ký hiệu CC1F, là số các mẫu bệnh phẩm 5’- virut viêm gan C có sử CAGAAAGCGTCTAG dụng bộ QiaAmp Viral CCATGG-3’, bao gồm Kit của hãng QIAGEN 20 nucleotid, vị trí 69-88 (Mỹ). Tách chiết ARN ở phần đầu của hệ gen tổng số bằng bộ kit này HCV; và mồi ngược ở nhiệt độ phòng 15 - CC2R là..5’- 250C. GAGGTTTAGGATTC * Phương pháp tiến GTGCTC-3’, bao gồm hành phản ứng RT- 20 nucleotid, vị trí 363- PCR: 344 ở phần đầu của hệ gen HCV. Sản phẩm
đoạn ADN của vùng giao gồm: gen 5’ UTR và gen C của Bước 1: 500C trong 45 HCV có độ dài 295 bp. phút: 1 chu kỳ. Nguyên liệu phản ứng Bước 2: 940C trong 15 RT-PCR. phút: 1 chu kỳ. Dung môi phản ứng Các bước 3, 4, 5 thực (2x reaction hiện lặp đi lặp lại trong mix): 12,5ml; enzym sao 45 chu kỳ: ngược chép (RT- Bước 3: 940C trong 1 platinum): 1ml; mồi xuôi phút. (10pmol/ml): 1,5ml; mồi Bước 4: 540C trong 45 (10pmol/ml): giây. ngược 1,5ml; 6,5ml; nước: Bước 5: 720C trong 1 khuôn (ARN tổng số): phút. 2ml Bước 6: 720C trong 7 Chu trình nhiệt của phút: 1 chu kỳ. phản ứng RT-PCR, bao
Sau đó bảo quản sản Phòng dịch Quân đội. phẩm ở nhiệt độ lạnh Tất cả các BN này đều 40C. nhập viện với chẩn đoán Sản phẩm của phản là viêm gan cấp tính. Các ứng RT-PCR được phát mẫu huyết thanh được ký hiện khi cho điện di trên hiệu HC1, HC2, HC3, HC4, HC5, HC6, HC7. thạch agarose 0,8%. Bảng 1: Kết quả xác định các marker virut. kết quả và bàn luận HC1 HC2 HC3 HC4 HC5 1. Kết quả thu thập mẫu. Anti- - - - - - Thu thập 7 mẫu máu HAV tách huyết thanh của BN HBsAg - - - - - viêm gan virut cấp tại nhiễm, Anti- Truyền Khoa + + + - - Bệnh viện 103 và Khoa HCV Vi sinh vật, Viện Vệ sinh
* Chỉ có 3 mẫu cho kết chứa ARN tổng số, có quả dương tính. thể sử dụng làm khuôn 2. Kết quả tách ARN để tiến hành phản ứng tổng số từ huyết thanh RT-PCR. BN. M 1 2 3 Lấy 3 mẫu HC1, HC2, 23.0kb HC3 có kết quả anti- 9.4kb 6.5kb 4.3kb 2.3kb HCV (+), tiến hành tách 2.0kb 0.5kb ARN tổng số. ARN tổng ARN tæ s ng è số là hỗn hợp các loại ARN, trong đó có thể có cả ARN của hệ gen HCV và sau khi tách được kiểm thạch tra trên agarose 0,8% (hình 1). Kết quả cho thấy cả 3 mẫu huyết thanh này đều
Hình 1: Kết quả điện di tôi sử dụng cặp mồi đặc ARN tổng số trên hiệu là CC1F và CC2R. thạch agarose 0,8%. Tính đặc hiệu và độ nhạy của cặp mồi khi thực hiện phản ứng RT- M: Chỉ thị ADN (sử PCR được Caudai và CS dụng hệ gen của thực (1998) chứng minh rất khuẩn thể Lambda (l) cắt cao [4]. Điện di kiểm tra bằng enzym giới hạn sản phẩm RT-PCR cho HindIII). Đường chạy 1- thấy, 3 băng ADN có độ 3: 3 mẫu ARN tổng số dài khoảng 300 bp hiển lần lượt tách từ huyết thị rõ trên thạch (hình 2), thanh của các BN HC1, độ dài sản phẩm đúng HC2, HC3. như dự đoán. 3. Kết quả thực hiện M 1 2 3 RT-PCR. Để xác định chuỗi 23.0kb 9.4kb 6.5kb ARN của HCV, chúng 4.3kb 2.3kb 2.0kb 0.5kb ~300 bp
3: Các sản phẩm RT- PCR có độ dài khoảng 300 bp. Với kết quả thu nhận đ- ược sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR, chúng tôi cho rằng toàn bộ quy trình kỹ thuật của phản ứng RT-PCR được Hình 2: Kết quả phản thực hiện với ARN tổng ứng PCR của số làm khuôn từ 3 mẫu đoạn gen HCV. trên (thành phần phản ứng, trình tự nucleotid M: Chỉ thị ADN (sử của mồi CC1F, CC2R và dụng hệ gen Lambda (l) chu trình nhiệt) hoàn cắt bằng enzym giới hạn toàn đặc hiệu với HCV HindIII); Đường chạy 1-
và cho kết quả chính thu tại Hà Nội chính thức được xác định là HCV xác. 4. Kết quả giải trình thuộc nhóm Hepacivirus trong họ Flaviviridae. trình tự. 5. ứng dụng RT-PCR bộ chuỗi Toàn nucleotid của đoạn ADN phát hiện HCV trên thu nhận từ các mẫu một số mẫu huyết HC1, HC2, HC3 được thanh BN viêm gan cấp giải trình trình tự bằng tính. máy đọc trình tự ABI Sau khi xác định được Genetic quy trình kỹ thuật phát Avant 3100 Analyzer (Mỹ) tại Viện hiện virut HCV bằng Công nghệ Sinh học. Với sinh học phân tử trên 3 kết quả truy cập Ngân mẫu đại diện, thực hiện hàng gen, ARN của virut phản ứng RT-PCR trên 4 gây bệnh viêm gan có mẫu huyết thanh BN còn trong 3 mẫu huyết thanh lại cùng với đối chứng
âm tính (-) (khuôn ARN và kháng thể anti-HCV được thay bằng nước tinh trong huyết thanh dương khiết) đối chứng tính. Phản ứng RT-PCR và dương tính (+) (3 mẫu đã sử dụng nguồn khuôn xác định có chứa ARN- ARN-HCV trong huyết HCV). Kết quả điện di thanh có lợi để chẩn trên thạch agarose 0,8% đoán sớm và phát hiện cho thấy 4 mẫu còn lại tái nhiễm HCV. không cho sản phẩm RT- (-) M 1 2 3 4 5 6 7 PCR. Như vậy, 4 mẫu 23.0kb 9.4kb huyết thanh có phản ứng 6.5kb 4.3kb 2.3kb 2.0kb anti-HCV âm tính đều 0.5kb không có ARN của virut ~ 300bp HCV, do vậy không phát hiện được bằng phản ứng RT-PCR (hình 3). Điều đó cho thấy có sự tồn tại cùng lúc của ARN-HCV
PCR đối với HCV của 4 mẫu HC4, HC5, HC6, HC7. kết luận Hình 3: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của các mẫu huyết thanh - Trong 7 mẫu huyết bệnh phẩm. thanh của BN viêm gan cấp tính ở khu vực Hà Nội có 3 mẫu (HC1, (-): Đối chứng âm; M: HC2, HC3) chứa virut chỉ thị phân tử AND (thuộc nhóm Hepacivirus (sử dụng hệ gen Lamda trong họ Flaviviridae). (l) cắt bằng enzym giới hạn Đường HindIII); chạy 1-3: Đối chứng dương; Đường chạy 4-7: Kiểm tra sản phẩm RT-
- Có thể sử dụng cặp mồi nhiễm HCV tại Thành sản phố Hà Nội, Luận án CC1F-CC2R, cho phẩm khoảng 300 bp, Tiến sỹ Y học, Hà Nội, thành phần phản ứng và 2004. chu trình nhiệt của phản 2. Bùi Đại. Viêm gan ứng RT-PCR trong virut B và D. Nhà xuất nghiên cứu này để xây bản Y học, Hà Nội, dựng kit chẩn đoán phân 2002, tr. 12-269. tử HCV từ khuôn HCV- 3. Lê Thanh Hòa. Sinh ARN có trong huyết học phân tử: Nguyên lý thanh BN một cách chính và ứng dụng. Tài liệu xác và đặc hiệu. giảng dạy sau Đại học. Viện Công nghệ Sinh học, 2003, tr. 72-82. tài liệu tham khảo 4. Caudai C, Padula 1. Trần Thanh Dương. MG, Bettini V, Valensin Dịch tễ học phân tử PE. Detection of HCV
and GBV-C/HGV Swiss Med WKLY, infection by multiplex 2001, 131: 291–298. PCR in plasma samples 6. Liang T, Leonard B, of transfused subjects, J. Hoofnagle JH, et al. Virological Methods, Pathogenesis, natural 1998, 70: 79–83. history, treatment and 5. Blum HE, prevention of hepatitis C. Moradpour D, Cerny A, Ann. Inter. Med., 2000, Markus H. Heim MH. 132. 4: 296-305. Hepatitis C: An update. Quan sát siêu cấu trúc qua kính hiển vi điện tử tinh trùng người, thấy nhiều tinh trùng dị dạng. Đặc biệt dị dạng ở đầu
(ảnh 3, 4). Đầu tinh trùng nhăn nhúm (ảnh 3), còn có hai nhân, màng tế bào nhiều bào tương (ảnh 4). 3 2 1
ảnh 3, 4: Siêu cấu trúc đầu tinh trùng người có hình dạng bất thường. Đầu có nhân (1) chia thuỳ, bào tương rộng (2, 3) x 10.000.
Tạp chí y dược học quân sự số 1-2007 Như vậy, bức xạ siêu cao tần có thể làm ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng tinh trùng cả trên động vật thực nghiệm và người. Bức xạ siêu cao tần tác động đến quá trình sinh tinh trùng bằng cơ chế trực tiếp qua tác dụng nhiệt hoặc cơ chế gián tiếp thông qua tuyến yên, gây rối loạn quá trình sản xuất hormon LH, FSH, các hormon này tác dụng lên các tế bào dòng tinh [5]. 4.3. Thăm dò tác dụng của thuốc mediphylamin đến sự hồi phục số lượng và chất lượng tinh trùng người: Những công nhân tiếp xúc với sóng siêu cao tần có số lượng và chất lượng kém, điều trị bằng mediphylamin với liều 0,25g x 2viên/ngày, uống liên tục 30 ngày, sau đó xét nghiệm lại tinh dịch đồ. 67