Cảm ứng vi khuẩn tả sinh độc tố tả in vitro và tách chiết độc tố từ môi trường nuôi cấy

Chia sẻ: Nguyễn Triềuu | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

59
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn tả trong môi trường cảm ứng sinh độc tố tả in vitro và tách chiết độc tố từ môi trường nuôi cấy làm nguyên liệu chế tạo kít phát hiện và antidote kháng độc tố tả.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Cảm ứng vi khuẩn tả sinh độc tố tả in vitro và tách chiết độc tố từ môi trường nuôi cấy

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 CẢM ỨNG VI KHUẨN TẢ SINH ĐỘC TỐ TARIN VITRO VÀ TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ TỪ MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY Hoàng Đắc Thăng*; Đỗ Minh Trung*; Phạm Thế Tài*; Lê Văn Đông* TÓM TẮT Mục tiêu: cảm ứng vi khuẩn tả (VKT) Vibrio cholerae sinh độc tố tả (ĐTT) in vitro và tách chiết độc tố từ môi trường nuôi cấy làm nguyên liệu chế tạo kít phát hiện ĐTT và antidote kháng ĐTT. Phương pháp: nuôi cấy tăng sinh đồng thời kích thích VKT sinh ĐTT in vitro trong môi trường cảm ứng có chứa pepton, cao men bia, NaCl và NaHCO3. Tách chiết ĐTT từ môi trường nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn protein. Đánh giá hoạt tính của sản phẩm thu được bằng kỹ thuật GM1-ELISA và điện di SDS-PAGE. Kết quả: nuôi cấy in vitro VKT trong môi trường cảm ứng có sinh ĐTT, sản phẩm độc tố tách chiết được từ môi trường nuôi cấy có khả năng gắn đặc hiệu vào thụ thể GM1 và có kích thước tương ứng với các tiểu phần của ĐTT. Kết luận: đã nuôi cấy cảm ứng VKT sinh độc tố in vitro và tách chiết được ĐTT từ môi trường nuôi cấy. * Từ khóa: Độc tố tả; Vi khuẩn tả; Tách chiết độc tố. In Vitro Induction of Cholera Toxin Production and Extraction of Toxin from Culture Medium Summary Objective: Induction of cholera toxin (CT) in vitro production by Vibrio cholerae and extraction of CT from culture medium to be used as material for the development of CT detection kit and antidote. Methods: Bacterial proliferation and stimulation of toxin production were done by culturing of V. cholerae with the inducing medium which contained peptone, yeast extract, NaCl, NaHCO3. The toxin was extracted from culture medium by protein-precipitation fractionation method. Obtained toxin was determined by GM1-ELISA and SDS-PAGE techniques. Results: V. cholerae produced CT in vitro as being cultured in the inducing medium. The toxin extracted from culture medium bind specifically to GM1 receptor and has the size corresponding to CT subuits. Conclusion: CT has been successfully induced and extracted from in in vitro culture medium. * Key words: Vibrio cholerae; Cholera toxin; Toxin extraction. ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) là một loại vi khuẩn gram âm sinh ĐTT. ĐTT gắn vào các thụ thể đặc hiệu GM1 trên bề mặt các tế bào biểu mô niêm mạc của ruột, gây tiêu chảy nặng, kèm theo rối loạn nước, điện giải, là dấu hiệu đặc trưng của bệnh tả. Trường hợp bệnh nặng có thể gây tử vong trong thời gian ngắn. Bệnh tả có khả năng * Häc viÖn Qu©n y Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com) Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/01/2015 Ngày bài báo được đăng: 28/01/2015 32 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 bùng phát thành đại dịch trong thời gian rất ngắn và trên phạm vi rộng, ảnh hưởng nặng nề đến sức khoẻ, kinh tế xã hội và an ninh của nhiều quốc gia [1]. Tuy nhiên, các VKT thường chỉ sinh ĐTT trong điều kiện in vivo khi đã nhiễm vào tăng sinh trong môi trường đường ruột của đối tượng bị nhiễm. Trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng môi trường nuôi cấy thông thường, vi khuẩn này chỉ tăng sinh mà không tiết độc tố [3, 4, 5]. Phát hiện ĐTT và có kháng thể đặc hiệu làm antidote chống ĐTT là biện pháp quan trọng trong điều trị nhiễm trùng, nhiễm độc do vi khuẩn và ĐTT, đặc biệt khi ĐTT được sử dụng như một tác nhân vũ khí sinh học. Để có được nguyên liệu phát triển kít phát hiện và antidote kháng ĐTT, cần có nguyên liệu ban đầu là ĐTT, nhất là sản phẩm ĐTT do các chủng VKT gây tiêu chảy cấp thành dịch ở Việt Nam. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm: Nuôi cấy tăng sinh VKT trong môi trường cảm ứng sinh ĐTT in vitro và tách chiết độc tố từ môi trường nuôi cấy làm nguyên liệu chế tạo kít phát hiện và antidote kháng ĐTT. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu. - Chủng VKT V50 được khảo sát và tuyển chọn trong nghiên cứu trước của chúng tôi, là chủng có khả năng tăng sinh mạnh nhất trong số 10 chủng VKT được Khoa Vi sinh Y học, Bệnh viện Quân y 103 phân lập từ các vụ dịch tiêu chảy cấp thành dịch tại Hà Nội vào các năm 2007 2008 [2]. - Hóa chất, thiết bị nghiên cứu: môi trường nuôi cấy TCBS agar, thạch kiềm, 33 pepton, cao men bia, NaCl, NaHCO 3, NaH2PO4, NaOH, HCl, H2CO3, (NH)2SO4 (Hãng Merck). Protein GM1, ĐTT chuẩn, kháng thể đơn clôn kháng ĐTT, kháng thể kháng IgG gắn enzym HRP (Hãng Sigma); các hóa chất thông thường dùng cho phản ứng ELISA và điện di SDSPAGE đều đạt tiêu chuẩn phân tích và do các hãng có uy tín cung cấp. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Nuôi cấy VKT trong môi trường cảm ứng sinh độc tố: Nuôi cấy VKT trong môi trường cảm ứng sinh tổng hợp ĐTT có chứa pepton, cao men bia, NaHCO3 có bổ sung NaCl như mô tả trong nghiên cứu trước của chúng tôi [2]. Sau 72 giờ nuôi cấy, thu hoạch môi trường nuôi cấy bằng cách ly tâm 4.500 vòng/phút trong 25 phút lấy dịch nổi chứa ĐTT. Định lượng nồng độ protein trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp Bradford sử dụng BSA làm protein chuẩn để định lượng nồng độ protein tổng số. Xác định sự có mặt của ĐTT trong môi trường nuôi cấy bằng kỹ thuật GM1-ELISA. * Tách chiết ĐTT: Được thực hiện theo phương pháp kết tủa phân đoạn nhiều bước với muối sulphat amôn. - Bước 1: gây kết tủa các thành phần không phải protein. Tính thể tích dịch nổi thu được sau nuôi cấy và lượng muối sulphat amôn đạt 20% độ bão hòa. Cho từ từ sulphat amôn vào dung dịch nuôi cấy đã để trong đá lạnh và khuấy nhẹ nhàng bằng máy khuấy từ trong thời gian 2 tiếng. Ly tâm 9.000 vòng/phút trong thời gian 25 phút bằng máy ly tâm lạnh 40C, thu dịch nổi chứa ĐTT và bỏ cặn. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 - Bước 2: tủa phân đoạn với muối sulphat amôn ở các các nồng độ 30%, 40%, 60% hoặc 70% theo cách làm tương tự như ở bước 1. Sau ly tâm 9.000 vòng/ phút trong thời gian 25 phút bằng máy ly tâm lạnh 4ºC, thu cặn kết tủa protein chứa ĐTT. - Bước 3: rửa cặn tủa protein và thẩm tích protein chứa ĐTT với dung dịch PBS lạnh. Hòa tan cặn protein trong dung dịch PBS, sau đó cho vào túi thẩm tích (không quá 2/3 thể tích túi). Thẩm tích trong bình chứa dung dịch PBS lạnh trong 48 giờ. Trong thời gian thẩm tích, định kỳ thay dung dịch thẩm tích 5 lần. - Xác định nồng độ protein chứa ĐTT thu được sau thẩm tích bằng phương pháp Bradford sử dụng BSA là protein chuẩn để định lượng nồng độ protein tổng số. Xác định sự có mặt của ĐTT bằng kỹ thuật GM1-ELISA. Độ tinh sạch và kích thước protein được khảo sát bằng phương pháp điện di SDS-PAGE. có V. cholera (chứng âm) được cho vào các giếng đã gắn GM1 để ĐTT gắn với GM1 trong giếng, rửa bằng PBS-T. Cho kháng thể kháng ĐTT vào các giếng, thời gian 1 giờ, rửa các giếng bằng PBS-T, cho kháng thể thứ hai gắn enzym HRP vào các giếng, thời gian 1 giờ, rửa lại bằng PBS-T. Cho cơ chất vào các giếng phản ứng với nồng độ 0,5 mg/ml, thời gian 10 phút. Xác định kết quả thông qua mật độ quang học của các giếng đo được bằng máy đọc DTX 880 (Hãng Beckman Coulter, Mỹ) ở bước sóng 450 nm. Kiểm tra độc tính của ĐTT bằng đường uống trên chuột nhắt trắng sơ sinh 2 - 5 ngày tuổi. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Nuôi cấy tăng sinh V. cholerae trong môi trƣờng sinh độc tố. Bảng 1: Nồng độ protein và hoạt tính ĐTT trong dịch nổi sau nuôi cấy VKT. * Phát hiện và thử hoạt tính ĐTT: Phát hiện ĐTT bằng phản ứng GM1ELISA theo nguyên lý kỹ thuật ELISA kiểu sandwich, sử dụng ganglioside GM1 là phối tử đặc hiệu với ĐTT gắn lên pha rắn làm phân tử bắt giữ ĐTT. Kháng thể đơn clôn kháng ĐTT được dùng để phát hiện sự có mặt của ĐTT đã bị GM1 bắt giữ. Các bước cụ thể như sau: gắn GM1 vào các giếng của đĩa ELISA, để qua đêm rồi rửa với PBS-T, block các giếng bằng BSA 1%, thời gian 30 phút, sau đó rửa bằng PBS-T. ĐTT chuẩn (chứng dương); sản phẩm ĐTT sau tách chiết, môi trường nuôi cấy chứa ĐTT và môi trường nuôi cấy không 34 Nồng độ protein Hoạt tính ĐTT 0,096 mg/ml 0,094 mg/ml 0,101 mg/ml + + ++ Sau 24 giờ nuôi cấy, VKT đã chết tiết ĐTT vào môi trường. Nồng độ protein thu được trong protein của dịch nổi sau nuôi cấy 72 giờ có nồng độ protein cao nhất (0,101 mg/ml) và hoạt tính ĐTT mạnh nhất. Điều này phù hợp với với chu trình tăng sinh của VKT trong điều kiện nuôi cấy in vitro [2, 3]. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 2. Tách chiết ĐTT từ môi trƣờng nuôi cấy. Bảng 2: Nồng độ protein thu được từ các phân đoạn kết tủa. Nồng độ protein 0,025 mg/ml 0,018 mg/ml 0,235 mg/ml 0,066 mg/ml Hình 1: Hoạt tính ĐTT ở các phân đoạn kết tủa. Phân đoạn kết tủa ở nồng độ muối sulphat amôn 60% bão hòa có nồng độ protein và hoạt tính ĐTT cao nhất so với các phân đoạn kết tủa ở nồng độ muối sulphat amôn 30%, 40% hoặc 70%, cho thấy ở nồng độ muối quá thấp hoặc quá cao không gây kết tủa hết ĐTT trong môi trường. Nồng độ 60% độ bão hòa muối sulphat amôn là phù hợp nhất cho mục đích thu cặn protein có chứa ĐTT với hoạt tính mạnh nhất. 3. Hoạt tính của ĐTT. Hình 2: Hoạt tính của ĐTT được khảo sát bằng kỹ thuật GM1-ELISA. 35 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Sản phẩm thu được bằng kết tủa phân Vi khuẩn tả sản xuất độc tố ruột gọi là đoạn ở nồng độ muối sulphat amôn 60% Choleragen (giống như Cholerae enterotoxin) bão hòa có hoạt tính ĐTT gắn đặc hiệu vào gồm 2 thành phần: tiểu phần A (phần hoạt phối tử GM1. Đồ thị biểu thị mức độ phản độc - active) và tiểu phần B (phần gắn dính - ứng của ĐTT khi pha loãng bậc hai tương binding). ĐTT bao gồm 5 tiểu đơn vị B và đối điển hình theo dạng đường cong chuẩn một tiểu đơn vị A, tiểu đơn vị B có khối của phản ứng ELISA, cho thấy sản phẩm lượng phân tử khoảng 11,6 Kda, tiểu phần thu được có phản ứng gắn đặc hiệu với thụ A1 khối lượng phân tử khoảng 23,5 kDa, thể GM1. Đánh giá sơ bộ qua đường uống tiểu phần A2 khối lượng phân tử khoảng 9,7 sản phẩm thu được gây chết chuột nhắt kDa [3, 4]. Dựa vào kết quả điện di thu trắng sơ sinh được, kết quả ở giếng số 1 là môi trường 3 - 5 ngày tuổi, chứng tỏ sản phẩm thu được là độc tố gắn GM1. 3. Độ tinh sạch và kích thƣớc của ĐTT thu đƣợc. nuôi cấy trước kết tủa có xuất hiện nhiều băng protein, nhưng tương đối mờ nhạt do nồng độ protein trong dịch nuôi cấy thấp. Sản phẩm thu được sau kết tủa có các băng Phân tích sản phẩm protein có hoạt tính tương ứng với kích thước của tiểu phần B là ĐTT bằng điện di SDS-PAGE cho thấy xuất 11,6 Kda, A2 là 9,7 kDa. Bên cạnh các băng hiện 2 băng tương ứng với kích thước này còn có một số băng phụ. Tuy nhiên, mật tương đương 11,6 kDa của tiểu phần B và độ tương đối thấp hơn so với 2 băng chính, 9,7 Kda của tiểu phần A2. chứng tỏ sản phẩm thu được chứa chủ yếu là các protein tương ứng với ĐTT, có thể sử dụng làm nguyên liệu cho việc tách tinh sạch, phục vụ cho nghiên cứu phát triển kít phát hiện và antidote chống ĐTT sau này. KẾT LUẬN Đã nuôi cấy cảm ứng VKT sinh độc tố in vitro và tách chiết được ĐTT từ môi trường nuôi cấy bằng phương pháp tủa phân đoạn protein. Sản phẩm độc tố tách chiết được từ Hình 3: Kết quả điện di SDS-PAGE. môi trường nuôi cấy có khả năng gắn đặc hiệu vào thụ thể GM1 và có kích thước (1: Môi trường nuôi cấy chưa kết tủa; 2: Protein sau kết tủa ở 60% sulphat amôn bão hòa; M: thang protein chuẩn). 36 tương ứng với các tiểu phần của ĐTT.