Báo cáo y học: "Phát hiện virut EBV trên bệnh nhân ung thư vòm họng bằng phản ứng PCR"

Chia sẻ: Nguyễn Phương | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

179
lượt xem 19
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Từ bệnh phẩm là mô sinh thiết của 3 bệnh nhân (BN) được chẩn đoán ung thư vòm họng (UTVH), phát hiện hệ gen EBV bằng phản ứng PCR. Sử dụng kỹ thuật dòng hóa và giải trình tự, toàn bộ chuỗi ARN thông tin đoạn gen LMP-1 của EBV được xác định trong cả 3 mẫu bệnh phẩm nghiên cứu. Detect Epsstein-Barr virus in patients with nasopharyngeal carcinoma by polymerase chain reaction Summary Genomic DNA from biopsy tissue of 3 patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC) was extracted. Using PCR, cloning and sequencing, the entire mRNA of the LMP-1 gene of EBV was...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo y học: "Phát hiện virut EBV trên bệnh nhân ung thư vòm họng bằng phản ứng PCR"

Phát hiện virut EBV trên bệnh nhân ung thư vòm họng bằng phản ứng PCR Lê Thanh Hà*; Nguyễn Lĩnh Toàn* Nguyễn Đình Phúc**; Lê Thanh Hòa*** Tãm t¾t Từ bệnh phẩm là mô sinh thiết của 3 bệnh nhân (BN) được chẩn đoán ung thư vòm họng (UTVH), phát hiện hệ gen EBV bằng phản ứng PCR. Sử dụng kỹ thuật dòng hóa và giải trình tự, toàn bộ chuỗi ARN thông tin đoạn gen LMP-1 của EBV được xác định trong cả 3 mẫu bệnh phẩm nghiên cứu. * Từ khoá: Ung thư vòm mũi họng; EBV; LMP-1. Detect Epsstein-Barr virus in patients with nasopharyngeal carcinoma by polymerase chain reaction Summary Genomic DNA from biopsy tissue of 3 patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC) was extracted. Using PCR, cloning and sequencing, the entire mRNA of the LMP-1 gene of EBV was detected. We detected EBV in biopsy tissue of these 3 patients. * Key words: Nasopharyngeal carcinoma; EBV; LMP-1. Về nguyên nhân của bệnh, có rất nhiều ĐẶT VẤN ®Ò giả thiết, tập trung thành ba nhóm chủ yếu Ung thư vòm mũi họng là một loại khối đó là do virut Epstein-Barr, do di truyền và u ác tính xuất phát từ lớp biểu mô phủ của do các yếu tố môi trường, tập quán ăn vùng vòm mũi họng. Loại ung thư này uống, hoá chất. Trong thời gian gần đây, có được xếp vào các khối u biểu mô của rất nhiều công trình nghiên cứu của các tác đường tiêu hoá và hô hấp trên, là một giả trong và ngoài nước về mối liên quan trong 5 loại ung thư phổ biến nhất ở người giữa virut Epstein-Barr và ung thư vòm mũi Việt Nam và hay gặp nhất trong ung thư họng. vùng tai mũi họng. Trên thế giới, cũng hay EBV là một thành viên thuộc nhóm herpesvirut gặp ở các nước vùng Đông Nam Á và phía týp 4 gây nhiễm bệnh trên người [3]. Cấu trúc nam Trung Quốc [6]. * BÖnh viÖn 103 ** Häc viÖn Qu©n y *** ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc Ph¶n biÖn khoa häc: PGS. TS. NguyÔn Th¸i S¬n EBNA, đó là EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, hệ gen của EBV là chuỗi ADN xoắn kép, EBNA-3B, EBNA-3C và EBNA-LP và 3 tổ mạch hở, kích thước khoảng 172 kb. Hệ hợp gen mã hóa cho protein màng là LMP- gen của EBV gồm 6 tổ hợp gen mã hóa cho 1, LMP-2A và LMP-2B [1, 5]. các loại protein kháng nguyên, ký hiệu là
Nhiễm tiềm tàng EBV là khởi đầu sớm Phản ứng PCR được thực hiện dùng cặp mồi do chúng tôi thiết kế như sau: cho quá trình tiến triển ung thư [8]. Trong các protein có vai trò quan trọng đối với quá LMP1F (mồi xuôi): trình tiến triển thành UTVH ở giai đoạn 5’-ATGGAACGCGACCTTGAGAG-3’ sớm, LMP-1 là một loại đặc biệt do protein LMP1R (mồi ngược): này có khả năng gây ung thư thực nghiệm 5’-TTAGTCATAGTAGCTTAGCTGAAC-3’ trên chuột và LMP-1 cũng có khả năng gây Sản phẩm của toàn bộ gen LMP-1 có kích ra nhiều kiểu biến đổi kiểu hình tế bào thước 1,3 - 1,35 kb, thay đổi tuỳ từng chủng. lympho B và tế bào biểu mô khác [2]. Một Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: bằng chứng quan trọng chứng minh vai trò nhiÖt ®é thêi gian sè chu kú của LMP-1 trong quá trình tiến triển UTVH 0 94 C 5 phút 1 là protein LMP-1 biểu hiện và tìm thấy trong 940C 78% số mẫu mô bệnh nhân UTVH. Sản 1 phút phẩm ARN thông tin của LMP-1 là kết quả 550C 35 1 phút ghép-nối (splicing) của 3 chuỗi exon, chịu 720C 2 phút trách nhiệm tổng hợp protein màng có phân 720C 10 phút 1 tử lượng là 63 kDa. LMP-1 có mức độ biến 40C Nhiệt độ bảo quản tạm thời sản phẩm đổi cấu trúc rất cao giữa các chủng, đặc biệt ở vùng gen của exon 3 tại đầu 3’, trong * Dòng hóa và giải trình trình tự: đó có những chủng EBV phân lập ở Việt Sản phẩm đoạn gen LMP-1 của EBV, Nam [4, 7]. sau khi tinh sạch, dòng hoá vào plasmid Trong nghiên cứu này sử dụng phản vector pCR2.1 (Invitrogen Inc.). Chọn lọc và ứng PCR, kỹ thuật dòng hóa và giải trình tự tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp theo quy trình của hãng Bioneer (Hàn Quốc). Trình để xác định sự tồn tại đoạn gen LMP-1 của tự nucleotid ADN của plasmid tái tổ hợp EBV trong mẫu mô sinh thiết của 3 BN được mang gen LMP-1 được giải trình trên máy chẩn đoán xác định là UTVH. tự động ABI-3100 Genetic Analyzer. Phân 28 ĐèI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP tích chuỗi nucleotid bằng các chương trình nghiªn cøu SeqEd1.03, AssemblyLIGN1.9, MacVector 1. Đối tượng nghiên cứu. 8.2 (Accelrys Inc.) và so sánh đối chiếu Mẫu mô sinh thiết của BN UTVH tại bằng chương trình GENEDOC 2.6.002 (http:// Bệnh viện Tai Mũi Họng TW được sử dụng www.nrbsc.org/gfx/genedoc/). để tách ADN tổng số, bao gồm cả hệ gen của virut. KÕT QUẢ nghiªn cøu 2. Phương pháp nghiên cứu. VÀ BµN LUẬN * Phản ứng PCR:
1. Kết quả thực hiện PCR, dòng hoá kb của vector và khoảng 1.300 bp của gen sản phẩm và tách dòng. LMP-1 đang nghiên cứu. Bằng cặp mồi LMP1F-LMP1R, sản phẩm PCR thu được có kích thước dự kiến M 1 2 3 khoảng 1.300 bp. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% trình bày ở hình 1 cho thấy đoạn ADN của EBV có độ dài khoảng 1.300 bp. Như vậy, hệ gen của EBV đã được tách từ mô sinh thiết 23.0kb 9.4kb 6.5kb của BN UTVH và sau khi thực hiện PCR đã 4.3kb cho sản phẩm ADN có chất lượng và kích 2.3kb 2.0kb thước phù hợp. M 1 2 3 0.5kb 23.0k 9.4k 6.5k 4.3k H×nh 2: Kết quả t¸ch dßng đoạn gen LMP-1 2.3k 2.0k EBV trên thạch agarose 0,8%. M: Thang chuẩn AND. Đường chạy 1 - 3: sản phẩm tách dòng 3 mẫu ADN lần lượt của BN 1, 2, 3. 0.5k 2. Kết quả giải trình tự gen LMP-1. Hình 1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm Đoạn ADN thu được gọi là khung gen PCR trên thạch agarose 0,8%. M: Thang chuẩn ADN. Đường chạy 1 - 3: sản phẩm của LPM-1, kích thước khoảng 1,3 kb, PCR 3 mẫu ADN lần lượt của BN 1, 2, 3. chính xác hơn sau khi phân tích là 1.268 Kiểm tra sản phẩm dòng hóa bằng điện bp, bao gồm 3 exon và 2 intron, có cấu trúc di trên thạch agarose 0,8% (hình 2). Khi cắt giống như tất cả các khung gen LMP-1 của ADN plasmid tái tổ hợp có chứa sản phẩm các chủng trên thế giới [4]. PCR (gen LMP-1) đã cho 2 băng ADN: 3,9 30 60 90 120 ATGGAACGCGACCTTGAGAGGGGCCCACCGGGCCCGCCACGGCCCCCTCTAGGACCCCCCCTCTCCTCTTCCATAGGCCTTGCTCTCCTTCTCCTGCTCTTGGCGCTACTGTTCTGGCTG M E R D L E R G P P G P P R P P L G P P L S S S I G L A L L L L L L A L L F W L> __________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 150 180 210 240 TATATCATTATGAGTGACTGGGCTGGAGGAGCGCTCCTTGTCCTCTATGCCTTTGCTCTAATGCTTATTATTATCATTCTGATCATCTTTATCTTCAGAAGAGACCTTCTCTGTCCACTT Y I I M S D W A G G A L L V L Y A F A L M L I I I I L I I F I F R R D L L C P L> __________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 270 300 330 360 GGAGGTTTTGGTCTACTCCTACTGATGATCACCCTCCTGCTCATCGCTCTTTGGAATTTGCACGGACAGGCATTGTACCTTGGAATTGTGCTGCTCATCTTCGGCTGCTTACTTGTCTTA G G F G L L L L M I T L L L I A L W N L H G Q A L Y L G I V L L I F G C L L V L> __________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 390 420 450 480 GGTCTCTGGATCTACTTCTTGGAGATTCTCTGGCGGCTTGGTGCCACCATCTGGCAGCTTTTGGCCTTCATCCTAGCCTTCTTCCTAGACATCATCCTGCTTATTATTACTCTCTATCTA G L W I Y F L E I L W R L G A T I W Q L L A F I L A F F L D I I L L I I T L Y L> __________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 510 540 570 600 CAACAAAACTGGTGGACTCTATTGGTTGATCTCCTTTGGCTCCTCCTGTTTCTGGCCATTTTAATCTGGATGTATTACCATGGACAACGACACACTGATGAACACCACCACGATGACTCC Q Q N W W T L L V D L L W L L L F L A I L I W M Y Y H G Q R H T D E H H H D D S> __________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 630 660 690 720 CTCCCGCACCCTCAACAAGCTACCGACGATTCTAGCCATGAATCTGACTCTAACTCCAACGAGGGCAGACACCACCTGCTCGTAACTGGAGGCGCCGACGGACCCCCACTCTGCTCTCAA L P H P Q Q A T D D S S H E S D S N S N E G R H H L L V T G G A D G P P L C S Q> __________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 750 780 810 840 AACCTACGCGCACCTGGATGTGGTCCTGACAATGGCCCACAGGACCCTGACAACACTGATGCCAATGGCCCACAGGACCCTGACAACACTGATGACAATGGCCCACAGGACCCTGACACC N L R A P G C G P D N G P Q D P D N T D A N G P Q D P D N T D D N G P Q D P D T> EBVS7-VN-mRNA >
Hình 3: Trình tự mARN gen LMP-1 của EBV (1.116 bp). Mũi tên chỉ dẫn vị trí ghép nối giữa exon 1 và 2, giữa exon 2 và 3 để tạo nên mARN hoàn chỉnh.
Sau khi bỏ 2 intron, chúng tôi thu được chuỗi nucleotid ARN thông tin của 1 chuỗi gen có độ dài 1.113 bp. Kết quả giải trình tự và sắp xếp nulceotid và acid amin của gen LMP-1 của một chuỗi (hình 3). KÕT LUẬN Sử dụng cặp mồi LMP1F-LMP1R, chúng tôi đã thực hiện thành công phản ứng PCR 3 mẫu ADN tách chiết từ mô sinh thiết của 3 BN được chẩn đoán UTVH. Sản phẩm thu được đã dòng hóa và giải trình tự gen, phân tích kết quả cho thấy đây chính là đoạn gen LMP-1 30 của EBV. Kết quả cuối cùng cho thấy trong cả 3 mẫu sinh thiết của 3 BN UTVH đều có tồn tại EBV. Như vậy, có thể sử dụng quy trình trong nghiên cứu này để phát hiện EBV ở BN UTVH. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Đình Phúc và Lê Thanh Hòa. Virut Epstein-Barr gây ung thư vòm mũi họng và một số phương pháp hiện đại ứng dụng trong chẩn đoán. Tổng quan. Tạp chí Công nghệ Sinh học. 2008, 6 (2), tr.1-18. 2. Cohen JI. Virology and molecular biology of Epstein-Barr virus. In Epstein-Barr virus. Edited by Tselis A and Jenson HB. Taylor and Francis Group LLC, New York NY.2006, pp.21-37. 3. Kaye KM, Izumi KM, Kieff E. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 is essential for B- lymphocyte growth transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1993, 90 (19), pp.9150-9154. 4. Middeldorp JM, Brink AA, van den Brule AJ, Meijer CJ. Pathogenic roles for Epstein-Barr virus (EBV) gene products in EBV-associated proliferative disorders. Crit Rev Oncol Hematol. 2003, 4 (1), pp.1-36. 5. Miller WE, Edwards RH, Walling DM and Raab-Traub N. Sequence variation in the Epstein-Barr virus latent membrane protein 1. J Gen Virol. 1994, 75 (10), pp.2729-2740. 6. Murray PG and Young LS. Epstein-Barr virus infection: basis of malignancy and potential for therapy. Expert Rev Mol Med. 2001, 3 (28), pp.1-20. 7. Nguyen-Van D, Ernberg I, Phan-Thi Phi P, Tran-Thi C, Hu L. Epstein-Barr virus genetic variation in Vietnamese patients with nasopharyngeal carcinoma: full-length analysis of LMP1. Virus Genes. 2008, 37 (2), pp.273-281. 8. Pathmanathan R, Prasad U, Sadler R, Flynn K, Raab-Traub N. Clonal proliferations of cells infected with Epstein-Barr virus in preinvasive lesions related to nasopharyngeal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 1995, 333, pp.693-698.