BƯỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƯNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:90

Thêm vào BST

Báo xấu

117
lượt xem 22
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong quá trình tồn tại và phát triển, con ngƣời không ngừng khai thác, tàn phá tài nguyên thiên nhiên và môi trƣờng. Ngày nay, sự mở rộng và phát triển các khu công nghiệp đã tạo một lƣợng khí thải vô cùng lớn, gây ô nhiễm không khí góp phần tàn phá sự sống trên trái đất. Những hoạt động đó đang dần làm mất cân bằng hệ sinh thái, phá hủy một trong những nguồn tài nguyên quý giá nhất, không thể thay thế trên thế giới, đó là đa dạng sinh học - cơ sở của sự...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BƯỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƯNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ MINH THÙY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********************** BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ TRƢƠNG THỊ MINH THÙY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007
LỜI CẢM ƠN Con thành kính ghi ơn Ba Mẹ đã sinh ra và nuôi nấng con thành ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình về tất cả. Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy, Cô trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học. Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian học tập và thực hiện khóa luận. Thầy TS. Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa sinh đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận. Ban quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập mẫu. Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh chị trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu. Các bạn cùng thực hiện đề tài đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khoá luận. Xin cảm ơn tất cả các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã cùng tôi chia sẻ bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt cảm ơn tất cả các bạn cùng phòng đã ủng hộ tinh thần và đồng hành với tôi trong suốt thời gian học tập. Chúc mọi ngƣời đều hạnh phúc và thành đạt. Xin chân thành cảm ơn! Trƣơng Thị Minh Thùy ii
TÓM TẮT TRƢƠNG THỊ MINH THÙY, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 9/2007. “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ. Khóa luận đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh từ 7 / 5 / 2007 đến 31 / 8 / 2007. Rừng ngập mặn là hệ sinh thái gồm nhiều loài cây khác nhau, trong đó có Đƣng Rhizophora mucronata Lamk., một loài chiếm số lƣợng lớn ở vùng nƣớc mặn, đồng thời quần thể Đƣng cũng là hàng rào bảo vệ bờ biển các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tuy ý nghĩa kinh tế và môi trƣờng của rừng ngập mặn ngày càng đƣợc công nhận, song diện tích của chúng trên khắp thế giới đang giảm dần theo thời gian do ô nhiễm và nạn phá rừng. Trên cơ sở đó, cần có những kế hoạch hợp tác nhằm cải thiện hệ sinh thái, thiết lập sự phát triển bền vững cho rừng ngập mặn nói chung và khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nói riêng. Khóa luận này nhằm mục đích thiết lập quy trình thích hợp cho việc đánh giá sự đa dạng di truyền cây Đƣng Rhizophora mucronata tại rừng ngập mặn Cần Giờ. Kết quả đạt đƣợc:  Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ mẫu lá Đƣng tƣơi.  Xây dựng đƣợc quy trình phản ứng RAPD đối với cây Đƣng. Xác định đƣợc OPAC10 là mồi tạo độ đa hình cao nhất trong số những mồi tiến hành khảo sát. Từ 14 mẫu, OPAC10 đã khuếch đại 18 locus, trong đó có 2 band đồng hình (trọng lƣợng phân tử: 300 bp và 400 bp) và 13 band đa hình.  Kết quả phân tích bằng phần mềm NTSYS 2.1, hệ số đồng dạng di truyền giữa các cá thể trong quần thể Đƣng tự nhiên và Đƣng đƣợc trồng biến thiên từ 46 đến 79 %. Kết quả phân tích trên 14 mẫu ngẫu nhiên khác, chúng tôi nhận thấy hệ số đồng dạng di truyền dao động từ 68 đến 100 %. Điều này cho thấy giữa các cá thể trong iii
quần thể Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có mối quan hệ di truyền tƣơng đối gần, tuy nhiên chúng lại phân bố rải rác khắp các tiểu khu vì vậy giữa các cá thể vẫn thể hiện đƣợc tính đa dạng sinh học cao. Tp. HCM, ngày 7 tháng 9 năm 2007. Trƣơng Thị Minh Thùy iv
ABSTRACT TRUONG THI MINH THUY, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, September 2007. “PREMILINARY RESEARCH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Rhizophora mucronata Lamk. IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA BY RAPD”. The thesis was carried out in Chemical and Biological Analysis and Experiment Center at Nong Lam University from May to August in 2007. Supervisor: BUI MINH TRI, PhD. Mangrove is an ecological term referring to a taxonomical diverse assemblage of trees, including Rhizophora mucronata Lamk., that forms the dominant plant communities in tidal, saline wetlands along sheltered tropical and subtropical coast. Although the economic and environmental significance of mangroves is being increasingly recognized, it is in fact, decreasing around the world because of pollution and deforestation of the mangrove forests. By those reason, it is necessary to set up an integrated plan improving the ecosystem in order to establish a sustainable development for the mangrove forest in general and Can Gio Biosphere reserve are in particular. This research was aimed to set up appropriate protocols for evaluating genetic diversity of Rhizophora mucronata in Can Gio mangrove forest. The obtained results were:  Set up suitable protocol for extracting genomic DNA of fresh leaves of R. mucronata.  Optimize RAPD analysis protocol for R. mucronata. It was indicated that Primer OPAC10 gave highest polymorphic level among tested primers. From 14 samples, primer OPAC10 amplified at 18 loci, those included 2 monomorphic bands (with molecular weight: 300 bps & 400 bps) and 13 polymorphic bands.  Analysing with NTSYS 2.1, similarity between the natural R. mucronata and cultivated R. mucronata populations was in a range from 46 to 79 %. Another v
analysis on 14 randomized samples, we obtained similarity ranged from 68 to 100%. The result also suggested that R. mucronata at Can Gio biosphere reserve area have not had closed relation but scattered in to various groups. vi
MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa ............................................................................................................................ i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ iii Tóm tắt .............................................................................................................................. iv Abstract ............................................................................................................................. vi Mục lục ............................................................................................................................. viii Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................................. xii Danh sách các bảng .......................................................................................................... xiii Danh sách các hình........................................................................................................... xiv Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1 1.2. Mục đích ..................................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ....................................................................................................................... 2 1.4. Giới hạn của đề tài ..................................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3 2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh ....................................................................................................... 3 2.1.1. Khái niệm và chức năng của khu dự trữ sinh quyển ..................................... 3 2.1.2. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................... 4 2.1.2.1. Điều kiện tự nhiên ..................................................................................... 4 2.1.2.2. Chức năng từng vùng trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh .............................. 6 2.1.2.3. Hệ sinh vật ở rừng ngập mặn Cần Giờ ................................................... 7 2.1.3. Thực trạng của rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay ........................................ 8 2.2. Cây Đƣng (Rhizophora mucronata Lamk.) ........................................................... 9 vii
2.2.1. Phân loại ............................................................................................................. 9 2.2.2. Hình thái học .................................................................................................... 10 2.2.3. Phân bố ............................................................................................................. 11 2.2.4. Giá trị kinh tế ................................................................................................... 11 2.3. DNA (Deoxyribonucleic acid) ............................................................................... 12 2.3.1. Quy trình ly trích DNA thực vật .................................................................... 13 2.3.2. Các phƣơng pháp định lƣợng, định tính DNA ............................................. 14 2.3.2.1. Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ ................................ 14 2.3.2.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di .......................................... 15 2.4. Enzyme giới hạn (RE – restriction enzyme) ........................................................ 16 2.4.1. Các loại enzyme giới hạn ............................................................................... 16 2.4.2. Trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn ................................................. 16 2.4.3. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA ............................ 16 2.5. PCR (Polymerase Chain Reaction) ....................................................................... 18 2.5.1. Khái niệm ......................................................................................................... 18 2.5.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR ...................................................................... 18 2.5.3. Quy trình phản ứng PCR ................................................................................ 19 2.6. Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) và tầm quan trọng ......................... 20 2.7. Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity) .............................................................. 21 2.8. Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền ............................................. 21 2.9. Một số kỹ thuật đánh giá sự đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử ... 22 2.9.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism) .............. 22 2.9.1.1. Khái niệm ................................................................................................. 22 2.9.1.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RFLP ...................... 23 2.9.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism) ............... 24 2.9.2.1. Khái niệm ................................................................................................. 24 2.9.2.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật AFLP ...................... 26 2.9.3. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................ 27 2.9.3.1. Khái niệm ................................................................................................. 27 viii
2.9.3.2. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD ..................................................... 29 2.9.3.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD ...................................................... 29 2.9.3.4. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RAPD ..................... 29 2.9.4. So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử ............................................................................. 30 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ..............................31 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................................ 31 3.1.1. Thời gian thực hiện ......................................................................................... 31 3.1.2. Địa điểm thực hiện .......................................................................................... 31 3.2. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................................. 31 3.2.1. Nguyên tắc thu thập mẫu ................................................................................ 31 3.2.2. Cách ký hiệu mẫu ............................................................................................ 31 3.2.3. Cách lấy mẫu .................................................................................................... 32 3.2.4. Cách bảo quản mẫu ......................................................................................... 32 3.3. Phƣơng pháp thí nghiệm ......................................................................................... 32 3.3.1. Quy trình ly trích DNA ................................................................................... 32 3.3.1.1. Vật liệu dùng trong ly trích DNA .......................................................... 32 3.3.1.2. Quy trình ly trích DNA ........................................................................... 33 3.3.1.3. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp quang phổ .......... 35 3.3.1.4. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose .......................................................................... 35 3.3.2. Kỹ thuật RAPD ................................................................................................ 35 3.3.2.1. Vật liệu dùng trong RAPD ..................................................................... 35 3.3.2.2. Tiến hành thí nghiệm .............................................................................. 37 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................42 4.1. Kết quả thu thập mẫu Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .......................................................................................... 42 4.2. Bảo quản mẫu .......................................................................................................... 43 4.3. Kết quả OD (Optical Density) ............................................................................... 44 ix
4.4. Kết quả điện di ......................................................................................................... 45 4.4.1. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 1 ............................ 45 4.4.2. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 2 ............................ 45 4.4.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 3 ............................ 47 4.5. Kết quả phản ứng RAPD ........................................................................................ 49 4.5.1. Kết quả khảo sát Primer OPAC10................................................................. 49 4.5.2. Kết quả khảo sát 7 mồi trên cây Đƣng cùng một số cây ngập mặn khác . 50 4.5.3. Kết quả khảo sát nồng độ OPAC10 .............................................................. 53 4.5.4. Kết quả sử dụng OPAC10 thực hiện phản ứng RAPD với tất cả các mẫu DNA ly trích đạt tiêu chuẩn .......................................... 53 4.5.5. Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD ................................................ 56 4.6. Bƣớc đầu đánh giá mức độ di truyền cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng phần mềm NTSYS .............................................. 56 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................61 5.1. Kết luận ..................................................................................................................... 61 5.2. Đề nghị...................................................................................................................... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................63 x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism. bp : Base pair. DNA : Deoxyribonucleic Acid. dNTP : Deoxynucleotide Triphosphate. EB : Extraction Buffer. EDTA : Ethylenediamine Tetra Acetic Acid. GPS : Global Position System. MAB : Man and Biosphere. OD : Optical Density. PCR : Polymerase Chain Reaction. RAPD : Random Amplified Polymorphism of DNA. RE : Restriction Enzyme. RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism. RNA : Ribonucleic Acid. Rnase : Ribonuclease. SSCP : Single – strand Conformation Polymorphism. SSR : Simple Sequence Repeat. STS : Sequence – tagged Sites. Ta : Annealing temperature. TAE : Tris Glacial Acetic Acid EDTA. TE : Tris EDTA. Tm : Melting temperature. UNESCO : United Nations Educational Scientific and Cultural Organization. UV : Ultra Violet. WWF : World Wildlife Fund. xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử ........................................................................ 30 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 .. 37 Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 ................................ 37 Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2 .. 38 Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2 ................................ 38 Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3 .. 39 Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3 ................................ 39 Bảng 3.7: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4 .. 40 Bảng 3.8: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4 ................................ 40 xii
DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ........................... 5 Hình 2.2 Các thành phần trong cấu tạo hình thái cây Đƣng .................................. 10 Hình 2.3 Cấu trúc mạch đôi xoắn kép của phân tử Deoxyribonucleic acid ........... 12 Hình 2.4 Một số enzyme cắt giới hạn .................................................................... 17 Hình 2.5 Phản ứng PCR ......................................................................................... 20 Hình 2.6 RFLP trong trƣờng hợp có đột biến điểm ............................................... 23 Hình 2.7 Nguyên lý kỹ thuật AFLP ....................................................................... 25 Hình 2.8 Nguyên lý kỹ thuật RAPD ...................................................................... 28 Hình 4.1 Vị trí các mẫu Đƣng đƣợc thu thập trên bản đồ Cần Giờ ....................... 42 Hình 4.2 Kết quả điện di mẫu ly trích theo quy trình 1 ......................................... 45 Hình 4.3 Kết quả điện di mẫu ly trích theo quy trình 2 ......................................... 45 Hình 4.4 Sự khác biệt giữa DNA mẫu ly trích theo quy trình 2 và quy trình 3 ..... 46 Hình 4.5 Kết quả điện di 12 mẫu ly trích theo quy trình 3 .................................... 47 Hình 4.6 Kết quả điện di 13 mẫu ly trích theo quy trình 3 .................................... 47 Hình 4.7 Kết quả điện di sử dụng primer OPAC10, khảo sát quy trình RAPD .... 49 Hình 4.8 Kết quả điện di khảo sát Primer 1 ........................................................... 50 Hình 4.9 Kết quả điện di khảo sát Primer 9 và 2 ................................................... 50 Hình 4.10 Kết quả điện di khảo sát Primer RAH8................................................. 51 Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của mẫu 7.12 với 7 mồi ................... 51 Hình 4.12 Kết quả điện di khảo sát nồng độ Primer OPAC10 trên mẫu 2B.14 và 7.12 ......................................................................... 53 Hình 4.13 Kết quả điện di 7 sản phẩm RAPD ....................................................... 53 Hình 4.14 Kết quả điện di 8 sản phẩm RAPD ....................................................... 54 Hình 4.15 Kết quả điện di 10 sản phẩm RAPD ..................................................... 54 Hình 4.16 Cây phân loại 6 cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ........................................................................ 57 Hình 4.17 Cây phân loại 14 cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ........................................................................ 59 xiii
1 Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong quá trình tồn tại và phát triển, con ngƣời không ngừng khai thác, tàn phá tài nguyên thiên nhiên và môi trƣờng. Ngày nay, sự mở rộng và phát triển các khu công nghiệp đã tạo một lƣợng khí thải vô cùng lớn, gây ô nhiễm không khí góp phần tàn phá sự sống trên trái đất. Những hoạt động đó đang dần làm mất cân bằng hệ sinh thái, phá hủy một trong những nguồn tài nguyên quý giá nhất, không thể thay thế trên thế giới, đó là đa dạng sinh học - cơ sở của sự sống còn, sự thịnh vƣợng và phát triển bền vững. [41] Từ thực tế trên, các khu dự trữ sinh quyển đƣợc ra đời, nhằm thực hiện nhiệm vụ trọng yếu: Bảo vệ hệ sinh quyển - một hệ sinh thái khổng lồ, đồng thời đảm bảo sự cân bằng, bảo tồn đa dạng sinh học, thúc đẩy kinh tế - xã hội phát triển và duy trì các giá trị văn hóa truyền thống. Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên của Việt Nam đƣợc UNESCO công nhận [22]. Với cảnh quan thiên nhiên tƣơi đẹp, thành phần các loài động thực vật phong phú, đa dạng, rừng ngập mặn Cần Giờ không những là rừng phòng hộ mà còn là điểm du lịch sinh thái hấp dẫn, mô hình học tập và nghiên cứu lý tƣởng [22], [43]. Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là nguồn tài nguyên vô giá, có vai trò và vị trí đặc biệt quan trọng đối với đời sống cộng đồng dân địa phƣơng và các vùng phụ cận. Quần thể Đƣng (R. mucronata) cùng những quần thể thực vật khác góp phần điều hòa khí hậu [30], chắn gió, chống xói lở, giảm bớt sự xáo trộn đất đai và ô nhiễm nguồn nƣớc ven biển, nuôi dƣỡng, cung cấp thức ăn cho các loài động vật hoang dã và hải sản có giá trị cao, đồng thời tạo sinh kế cho ngƣ dân [21]. Nhằm đem lại hiệu quả kinh tế và môi trƣờng cao hơn, chúng ta cần lập kế hoạch phát triển lâu dài và bền vững, tiến hành nghiên cứu, đánh giá nguồn gene và mức độ đa dạng di truyền các quần thể thực vật rừng ngập mặn Cần Giờ, trong đó có quần thể Đƣng, nhằm tìm đƣợc những chỉ thị phân tử phục vụ đắc lực cho việc chọn lọc
2 nhanh giống Đƣng, góp phần đảm bảo công tác trồng và phát triển rừng đạt hiệu quả cao nhất. Phƣơng pháp tốt nhất đáp ứng yêu cầu này là sử dụng các marker phân tử. Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM, dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy TS. Bùi Minh Trí chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. 1.2. Mục đích  Hoàn thiện quy trình ly trích DNA đối với cây Đƣng.  Xây dựng quy trình RAPD và bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.  Phục vụ công tác tuyển chọn giống Đƣng để lai tạo và xây dựng tiền đề cho những nghiên cứu chuyên sâu về sự đa dạng di truyền, nhận diện chỉ thị phân tử. 1.3. Yêu cầu  Thu thập mẫu lá từ những cây Đƣng có đặc điểm hình thái khác nhau: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị bệnh, cây mọc tự nhiên hay đƣợc trồng.  Ly trích DNA có chất lƣợng tốt làm nguyên liệu cho kỹ thuật RAPD.  Thực hiện kỹ thuật RAPD và phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS 2.1. 1.4. Giới hạn của đề tài  Đề tài chỉ tiến hành nghiên cứu quần thể Đƣng tại một số tiểu khu trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh.  Thời gian thực hiện ngắn.  Chƣa đủ điều kiện để thực hiện nhiều thí nghiệm tối ƣu, chƣa khảo sát nhiều primer đối với kỹ thuật RAPD nhằm đạt đƣợc kết quả chính xác hơn.
3 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh 2.1.1. Khái niệm và chức năng của khu dự trữ sinh quyển Sinh quyển là lớp vỏ trái đất có các sinh vật sống trên đó, kể cả đại dƣơng, ao hồ, sông suối, đất và phần dƣới của khí quyển. Sinh quyển cùng với khí quyển, địa quyển và thủy quyển tác động qua lại với nhau trong “Hệ thống trái đất”. [45] Sinh quyển là một hệ sinh thái khổng lồ, bao gồm các hệ sinh thái nhỏ hơn trên bề mặt trái đất. Việc bảo tồn nguyên vẹn tất cả hệ sinh thái là điều không thể, nên ngƣời ta chỉ có thể lựa chọn ra một số đại diện của các hệ sinh thái này để bảo tồn với ý nghĩa là các khu dự trữ vốn gene, loài và hệ sinh thái cho toàn bộ sinh quyển. [45] Khu dự trữ sinh quyển là những vùng có các hệ sinh thái trên cạn hoặc ven biển đƣợc quốc tế công nhận trong phạm vi chƣơng trình Con ngƣời và Sinh quyển (Man and Biosphere – MAB) của UNESCO, nhằm thúc đẩy và trình diễn mối quan hệ giữa con ngƣời với thiên nhiên. Các khu dự trữ sinh quyển là mô hình mẫu của các hệ sinh thái trên trái đất, là phòng thí nghiệm sống cho việc nghiên cứu và giám sát các hệ sinh thái đem lại lợi ích cho ngƣời dân địa phƣơng mà không gây hại đến môi trƣờng. [45] Mỗi khu dự trữ sinh quyển có 3 chức năng [45]:  Chức năng bảo tồn: đóng góp vào việc bảo tồn đa dạng di truyền, loài, hệ sinh thái và cảnh quan.  Chức năng phát triển: thúc đẩy phát triển kinh tế bền vững về sinh thái cũng nhƣ các giá trị văn hóa truyền thống.  Chức năng hỗ trợ: tạo điều kiện cho các hoạt động nghiên cứu, giám sát, giáo dục và trao đổi thông tin giữa các địa phƣơng, quốc gia, quốc tế về bảo tồn và phát triển bền vững.
4 2.1.2. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.2.1. Điều kiện tự nhiên Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc hình thành ở hạ lƣu sông Đồng Nai – Sài Gòn đổ ra biển Đông ở cửa Xoài Rạp, Đồng Tranh và vịnh Gành Rái, đồng thời nằm ở cửa ngõ Đông Nam Thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành phố khoảng 300 km. [8], [29], [44] Tọa độ địa lý [29]  Vĩ độ Bắc: 10o 22’ 14” – 10o 37’ 39”  Kinh độ Đông: 106o 46’ 12” – 107o 00’ 59” Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Cần Giờ có khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo với hai mùa rõ rệt: mùa mƣa từ tháng 5 – 11, gió hƣớng Tây Nam, mùa nắng từ tháng 12 – 4 năm sau, gió hƣớng Đông Nam. Nhiệt độ trung bình 25,8 0C. Lƣợng mƣa thấp, trung bình từ 1.000 – 1.200 mm / năm. [27] Dân số khoảng 63.000 ngƣời (2003), sống chủ yếu bằng nghề đánh bắt và nuôi trồng thủy sản. Dân cƣ phân bố không đều trên địa bàn 7 xã, phần đông tập trung ở xã Bình Khánh, Long Hòa, Cần Thạnh và An Thới Đông. [17] Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là 75.740 ha (2000) [29], [51], gồm vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp. Theo định hƣớng qui hoạch phát triển của huyện Cần Giờ đến năm 2010, cơ cấu đất đai về cơ bản vẫn giữ vai trò nồng cốt là rừng phòng hộ, rừng sinh quyển trên diện tích khoảng 38.000 ha (1993 - 1999) [29], mở mang thêm diện tích nuôi trồng thủy sản (6.990 ha [23]) với nguyên tắc gắn bó chặt chẽ với các hệ sinh thái rừng ngập mặn.
5 Ghi chú: Vùng lõi Vùng đệm Vùng chuyển tiếp Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
6 2.1.2.2. Chức năng từng vùng trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh a. Vùng lõi (4.721 ha) Vùng lõi bao gồm các tiểu khu rừng số 3, 4b, 6, 11, 12 và 13. Vùng này đặc trƣng cho các hệ sinh thái rừng trồng, đặc biệt là rừng ngập mặn tái sinh tự nhiên dọc theo các kênh rạch và bìa rừng, có mức độ đa dạng sinh học cao về thành phần các loài động vật, thực vật, vi sinh vật cùng cảnh quan rừng ngập mặn đa dạng và hấp dẫn [28], [45]. Các chức năng chính bao gồm:  Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng và rừng tự nhiên.  Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn với các môi trƣờng sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nƣớc.  Bảo tồn hệ thống thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển, nơi kiếm ăn và sinh đẻ của các loài động vật vùng triều.  Tiến hành một số công trình nghiên cứu khoa học về sức bền hệ sinh thái và du lịch sinh thái có giới hạn. b. Vùng đệm (41.139 ha) Là vùng tiếp giáp với vùng lõi, có thể tiến hành các hoạt động kinh tế, nghiên cứu, giáo dục và giải trí nhƣng không ảnh hƣởng đến mục đích bảo tồn vùng lõi. Vùng đệm bao gồm các tiểu khu rừng số 1, 2, 4a, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. 23 và 24. Với chức năng phục hồi các hệ sinh thái, dựa trên các quần xã chiếm ƣu thế [28], [45], bao gồm:  Góp phần bảo vệ chung vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển.  Tạo không gian lớn cho thú hoang dã ngoài vùng lõi. Khi các khu vực này trở nên ổn định, có thể bổ sung vào vùng lõi nếu cần thiết.  Tạo ra cảnh quan tự nhiên và văn hóa nhân văn phục vụ cho du lịch sinh thái.  Các mô hình lâm ngƣ kết hợp với môi trƣờng cũng đƣợc ứng dụng trong vùng này cho cƣ dân địa phƣơng.