Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sinh học: Chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng phương pháp chỉ thị phân tử cho vùng ven biển Đồng bằng sông Hồng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÊ XUÂN PHƢƠNG

CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN BẰNG

PHƢƠNG PHÁP CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO VÙNG

VEN BIỂN ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Thái Nguyên - 2014

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÊ XUÂN PHƢƠNG

CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN BẰNG PHƢƠNG

PHÁP CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO VÙNG VEN BIỂN

ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ HÙNG LĨNH Thái Nguyên - 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự

hướng dẫn của TS. Lê Hùng Lĩnh, sự giúp đỡ của các cán bộ tại Bộ môn Sinh

học phân tử - Viện Di truyền nông nghiệp. Các số liệu, kết quả trong luận văn

là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn

này.

Thái Nguyên, ngày 19 tháng 9 năm 2014

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Lê Xuân Phƣơng

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn thạc sỹ này, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới

TS. Lê Hùng Lĩnh - Trưởng Bộ môn sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông

Nghiệp, người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình thực hiện đề tài và hoàn chỉnh luận văn của mình.

Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn, giúp đỡ

quý báu, nhiệt tình của tập thể cán bộ thuộc:

1. Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp

2. Khoa Khoa học sự sống, Đại học Khoa học Thái Nguyên

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình,

đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn

cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Thái Nguyên, ngày 19 tháng 9 năm 2014

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Lê Xuân Phƣơng

iii

DANH MỤC BẢNG Tên bảng Bảng Trang

Bảng 1.1. Dự báo mức gia tăng trung bình toàn cầu của nhiệt độ không khí và

mực nước biển theo các kịch bản biến đổi khí hậu khác nhau ......................... 9

Bảng 2.1. Thông tin về các chỉ thị phân tử trên NST1 ................................... 29

Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida..........................35

Bảng 2.3. Đánh giá tiêu chuẩn cải tiến (SES) qua quan sát mức hại của mặn ở

giai đoạn mạ (IRRI, 1997) .............................................................................. 37

Bảng 3.1. Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các giống ........................... 43

478 44 Bảng 3.2.

Bảng 3.3. Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các dòng ............................ 50

Bảng 3.4

2013 tại Giao Thủy, Nam Định................................ 51

Bảng 3.5. Năng suất và các yếu tố cấu tăng năng suất của các dòng tham g

2013..............................................53

Bảng 3.6.

2014 tại Giao Thủy, Nam Định ............................... 55

Bảng 3.7. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất các dòng tham gia thí

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định 2014 .......................................................... 57

iv

trang Hình

DANH MỤC HÌNH Tên hình Hình 1.1. Dự báo sự thay đổi của mực nước biển đến năm 2100 .................... 6

Hình 1.2. Diễn biến nhiệt độ ở quy mô toàn cầu và khu vực ........................... 6

Hình 1.3. Diễn biến của nhiệt độ (a) và lượng mưa (b) ở Việt Nam ............. 11

trong 50 năm .................................................................................................... 11

Hình 1.4. Diễn biến của mực nước biển tại trạm hải văn Hòn Dấu ............... 12

Hình 2.1. Vị trí các chỉ thị trên NST1 và Locus gen Saltol ........................... 28

Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp MABC ………………...……………………33

6 (P1) và 3.1.

FL478 (P2) ...................................................................................................... 46

1F1 ...................................................................... 47

Hình 3.2.

1F1 ............................................................................ 48

Hình 3.3.

1F2 ............................................................................ 49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Hình 3.4.

v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

TT Từ viết tắt Nội dung 1 ANLT 2 BĐKH 3 CNSH 4 Cs 5 CTAB 6 EB 7 ENSO 8 FAO

IPCC 9 An ninh lương thực Biến đổi khí hậu Công nghệ sinh học Cộng sự Cetyl trimethyl amonium bromide Extraction buffer El Nino Southern Oscillation Tổ chức lương thực thế giới Uỷ ban liên chính phủ về biến đổi khí hậu của Liên hiệp quốc

10 IRRI

11 MABC

The International Rice Research Institute - Viện Nghiên cứu lúa quốc tế Marker assisted backcrossing - Chọn giống hồi giao nhờ chỉ thị phân tử Marker assisted selection - Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử Nhiễm sắc thể Polymerase Chain Reaction - Phản ứng trùng hợp chuỗi 12 MAS 13 NST 14 PCR

15 QTL/QTLs

16 SSR

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Quantitative Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số lượng Simple Sequence repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn giản Tris - Bric Acid - EDTA Tris - EDTA Thời gian sinh trưởng Ngân hàng thế giới 17 TBE 18 TE 19 TGST 20 WB

vi

MỤC LỤC Lời cam đoan ................................................................................................................... i

Lời cám ơn ...................................................................................................................... ii

Danh mục bảng .............................................................................................................. iii

Danh mục hình ............................................................................................................... iv

Danh mục các từ viết tắt ................................................................................................. v

Mục lục ........................................................................................................................... vi

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1

1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài .................................................................. 2

3. Nội dung Nghiên cứu ................................................................................2 4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3

4.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 3

4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3

5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ............................................. 4

5.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................. 4

5.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................... 4

Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 5

1.1. Tình hình của BĐKH trên Thế giới và Việt Nam ...................................... 5

1.1.1. Tình hình của BĐKH trên Thế giới ........................................................ 5

1.1.2. Ảnh hưởng của BĐKH tại Việt Nam .................................................... 10

1.2. Nghiên cứu di truyền và chọn giống lúa chịu mặn .................................. 13

1.2.1. Cơ sở di truyền tính chống chịu mặn ở cây lúa .................................... 13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

1.2.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn .............. 16

vii

1.2.3. Nghiên cứu lập bản đồ QTL/gen Saltol chịu mặn từ giống lúa Pokkali ... 18

1.2.4. Ứng dụng phương pháp chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử trong tạo

giống lúa chịu mặn .......................................................................................... 19

1.2.5. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong nước ........... 23

Chƣơng 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 28

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 28

2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 30

2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 30

2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 30

2.4.1. Phương pháp lai hữu tính giữa giống lúa cho và nhận gen ................... 30

2.4.2. Phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) ........... 32

2.4.3. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng .................................................... 34

2.4.4. Phương pháp thử độ mặn nhân tạo........................................................ 34

2.4.5. Phương pháp tách chiết DNA và phân tích di truyền chỉ thị phân tử ... 37

Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 43

3.1. Kết quả đánh giá xác định vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu chọi tạo giống

lúa chịu mặn .................................................................................................... 43

3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa trong điều kiện

nhân tạo ........................................................................................................... 43

3.1.2. Kết quả ịnh vật liệu bố mẹ

.......................................................................................... 44

3.2. Kết quả chọn tạo dòng lúa chịu mặn từ tổ hợp lai TL6/FL478 ............... 45

3.2.1. Kết quả kiể ữa FL478 và TL6 . 45

ử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

chịu mặn trong quần thể BC1F1. ...................................................................... 47

viii

3.2.3. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn

trong quần thể BC1F2 ....................................................................................... 48

3.3. Đánh giá vật liệu sử dụng trong nghiên cứu và chọn tạo giống lúa chịu mặn .. 49

3.3.1. Đánh giá tính chịu mặn của các dòng lúa chọn tạo trong điều kiện nhân tạo. . 49

3.3.2. Đánh giá các đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất và khả

năng chịu mặn của các dòng được tạo ra mang QTL/Saltol trong vụ mùa 2013. . 51

3.3.3. Đánh giá các đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất và khả năng

chịu mặn của các dòng được tạo ra mang QTL/Saltol trong vụ xuân 2014 ........... 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 59

1. Kết luận ....................................................................................................... 59

2. Kiến nghị ..................................................................................................... 59

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Tài liệu tham khảo ...................................................................................................... 60

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Biến đổi khí hậu (BĐKH) là một trong những thách thức lớn nhất đối

với nhân loại trong thế kỷ 21. BĐKH dẫn đến nhiều thay đổi bất thường của

thời tiết, tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống và môi trường. BĐKH

còn làm tăng tính biến động và tính cực đoan của các hiện tượng thời tiết

nguy hiểm như bão, tố, lốc, các thiên tai thời tiết khô nóng, lũ, ngập úng, hay

hạn hán, rét hại, xâm nhập mặn, sâu bệnh, làm ảnh hưởng rất lớn đến sản xuất

nông nghiệp. Hậu quả của BĐKH đối với Việt Nam là nghiêm trọng và là

một nguy cơ hiện hữu cho mục tiêu xoá đói giảm nghèo, cho việc thực hiện

các mục tiêu thiên niên kỷ và sự phát triển bền vững của đất nước.

Cây lúa là cây trồng quan trọng nhất ở Việt Nam, đồng thời cũng là

nguồn thức ăn quan trọng nhất cho một nửa dân số thế giới. Việt Nam là

nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 2 trên thế giới sau Thái Lan. Lúa gạo là

nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp xuất khẩu Việt Nam và

cũng là nguồn thức ăn chính của 86 triệu dân số trong nước. Đồng bằng Sông

Hồng và đồng bằng sông Cửu Long có sản lượng gạo lần lượt là 17% và 50%

[5]. Đáp ứng sản lượng lúa ở Việt Nam là rất cần thiết cho ứng phó với điều

kiện biến đổi khí hậu. Do vậy, chọn tạo giống lúa năng suất cao chống chịu

mặn là hết sức cần thiết và có ý nghĩa cho an toàn lương thực và tăng thu

nhập của nông dân tại vùng chịu ảnh hưởng của biến đổi khí hậu.

Chọn giống bằng chỉ thị phân tử (Marker assisted selection - MAS) là

phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc chuyển locus gen quy định tính

trạng di truyền số lượng (Quantitative Trait Loci - QTL) hay gen đích vào

giống mới. Phương pháp MAS cho phép rút ngắn quá trình chọn lọc, chọn lọc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

được những tính trạng khó và đắt tiền hay nhiều gen cùng một lúc. Chọn

2

giống bằng MAS sẽ giảm được giá thành và thời gian. Chọn giống nhờ chỉ thị

phân tử là kỹ thuật hiệu quả cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen của từng cá

thể trong quần thể. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử có thể sử dụng chỉ thị để

kiểm tra di truyền của dòng bố mẹ và các cá thể con lai. Từ đó có thể kiểm

soát được các alen đặc biệt trong các cá thể của quần thể.

Bằng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker

assisted backcrossing - MABC), các nhà chọn giống các nước pháp triển trên

thế giới đã thành công mang lại kết quả trong việc tạo ra các giống lúa vừa có

năng suất cao, vừa có khả năng chống chịu với các điều kiện phi sinh học bất

lợi như ngập chìm, mặn và chống chịu sâu bệnh. Những giống lúa này có thể

giúp cho các vùng bờ biển giảm bớt thiệt hại do ảnh hưởng của biến đổi khí

hậu [21], [22]. Từ những vấn đề nêu trên, việc ứng dụng công nghệ chọn

giống nhờ chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa có năng suất cao, có khả năng

chống chịu mặn là một vấn đề cấp thiết. Vì vậy chúng tôi xây dựng đề tài:

“Chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng phương pháp chỉ thị phân tử cho vùng

ven biển Đồng bằng sông Hồng”.

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Sử dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử chọn tạo giống lúa

chịu mặn đáp ứng nhu cầu giống lúa cho vùng ven biển Đồng bằng Sông

Hồng ứng phó với tác động biến đổi khí hậu.

3. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu đánh giá vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu chọn tạo giống

lúa chịu mặn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

- Ứng dụng chỉ thị phân tử xác định cá thể mang locus gen Saltol.

3

- Đánh giá và trồng thử nghiệm các dòng chịu mặn được chọn tạo bằng

phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử. Xác định các dòng chịu mặn

triển vọng phục vụ công tác phát triển giống lúa chịu mặn cho sản xuất.

4. Ý nghĩa của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học

Ứng dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống

lúa chịu mặn giúp chọn lọc nhanh và chính xác nguồn gen chịu mặn ở các thế

hệ chọn tạo giống, nhờ vậy có thể rút ngắn thời gian chọn lọc trên đồng

ruộng, giảm số lượng cá thể gieo trồng hàng vụ, giảm diện tích gieo trồng,

giảm lao động nặng nhọc, giảm chi phí cho những thí nghiệm đồng ruộng

góp phần tăng đầu tư cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm một cách chuẩn

mực.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

- Những thành công bước đầu trong việc ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn

lọc các cá thể lai sẽ mở ra hướng ứng dụng rộng rãi trong công tác chọn tạo

giống nói chung, không chỉ với đặc tính chịu mặn mà còn đối với nhiều đặc

tính nông sinh học quý khác.

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ chọn tạo ra một số dòng/giống lúa chịu

mặn cho các vùng ven biển Đồng bằng Sông Hồng nơi chịu ảnh hưởng nặng

nề của biến đối khí hậu.

- Bổ sung thêm cơ sở lý luận trong công tác chọn tạo giống lúa bằng chỉ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

thị phân tử nhưng vẫn kế thừa các phương pháp chọn giống truyền thống.

4

5. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

5.1. Đối tƣợng nghiên cứu

- Giống lúa FL478 là thuần mang QTL/Saltol (gen chịu mặn) được nhập từ Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (The International Rice Research Institute - IRRI).

- Giống TL6 Là giống lúa chịu thâm canh khá, chống chịu tốt với một số sâu bệnh hại chính như: bệnh Đạo ôn, khô vằn và bạc lá. Phẩm chất gạo ngon, thơm, cơm mềm, nhưng không dính. Gieo cấy được 2 vụ trong năm, có tiềm năng cho năng suất cao.

- Các chỉ thị phân tử có liên quan được sử dụng trong nghiên cứu.

5.2. Phạm vi nghiên cứu

Thí nghiệm được triển khai tại: Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp (Từ Liêm, Hà Nội); Huyện Giao Thuỷ, Nam Định.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2012 đến năm 2014.

5

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình của BĐKH trên Thế giới và Việt Nam

1.1.1. Tình hình của BĐKH trên Thế giới

Biến đổi khí hậu là do các hoạt động trực tiếp và gián tiếp của con

người gây ra, nó làm thay đổi các thành phần trong khí quyển toàn cầu.

BĐKH đã và đang gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến cuộc sống của con

người trên mọi lĩnh vực, cả về môi trường và kinh tế-xã hội. Trong 150 năm qua, nhiệt độ bình quân bề mặt trái đất giai đoạn 1900-2005 tăng khoảng 0,80 C; nhiệt độ đại dương tăng 0,50 C nhiệt độ bình quân bề mặt toàn cầu đã tăng 0,760C [20]. Sự nóng lên toàn cầu đã gây nên khí hậu thay đổi nhiều hơn, như

những biến đổi của mưa và gia tăng tần suất, cường độ và tính biến động và

tính cực đoan của các hiện tượng thời tiết nguy hiểm như bão, lốc, các thiên

tai liên quan đến nhiệt độ và mưa như thời tiết khô nóng, lũ, ngập lụt, hạn

hán, rét hại, xâm nhập mặn, dịch bệnh và dẫn đến mực nước biển bình quân

toàn cầu dâng cao.

Theo các nhà khoa học về BĐKH toàn cầu và nước biển dâng cho thấy,

đại dương đã nóng lên đáng kể từ cuối thập kỷ 1950. Các nghiên cứu từ số

liệu quan trắc trên toàn cầu cho thấy, mực nước biển trung bình toàn cầu

trong thời kỳ 1961-2003 đã dâng với tốc độ 0,5 - 1,8mm/năm [20]. Dự báo sự

thay đổi của mực nước biển và diễn biến nhiệt độ ở quy mô toàn cầu đến năm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2100 thể hiện ở hình 1.1 và hình 1.2

6

Hình 1.1. Dự báo sự thay đổi của mực nước biển đến năm 2100 (Nguồn: IPCC, 2007) [20]

Hình 1.2. Diễn biến nhiệt độ ở quy mô toàn cầu và khu vực

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

(Nguồn: IPCC AR4 WG-I Report, 2007) [20]

7

Các từ viết tắt:

- CCSR/NIES: Trung tâm nghiên cứu hệ thống khí hậu và Viện nghiên

cứu môi trường Quốc gia; Sử dụng mô hình CCSR/NIES AGCM + CCSR

OGCM Models 1890-2100.

- CCCma: Trung tâm phân tích và xây dựng mô hình khí hậu Canada.

Sử dụng mô hình CGCm2 Model 1900-2100

- CSIRO: Tổ chức nghiên cứu công nghiệp và khoa học về sức khỏe. Sử

dụng mô hình CSIRO-Mk2 model 1961-2100.

- Hadley Centre: Trung tâm nghiên cứu và dự báo khí hậu Hadley. Sử

dụng mô hình HADCM3 model 1950-2099.

- GFDL: Phòng nghiên cứu biến động các chất lỏng theo địa vật lý. Sử

dụng mô hình R30 Model 1961-2100.

- MPI-M: Viện khí tượng Max Planck. Sử dụng mô hình

ECHAM4/OPYC coupled model 1990-2100.

- NCAR PCM: Trung tâm nghiên cứu khí quyển Quốc gia Mỹ. Sử dụng

mô hình PCM model 1980-2099.

- NCAR CSM: Trung tâm cứu khí quyển Quốc gia Mỹ. Sử dụng mô

hình CSM Model 2000-2099.

Tuy nhiên, mực nước biển thay đổi không đồng đều trên toàn bộ đại

dương thế giới: Một số vùng tốc độ dâng có thể gấp một vài lần tốc độ dâng

trung bình toàn cầu trong khi mực nước biển ở một số vùng khác lại có thể hạ

thấp. Xu thế tăng của mực nước trung bình xuất hiện hầu hết tại các trạm

quan trắc trên toàn cầu, mặc dù, vẫn xuất hiện một số khu vực có xu hướng

giảm như ở bờ biển phía Đông của Nam Mỹ và khu vực ven biển phía Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Alaska và Đông Bắc Canada, vùng biển Scandinavia. Theo một số báo cáo

8

của các nhà khoa học, trong thập kỷ vừa qua, mực nước biển dâng nhanh nhất

ở vùng phía Tây Thái Bình Dương và phía Đông Ấn Độ Dương [20].

BĐKH đã ảnh hưởng trực tiếp đến ngành nông nghiệp, đây là ngành

cung cấp lương thực chính cho con người đang phải đứng trước thách thức vô

cùng to lớn, những khu vực tập trung trồng lúa nhiều nhất trên thế giới lại có

nguy cơ bị xâm nhiễm mặn khi mực nước biển dâng cao. Do đó, cần phải có

các giống lúa có khả năng chịu được ngập và độ mặn cao.

Bên cạnh đó, theo báo cáo của FAO (2010), trên 800 triệu ha đất trên

toàn thế giới bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi muối và khoảng 20% diện tích

tưới (khoảng 45 triệu ha) được ước tính bị vấn đề xâm nhiễm mặn theo mức

độ khác nhau. Mặt khác, tài liệu “Tác động của mực nước biển dâng cao đến

các nước đang phát triển: Phân tích so sánh” của Ngân hàng Thế giới (WB)

thực hiện tháng 2/2007 đã đánh giá các tác động của mực nước biển dâng cao

đối với tất cả các nước đang phát triển bằng cách sử dụng bộ chỉ số đồng nhất

các chỉ thị và với các kịch bản khác nhau về mực nước biển dâng cao. WB đã

chia 84 nước đang phát triển ở ven biển thành 5 nhóm theo 5 văn phòng khu

vực của WB gồm: Mỹ Latin và Caribê (25 nước); Trung Đông và Bắc Phi (13

nước); Châu Phi cận Xahara (29 nước); Đông Á (13 nước); và Nam Á (4 nước). Các kết quả nghiên cứu cho thấy 0,31% (194.309 km2) vùng lãnh thổ

của 84 nước đang phát triển bị ảnh hưởng khi mực nước biển dâng cao 1m.

Tỷ lệ bị ngập có thể tăng lên 1,2% theo kịch bản nước biển dâng cao 5m. Cho

dù tỷ lệ này nhỏ song sẽ có khoảng 56 triệu người (hay 1,28% dân số) ở 84

nước đang phát triển bị ảnh hưởng khi mực nước biển dâng cao 1m. Với kịch

bản nước biển dâng cao 1m, Bahamas (khu vực Mỹ latinh và Caribê) là nước

bị ảnh hưởng nặng nhất xét về diện tích bị ảnh hưởng (12% tổng diện tích).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Việt Nam đứng đầu danh sách 10 nước bị ảnh hưởng về dân số, khu vực đô

9

thị và đất ngập nước (khoảng 10%). Nông nghiệp của Ai Cập bị ảnh hưởng

nhiều nhất, gần 13%. 28% diện tích đất ngập nước của Việt Nam, Jamaica và

Belize có thể bị ảnh hưởng khi mực nước biển dâng cao 1m. Xét về tất cả các

chỉ thị, theo Báo cáo của WB, Việt Nam nằm trong danh sách 5 nước bị ảnh

hưởng nhiều nhất cùng với Ai Cập, Suriname và Bahamas [14].

Dự báo mức gia tăng trung bình toàn cầu của nhiệt độ không khí và

mực nước biển theo các kịch bản biến đổi khí hậu khác nhau được thể hiện ở

bảng 1.1.

Biến đổi của nhiệt độ (0C) (Giai đoạn 2090 – 2099 so với giai đoạn 1980-1999)a

Mức dâng cao của mục nước biển(m) (Giai đoạn 2090 – 2099 so với giai đoạn 1980 – 1999)

Trường hợp

Đánh giá tốt nhất

Phạm vi có thể xảy ra

Phạm vi mô hình cơ sở ngoai trừ sự biến đổi động lực của dòng chảy băng trong tương lai

0,6

0,3 - 0,9

-

Hàm lượng KNK không đổi ở mức năm 2000b

Kịch bản B1

1,8

1,1 – 2,9

0,18 – 0,38

Kịch bản A1T

2,4

1,4 – 3,8

0,20 – 0,45

Kịch bản B2

2,4

1,4 – 3,8

0,20 – 0,43

Kịch bản A1B

2,8

1,7 – 4,4

0,21 – 0,48

Kịch bản A2

3,4

2,0 – 5,4

0,23 – 0,51

Kịch bản A1F1

4,0

2,4 – 6,4

0,26 – 0,59

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Bảng 1.1. Dự báo mức gia tăng trung bình toàn cầu của nhiệt độ không khí và mực nước biển theo các kịch bản biến đổi khí hậu khác nhau (Nguồn: IPCC 2007) [20]

10

Ghi chú:

- a: Sự đánh giá này được đánh giá từ một hệ thống mô hình, bao gồm

một mô hình khí hậu đơn giản, một số mô hình Trái đất có mức tạp vừa phải

và số lớn mô hình hoàn lưu toàn cầu khí quyển – đại dương (AOGCMs).

- b: Hàm lượng khí nhà kính (KNK) cố định năm 2000 được lấy từ

AOGCMs.

1.1.2. Ảnh hƣởng của BĐKH tại Việt Nam

Cũng như các nước khác trên thế giới, khí hậu đã, đang và sẽ biến đổi

trên lãnh thổ Việt Nam. Kết quả phân tích các số liệu khí hậu cho thấy những

biến đổi chủ yếu của các yếu tố khí hậu và mực nước biển như sau:

- Nhiệt độ: Trong 50 năm qua (1958 - 2007), nhiệt độ trung bình năm ở Việt Nam tăng lên khoảng từ 0,50C đến 0,70C. Nhiệt độ mùa đông tăng nhanh

hơn nhiệt độ mùa hè và nhiệt độ ở các vùng khí hậu phía Bắc tăng nhanh hơn

ở các vùng khí hậu phía Nam (hình1.3a). Nhiệt độ trung bình năm của 4 thập

kỷ gần đây (1961 - 2000) cao hơn trung bình năm của 3 thập kỷ trước đó

(1931 - 1960). Nhiệt độ trung bình năm của thập kỷ 1991 - 2000 ở Hà Nội,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Đà Nẵng, thành phố Hồ Chí Minh đều cao hơn trung bình của thập kỷ 1931 - 1940 lần lượt là 0,8; 0,4 và 0,60C. Năm 2007, nhiệt độ trung bình năm ở cả 3 nơi trên đều cao hơn trung bình của thập kỷ 1931 - 1940 là 0,8 - 1,30C và cao hơn thập kỷ 1991 - 2000 là 0,4 - 0,50C.

11

Hình 1.3. Diễn biến của nhiệt độ (a) và lượng mưa (b) ở Việt Nam trong 50 năm

- Lượng mưa: Trên từng địa điểm, xu thế biến đổi của lượng mưa trung

bình năm trong 9 thập kỷ vừa qua (1911 - 2000) không rõ rệt theo các thời kỳ

và trên các vùng khác nhau: có giai đoạn tăng lên và có giai đoạn giảm

xuống. Lượng mưa năm giảm ở các vùng khí hậu phía Bắc và tăng ở các

vùng khí hậu phía Nam (hình 1.3b). Tính trung bình trong cả nước, lượng

mưa năm trong 50 năm qua (1958 - 2007) đã giảm khoảng 2%.

- Tần suất và cường độ El Nino tăng lên rõ rệt trong những thập niên

gần đây. Trong 5 thập niên gần đây, tác động của hiện tượng ENSO ngày

càng mạnh mẽ đối với chế độ thời tiết và khí hậu trên nhiều khu vực ở Việt

Nam. Biến đổi của ENSO và tác động của nó đến sự biến đổi của gió mừa sẽ

ảnh hưởng mạnh hơn đối với sự biến đổi của mưa. Hiện tượng ENSO cũng

ảnh hưởng đến sự thay đổi sự xuất hiện, cường độ và các đặc trưng của xoáy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

thuận nhiệt đới và sự biến đổi của nó giữa các năm.

12

- Mực nước biển: Số liệu quan trắc tại các trạm hải văn dọc ven biển

Việt Nam cho thấy tốc độ dâng lên của mực nước biển trung bình ở Việt Nam

hiện nay là khoảng 3mm/năm (giai đoạn 1993 - 2008), tương đương với tốc

độ tăng trung bình trên thế giới. Trong khoảng 50 năm qua, mực nước biển

tại trạm hải văn Hòn Dấu dâng lên khoảng 20cm. (hình 1.4).

Hình 1.4. Diễn biến của mực nước biển tại trạm hải văn Hòn Dấu [20]

Mực nước biển dâng cao dẫn đến mặn xâm nhập sâu vào hệ thống

sông ngòi, kênh rạch và tầng chứa nước ngầm ở đồng bằng châu thổ sông

Hồng – Thái Bình, Đồng bằng sông Cửu Long và đồng bằng ven biển miền

Trung, làm cho nước nhạt (nước ngọt) bị nhiễm mặn và do đó làm giảm

lượng nước nhạt có thể khai thác, sử dụng. Theo kết quả các kịch bản biến

đổi khí hậu đã được đưa ra, nếu mực nước biển có thể dâng cao 0,75 – 1 m

so với thời kỳ 1980 – 1999, thì khoảng 20 – 38% diện tích Đồng bằng sông

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Cửu Long và đồng bằng sông Hồng bị ngập, là hai vùng sản xuất lúa chính

13

của Việt Nam và do đó ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất lương thực để

cung cấp cho hơn 86 triệu dân Việt Nam và gần 100 triệu dân trên thế giới. Việt Nam có bờ biển dài khoảng 3260 km, hơn một triệu km2 lãnh hải và

trên 3000 hòn đảo gần bờ và hai quần đảo xa bờ là Hoàng Sa và Trường Sa,

nhiều vùng đất thấp ven biển. Nước biển dâng cùng với nước dâng do bão,

sóng lớn, triều cường ảnh hưởng lớn đến hạ tầng cơ sở (hệ thống đê biển,

bờ bao, giao thông, du lịch, công trình dân sinh và quốc phòng…) vùng ven

bờ biển và những vùng đất thấp nằm dọc theo bờ biển. Nước biển dâng

cũng sẽ tác động đến các đầm phá, vũng vinh, đảo nhỏ, các cồn cát và bãi

tắm, các bãi phù sa, đánh bắt và nuôi trồng thủy sản.

Ở Việt Nam là một trong 5 nước trên thế giới được đánh giá là sẽ chịu

ảnh hưởng nghiêm trọng của BĐKH và nước biển dâng. Trong đó, đồng bằng

châu thổ sông Hồng và sông Cửu Long là hai vùng chịu tác động BĐKH và

nước biển dâng nhiều nhất. Đây là hai vùng sản xuất nông nghiệp chính của

Việt Nam nhưng địa hình thấp, phần lớn chỉ cao hơn 1 m so với mực nước

biển, thậm chí có nơi thấp dưới mực nước biển. Theo kết quả các kịch bản

biến đổi khí hậu đã được đưa ra, nếu mực nước biển có thể dâng cao 0,75

đến1m so với thời kỳ 1980 – 1999, thì khoảng 20 – 38% diện tích Đồng bằng

sông Cửu Long và đồng bằng sông Hồng bị ngập và do đó ảnh hưởng nghiêm

trọng đến sản xuất lương thực để cung cấp cho hơn 86 triệu dân Việt Nam và

gần 100 triệu dân trên thế giới.

1.2. Nghiên cứu di truyền và chọn giống lúa chịu mặn

1.2.1. Cơ sở di truyền tính chống chịu mặn ở cây lúa

Lúa (Oryza sativa L.) là cây rất nhậy cảm với những yếu tố gây stress

phi sinh học như mặn, khô hạn, nhiệt độ... Đất mặn là yếu tố chính làm giảm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

năng suất, sản lượng của lúa. Người ta tập trung sự chú ý vào đối tượng mặn

14

đây là dạng gây stress quan trọng đối với sản xuất lúa, và đặt ra mục tiêu

hướng tới để cải tiến giống lúa trên qui mô toàn cầu. Xác định gen chống

chịu mặn là trọng tâm quan trọng trong chọn giống lúa, nó có những khó

khăn nhất định mà nhà chọn giống phải đối mặt như: Nguồn gen kháng khan

hiếm, tính trạng chống chịu mặn là tính trạng di truyền số lượng (Quantitative

trait loci), cơ chế chống chịu mặn phức tạp, và rất khó để đánh giá chính xác

những tính trạng sinh lý liên quan đến khả năng chịu mặn. Có một số phương

pháp chọn giống chống chịu mặn được các nhà chọn giống thường xuyên áp

dụng như, cải tạo các giống lúa địa phương có khả năng chống chịu mặn bằng

cách gây đột biến hay lai tạo rồi chọn lọc theo phương pháp truyền thống. Sử

dụng công nghệ sinh học bằng cách tạo mô sẹo (callus) từ phôi hay nuôi cấy

bao phấn, sàng lọc và tái sinh cây trong môi trường bổ xung hàm lượng NaCl

với nồng độ khác nhau, hay chuyển gen chịu mặn vào giống có tiềm năng

năng suất nhưng mẫn cảm với mặn. Biện pháp chọn tạo giống lúa chống chịu

mặn nhờ chỉ thị phân tử (MAS) tỏ ra là phương pháp hiệu quả, chính xác đã

được các nhà chọn giống sự dụng trong những năm gần đây trên thế giới.

Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh yếu tố di truyền tính chống chịu

mặn biến động khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa

chống chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính

chống chịu mặn, từ đó loại bỏ ở ngay từ những thế hệ đầu, những dòng không

đáp ứng được yêu cầu của người chọn giống. Nghiên cứu di truyền số lượng

tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính

và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn

[19], [25].

Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn tại giai đoạn mạ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

của cây lúa trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn tương đối cao

15

(EC = 12 dSm-1) trong môi trường kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh;

người ta thấy, tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi,

khối lượng khô của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa

giống chống chịu và giống nhiễm, tính trạng này chủ yếu được điều khiển do

hoạt động của nhóm gen cộng tính. Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua

các tính trạng này rất thấp [38]. Trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa tính

trạng chiều cao cây, năng suất trong điều kiện mặn được điều khiển bởi

những gen cộng tính [28].

Do ảnh hưởng lớn của môi trường bên ngoài, sự thể hiện di truyền là

rất thấp trong các tính trạng. Phương pháp chọn giống chống chịu mặn có thể

dùng phương pháp trồng dồn có cải tiến hoặc có thể dùng phương pháp chọn

lọc cá thể (single seed descent) sẽ là thích hợp trong chọn giống chịu mặn.

Bằng phương pháp lai diallel đầy đủ, Gregorio và Senadhina (1993) cho rằng,

có thể tìm ra một số cặp lai tốt phục vụ cho chương trình ưu thế lai. Nghiên

cứu về di truyền số lượng tính chống chịu mặn thông qua lai diallel 6 x 6,

năng suất thể hiện hoạt động của nhóm gen cộng tính không có ý nghĩa trong

điều kiện bình thường, nhưng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử lý mặn.

Năng suất lúa bị giảm là do ảnh hưởng của mặn. Trong một số giống lúa, ưu

thế hoạt động của gen cộng tính đối với năng suất là điều kiện thuận lợi cho

chọn lọc giống trong môi trường mặn [19].

Nghiên cứu về các thông số di truyền Mishra và cs, (1996) cho rằng,

chiều dài bông và khối lượng 1000 hạt chịu tác động rất ít bởi các yếu tố môi

trường, nếu như chọn giống chống chịu mặn dựa vào hai tính trạng này là

không có hiệu quả. Khối lượng bông, số hạt chắc trên bông, chiều cao cây có

hệ số path rất cao trong môi trường mặn. Chính ba tính trạng này đóng góp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi trường mặn, nhất là khối

16

lượng bông và số hạt chắc trên bông [29]. Narayanan và cs., (1990) cho rằng,

số hạt chắc trên bông, chiều dài bông là tính trạng chính đóng góp vào năng

suất của các giống lúa trong những vùng đất bị nhiễm mặn[32].

1.2.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền và phục vụ cho công

tác chọn giống cây trồng đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới

triển khai rộng rãi. Nhiều bản đồ phân tử cùng vị trí các gen kiểm soát các

tính trạng khác nhau đã được xác định và ứng dụng trong chọn giống. Đi tiên

phong trong lĩnh vực này là các nhà khoa học ở Trường Đại học tổng hợp

Cornel (Mỹ), đã thiết lập lên bản đồ di truyền phân tử đầu tiên ở lúa. Đến

nay, hàng chục nghìn chỉ thị phân tử SSR (vi vệ tinh) ở lúa đã được xác định,

trong đó có nhiều chỉ thị liên kết với gen có ý nghĩa kinh tế quan trọng. Với

việc sử dụng chỉ thị phân tử trong phân tích di truyền, hàng nghìn QTLs đã

được phát hiện cho các tính trạng khác nhau ở cây lúa như chịu hạn, chịu

mặn, chịu độc nhôm, chịu thiếu phốt-pho, bất dục đực nhân nhậy cảm quang

chu kỳ, bất dục đực nhân nhậy cảm nhiệt độ, gen tương hợp rộng... Phân tích,

lập bản đồ di truyền phân tử đã được thiết lập rất phổ biến bằng việc sử dụng

quần thể phân ly F2 hay dòng cập phối (RIL) từ tổ hợp lai xa về di truyền như

giữa hai loài phụ Indica và Japonica, thế hệ tái tổ hợp thu được nhiều đa hình

hơn là trong cùng loài phụ. Như vậy đối với tính chịu mặn, việc phân tích các

tính trạng phức tạp liên quan đến tính chịu mặn có nghĩa là việc hiểu rõ bản

đồ gen QTLs sẽ cung cấp thông tin hữu ích cho việc làm tăng tính chịu mặn

cho lúa. Các phân tích QTL về tính chịu mặn của lúa đã được tiến hành bằng

các chỉ thị phân tử trong nhiều nhóm nghiên cứu. Nhiều bản đồ di truyền

phân tử đã được thiết kế với việc sử dụng quần thể F2 hoặc tái tổ hợp [31],

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

[40], [41], [42], hoặc quần thể cây đơn bội kép [27], [43].

17

Năm 2000, Prasad và cs đã xác định được bẩy QTL cho tính trạng cây mạ

liên quan với khả năng chống chịu mặn trên các nhiễm sắc thể khác nhau.

Zhang và cs (1995) đã phát hiện QTLs cho trọng lượng 1000 hạt trên nhiễm

sắc thể số 7 bằng cách sử dụng quần thể F2 dưới điều kiện có NaCl. Năm

2000, Prasad và cs đã xác định được QTLs cho các tính trạng của cây giống

như sự nảy mầm của hạt, chiều dài rễ, trọng lượng khô và sức sống của cây

con dưới tác động của muối (salt stress) bằng cách sử dụng một quần thể đơn

bội kép xuất phát từ lai giữa các giống Indica và Japonica. Năm 2001, Koyama và cs đã phát hiện ra QTLs cho việc thu nhận Na+, K+ và tỷ lệ Na+ : K+ trong chồi non. Tương tự như vậy Lin và cs (2004) đã công bố một số QTLs cho các tính trạng lý sinh như thu nhận Na+, K+ và tỷ lệ Na+ : K+ trong

rễ và chồi bằng cách sử dụng quần thể F2, F3 bắt nguồn từ việc lai chéo giữa

hai giống Koshihikari và Nona Bokra. Những nghiên cứu trước đây về tính

chịu mặn của lúa cũng đã được thực hiện bằng cách sử dụng các quần thể F2,

RILs hoặc DH. Prasad và cs, (2000) đã lập bản đồ một số QTL liên kết khả

năng chịu mặn ở giai đoạn mạ trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Sử dụng

quần thể F2 từ giống lúa Japonica chịu mặn và giống lúa thường nhiễm mặn

77-170A. Zhang và cs (1995) đã xác định được gen chịu mặn chính nằm trên

nhiễm sắc thể số 1. Lin và cs (2004), Ren và cs (2005) cùng xác định QTL

liên kết với khả năng chịu mặn trên nhiễm sắc thể số 1 [24], [26], [34], [35],

[36], [44].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Tính chịu mặn của lúa có thể phụ thuộc vào các chất vận chuyển chất truyền vận K+ ái lực cao, những chất này làm trung gian cho chất vận chuyển chuyên biệt Na+ hoặc chất truyền vận Na+- K+ và giữ một vai trò quan trọng trong điều hoà sự ổn định Na+ [30].

18

1.2.3. Nghiên cứu lập bản đồ QTL/gen Saltol chịu mặn từ giống lúa

Pokkali

Giống Pokali là giống lúa chịu mặn điển hình, Pokali đã và đang được

các nhà chọn giống trên thế giới chọn là giống cho gen chịu mặn trong

chương trình chọn giống của mình. Những nghiên cứu đã xác định được rõ

những đặc điểm sinh thái học cũng như mức độ phân tử về khả năng chịu

mặn của giống Pokali. Khả năng chịu mặn được thể hiện ở cả hai khả năng là duy trì thấp tỷ lệ Na+/K+ ở chồi và phát triển nhanh trong điều kiện mặn [23].

Gegorio và cs (2002) đã xác định QTL chính, tên là Saltol trên nhiễm sắc

thể số 1 tại vị trí giữa hai SSR marker RM23 và RM140 từ quần thể lai giữa

giống chịu mặn điển hình Pokkali và giống IR29. QTL Saltol có độ dài

khoảng 1cM quyết định tới khoảng 40 – 65% tính chống chịu mặn của lúa.

Giống Pokkali là giống mang alleles trội với khả năng chịu mặn. [18]

Mohammadi – Nejad và cs., (2008) đã lập bản đồ chi tiết cho QTL chịu

mặn Saltol bằng những chỉ thị phân tử vệ tinh SSR trên nhiễm sắc thể số 1. 6

marker là: RM10745, RM1287, RM8094, RM3412, RM493 và RM140 liên

kết chặt với đoạn Saltol ở vị trí 10.8 đến 12.28 Mb. Xác định lập bản đồ QTL

Saltol chịu mặn đã được một số nhà khoa học Viện nghiên cứu lúa quốc tế

IRRI nghiên cứu và khẳng định lại khả năng chịu mặn của Saltol.

Michael J. Thomson và cs (2010) đã sử dụng 140 dòng tái tổ hợp (RILs)

từ tổ hợp lai giữa IR29/Pokkali xác định lại Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 và

xác định thêm một số QTL chịu mặn khác. Kết quả đã xác định được 2 QTL

chịu mặn, một trên nhiễm sắc thể số 4 và một trên nhiễm sắc thể số 9. QTL cho tỷ lệ Na+/K+ được xác định trên nhiễm sắc thế số 6. Bản đồ chi tiết cho

QTL saltol cũng được tác giả xác định liên kết với những chỉ thị phân tử SSR

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

trên nhiễm sắc thể 1 [39].

19

1.2.4. Ứng dụng phƣơng pháp chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử

trong tạo giống lúa chịu mặn

Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết

với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương

tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới. Ở đây, thay vì phải đánh giá

kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong

muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình

thái liên kết với các gen đó. Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng

không nhiều, còn những chỉ thị “may mắn” (liên kết với gen quan tâm) lại

càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống

gặp nhiều hạn chế. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử,

các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm mạnh mẽ hơn tới vấn đề “chọn giống

nhờ chỉ thị phân tử” (Marker-assisted selection = MAS) với ý đồ sử dụng các

chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới.

So với chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử có những ưu thế sau:

a. Kiểu gen của các lôcút chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất

kỳ giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: Tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể,

trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt

được trong những giai đoạn nhất định và thường ở mức độ toàn bộ cơ thể.

b. Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lượng các

chỉ thị hình thái rất hạn chế.

c. Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với các

hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi

kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

d. Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho

20

phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các

chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội-lặn, do đó bị hạn chế sử dụng

trong nhiều tổ hợp lai.

e. Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc

đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với

chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp.

Ngày nay, phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một phương

tiện hữu hiệu trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục

những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết. Sự

phát triển của công nghệ chỉ thị phân tử đã giải phóng các nhà chọn giống

khỏi một lượng lớn công việc khi phải chọn lọc, phát hiện một lượng ít ỏi

những cá thể quan tâm trong số vô vàn các cá thể khác nhờ việc xác định sự

có mặt hay vắng mặt của những chỉ thị phân tử liên kết với những alen đặc

hiệu mà không cần đánh giá kiểu hình. Phương pháp này còn có thể giúp ta

chọn lọc những cá thể mang những tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu

do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra - những tương tác

này thường không thể phát hiện được bằng các phân tích kiểu hình. Phương

pháp này đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa gen lặn hoặc thậm chí

đưa cùng lúc nhiều gen khác nhau vào một genôm đích.

Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các

chương trình chọn giống với các ưu điểm sau:

- Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi

nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai

đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn

giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ứng chu kỳ quang).

21

- Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này

khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ như hình thái rễ, tính kháng nhiễm đối

với các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính kháng

những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc).

- Khả năng phân biệt trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử của nhiều

lôcut trong cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế hệ sau.

- Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do

vậy mà có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví dụ đưa

vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau. Trong trường hợp này,

các phương pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thông qua sự lây nhiễm (đồng

thời hoặc thậm chí lần lượt từng thể gây bệnh hay từng côn trùng gây hại) rất

khó đạt được kết quả, nếu không muốn nói là không thể được. Nhưng nếu ta

áp dụng công nghệ chỉ thị phân tử, ta có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt

của từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt.

Phương pháp chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử (MAS) là sử dụng chỉ

thị phân tử liên kết chặt với lôcut gen đích để xác định các cá thể mang gen

trong quần thể phân ly thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình. Bằng phương

pháp này cho phép tạo được giống mới mang một hay một vài tính trạng

mong muốn một cách nhanh chóng và chính xác. Nhược điểm của phương

pháp MAS là giống mới được tạo ra không còn giữ được đặc tính quý của

giống ban đầu. Phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại

(MABC) có thể khắc phục được nhược điểm này. Với mục tiêu chuyển một

tính trạng đặc biệt vào một giống cây trồng. Chọn giống bằng chỉ thị phân tử

và lai trở lại là phát triển tiềm năng của lai trở lại trong nghiên cứu và du

nhập gen đích vào giống nhận gen. Bằng phương pháp này, chỉ cần chọn lọc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

đến thế hệ BC3 thì có thể chọn lọc được cá thể mang gen đích và có nền di

22

truyền đạt 99.6 - 100% hệ gen của cây nhận gen. Từ đó có thể thấy rằng đây

là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc chuyển lôcut gen quy định tính

trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen vào giống đồng thời rút ngắn quá

trình chọn lọc.

Phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại có ba bước

sau:

* Bước thứ nhất: Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với locus hay

gen đích để chọn lọc trực tiếp lôcut hay gen tính trạng đó từ các cá thể trong

quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1, BC3F2.

* Bước thứ hai: Sử dụng chỉ thị phân tử quanh vùng locus gen, chọn

lọc cá thể tái tổ hợp mang gen đích, giảm tối thiểu các locus gen không mong

muốn quang vùng gen đích. Bước này còn gọi là chọn lọc tái tổ hợp

(recombinant selection).

* Bước thứ ba: Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình, không liên kết với gen

đích trên 12 nhiễm sắc thể để chọn lọc cá thể có nền di truyền lớn nhất của

giống nhận gen. Bằng phương pháp này có thể giảm ít nhất là 2 nhưng có thể

3 thậm chí là 4 thế hệ lai lại so với chọn lọc lai lại truyền thống.

Những năm gần đây, IRRI đã sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ

thị phân tử và lai trở lại (MABC) và đã thành công trong việc chọn tạo giống

lúa chịu mặn bằng việc chuyển QTL Saltol có khả năng chịu mặn nằm trên

nhiễm sắc thể số 1 vào ba giống lúa trồng đại trà. Kết quả đã tạo được một số

dòng triển vọng như: IR72046-B-R-8-3-1-3, IR52713-2B-8-2B-1-2,

IR77674-3B-8-2-2-8-3-AJY5, IR45427-2B-2-2B-1-1, IR55179-3B-11-3,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

IR64197-3B-3-1, IR74099-3R-3-3, IR66946-3R-178-1-1 (FL478).

23

Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC)

chuyển gen chịu mặn vào giống lúa trồng đại trà trong sản xuất, với phương

pháp này chỉ mất ba năm trong khi phương pháp truyền thống có thể tới 10

đến 15 năm [12]. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là kỹ thuật hiệu quả, rút

ngắn thời gian và rẻ tiền so với phương pháp chọn giống truyền thống. Bởi

vì, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen của

từng cá thể trong quần thể. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử có thể sử dụng

một lượng lớn chỉ thị để kiểm tra di truyền của dòng bố mẹ. Từ đó có thể

kiểm soát được các alen đặc biệt trong các cá thể của quần thể. Kiểm tra theo

phương pháp đó kết hợp lai trở lại 2 đến 3 thế hệ là có thể thu được cá thể với

nền di truyền của dòng mẹ và mang gen chuyển. Các dòng này có thể cho tự

thụ, thu hạt để làm thí nghiệm thử nghiêm trên đồng ruộng.

1.2.5. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong nƣớc

Việt Nam có đường bờ biển 3.620 km nằm trải dài từ Bắc vào Nam, hiện

tượng xâm thực của nước biển ngày càng trở lên nghiêm trọng làm ảnh

hưởng đến năng suất cây trồng nông nghiệp đặc biệt là cây lúa, một cây trồng

chủ đạo trong nền nông nghiệp của nước ta. Gần đây, phong trào nuôi tôm

nước mặn kết hợp trồn

0,3-0,4% thậm chí có nơi cao hơn cả chục lần.

Theo báo cáo của Cục Thủy lợi - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

bằng sông Hồng lên cao và xâm nhập vào trong nội địa từ 30 - 40km làm cho

diện tích nhiễm mặn lên tới 100.000ha ở một số tỉnh: Hải Phòng, Nam Định,

Ninh Bình, Thanh Hoá.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Hơn nữa nghề trồng lúa ở vùng nhiễm mặn đang phải đối mặt với những

24

tác động của sự biến đổi khí hậu. Theo báo cáo về chỉ số rủi ro khí hậu toàn

cầu năm 2010 do tổ chức Germanwatch công bố tại Đan Mạch thì Việt Nam

là một trong 10 quốc gia bị thiệt hại nhiều nhất do biến đổi khí hậu gây ra;

các quốc gia khác đó là: Bangladesh, Myanma, Honduras, Nicaragoa, Haiti,

Ấn Độ, Cộng hòa Đôminica, Philippines và Trung Quốc. Theo kết quả

nghiên cứu và dự báo của Uỷ ban liên chính phủ về biến đổi khí hậu của Liên

hiệp quốc (IPPC) và Ngân hàng Thế giới thì trong vòng 100 năm tới, nước biển sẽ dâng 1m, nhiệt độ sẽ tăng thêm 20C. Nếu nước biển dâng cao 1m thì

vùng đồng bằng sông Cửu Long sẽ có 1,5 -2 triệu ha đất nông nghiệp bị ngập nước; còn ở vùng đồng bằng sông Hồng sẽ có 1.668 km2 đất bị ngập, trong

đó có khoảng 0,3-0,5 triệu ha đất chủ yếu là đất lúa bị ngập. Sự biến đổi khí

hậu ở nước ta cũng làm gia tăng thiên tai khiến năng suất cây trồng giảm, ước tính nếu tăng thêm 10C thì năng suất lúa giảm 10% [20].

Trước những biến đổi nghiêm trọng đó, trồng các giống lúa chống chịu

tốt với mức nhiễm mặn cao sẽ là giải pháp để khắc phục các hiện tượng trên.

Các biện pháp như xây dựng công trình thủy lợi bao đê ngăn mặn, hay bón

các loại phân hữu cơ vào đất (bón vôi, thạch cao để cải thiện cấu trúc đất, cày

sâu cải thiện tính thoát nước tốt nhằm giảm đóng váng trên mặt đất) thường

tốn kém và hiệu quả không cao.

Nhiều giống lúa chống chịu mặn như OM732, OM861,OM1314, OM

1490, OM2031, OM1314, OM576, IR42, OM344, OM924, Trắng Điệp,

Móng Chim Rơi, Móng Chim, Nếp Áo Già, Nếp Bờ Giếng, Nàng Quốc Đỏ,

Rồng Xanh, Đốc Phụng, Nhỏ Đỏ, Tám Vuốt, TD2, CM1, CM5 M6, MT6,

MT163, BM9855, BM9820, BM9830.v.v. đã được triển khai ở vùng đồng

bằng Sông Cửu Long và Sông Hồng [2], [3], [9], [8].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

-

25

: lúa Tiêu, Ba Lê, Đốc Đỏ, Nàng Thước Dài, Chân

Hương, Tam Sắc, Nàng Quốc Nhuyễn, Nàng Hương 2, Nàng Hương 3, Nàng

Co đỏ, Bảy Dảnh, Một Bụi. Giống FRG67, có nguồn gốc từ Pakistan cho

năng suất cao, chống ch [8].

Diện tích đất mặn nhiều và tập trung nhất ở nước ta là đồng bằng sông

Cửu Long, vào khoảng 0,7 triệu ha [4]. Các nhà chọn giống lúa Viện lúa

đồng bằng sông Cửu Long đã đánh giá 418 giống lúa địa phương trong điều

kiện mặn với độ dẫn điện EC: 6 – 12 dS/m đã thu được 44 mẫu giống lúa

chống chịu tốt, trong đó có các giống điển hình: Nàng co đỏ, Sóc nâu, Đốc

đỏ, Đốc phụng, Trái mây, Cà đung trắng. Đó là những mẫu giống cho gen

mục tiêu để cải tiến giống lúa chịu mặn có hiệu quả [5].

Nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ (1997) cho thấy, ở nồng độ

muối EC = 10dS/

: Nếp Áo Già, Trắng Điệp, Móng Chim, Móng Chim Rơi và Nếp

Bờ Giếng [6]. Theo Ngô Đình Thức (2006) đã 172 giống lúa mùa

địa phương và cao sản ở giai đoạn nẩy mầm với 1,5% NaCl và giai đoạn mạ

với EC = 12dS/m cho thấy có 8 giống lúa mùa địa phương chống chịu mặn

cấp 3, tương đương với giống Pokkali là Nàng Quốc Đỏ, Canh Nông Lùn,

Rồng Xanh, Đốc Phụng, Nhỏ Đỏ, Tám Vuốt, Trắng Điệp, TD2. Hai giống lúa

trung mùa chống chịu tốt với mặn tương đương với giống Pokkali là Thần

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Nông Đỏ và OM1352-5. [9]

26

Đỗ Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải

tạo một số giống lúa địa phương vùng Đồng bằng ven biển Bắc Bộ. Kết quả gây đột biến nguồn Coban (Co 60) đã tạo ra những biến dị có lợi cho chọn giống. Các

giống lúa CM1, CM5, ... là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được

những đặc tính chống chịu mặn, kháng đổ ngã, kháng bệnh và cho năng suất cao

[1].

Tuy nhiên phần lớn các giống lúa có khả năng chịu mặn tốt thì năng suất

lại thấp, tính thích nghi kém. Do đó, hướng lai tạo tập trung vào chuyển gen

chống chịu mặn ở giống lúa chịu mặn tốt và một số giống lúa mang đặc tính

ưu việt về năng suất, chất lượng đang được phát triển. Thông thường phải

mất đến 3 - 4 năm lai tạo để chuyển gen. Ngoài ra, một khó khăn thường gặp

trong lai tạo giống mới là đôi khi có mối liên kết khá chặt chẽ giữa tính trạng

chống chịu mặn với các tính trạng xấu, không mong muốn thường được lai

chuyển vào các con lai cùng lúc. Các gen điều khiển tính trạng không mong

muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai. Do đó lai tạo tính trạng

chống chịu mặn có thể kéo dài đến 10 – 15 năm để phát triển một giống lúa

mới [12]. Vì vậy, phương pháp lai tạo truyền thống thường khó, mất nhiều

thời gian và không hiệu quả.

. Năm 2000, Vương Đình Tuấn và cs đã

xác định được 3 chỉ thị RFLP đó là: R1928, R674 và G257 liên kết với các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

QTL điều khiển tính chịu mặn trên các nhiễm sắc thể số 1, 6 và 11[10]. Bùi

27

Chí Bửu và cs. ,(2000) đã xác định được chỉ thị RM223 liên kết với gen chịu

mặn với khoảng cách là 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8 [2].

Tác giả Nguyễn Thị Lang và cộng sự (2008), nghiên cứu ứng dụng

marker phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng kỹ thuật nuôi cấy túi

phấn, đã tạo ra được 72 dòng lúa bằng nuôi cấy túi phấn trong nhà lưới. Từ

kết quả thanh lọc mặn ở giai đoạn mạ thông qua các dữ liệu marker SSR với

primer RM 223 sử dụng trên 72 dòng, kết quả, các băng hình thu được có sự

phân tách giữa giống chống chịu và giống nhiễm với kích thước phân tử có

chiều dài nằm trong khoảng 140 - 160bp. Các dòng lúa tái sinh qua nuôi cấy

túi phấn: C53/Đốc Phụng - 17, C53/Đốc Phụng - 19, C53/Pokkali - 5,

C53/Pokkali - 11, C53/Pokkali - 27, C53/Pokkali - 42, C53/Pokkali - 43,

C53/Pokkali - 44, C53/D51 - 4, C53/D51 - 5 và C53/D51 - 8 là các dòng có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

khả năng chống chịu tốt với điều kiện mặn [7].

28

Chƣơng 2

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

- Giống lúa FL478: Là giống chịu mặn nhập từ Viện lúa Quốc tế IRRI.

Thông qua dự án hợp tác: “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích

nghi với điều kiện nước biển dâng cho các vùng bờ biển đồng bằng Việt

Nam” do chính phủ Đan Mạch tài trợ giai đoạn 2010-2012.

- Giống lúa TL 6 là giống lúa năng suất cao, thơm, chịu thâm canh khá,

chống chịu tốt với một số sâu bệnh hại chính như: Bệnh đạo ôn, khô vằn và

bạc lá. Phẩm chất gạo ngon, thơm, cơm mềm, nhưng không dính. Gieo cấy

được 2 vụ trong năm, được chọn tạo tại Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp

Việt Nam từ tổ hợp lai BT7 x KD18, nuôi cấy bao hạt phấn ở F1 tiếp tục

chọn lọc đến F6 chọn ra được TL 6. Giống TL 6 được Hội đồng Khoa học Bộ

Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận theo QĐ số 215 /QĐ-TT-

CLT ngày 02/10/2008.

Hình 2.1. Vị trí các chỉ thị trên NST1 và Locus gen Saltol [33] Ghi chú: Bên trái là tên các chỉ thị phân tử, bên phải là vị trí trên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

NST1; Vùng đỏ QTL/Saltol; vùng gạch chéo: tái tổ hợp.)

29

- Các chỉ thị phân tử SSR liên kết chặt với gen Saltol trên nhiễm sắc

thế số 1: RM3412b, RM493 [33], thông tin chi tiết về chỉ thị phân tử được

thể hiện qua bảng 2.1 và hình 2.1

Bảng 2.1. Thông tin về các chỉ thị phân tử trên NST1

Nhiệt

Kích

độ

thƣớc

Vị

TT Tên mồi NST

Trình tự mồi thuận/nghịch

gắn

(bp)

trí

(Mb)

mồi (0C)

110

TGATGGATCTCTGAGGTGTAAAGAGC

60

1 RM3412b

1

11,6

TGCACTAATCTTTCTGCCACAGC

55

211

GTACGTAAACGCGGAAGGTGACG

2

RM493

1

12,3

CGACGTACGAGATGCCGATCC

(Nguồn http://www.gramene.org) [45]

Các vật tư, hóa chất sinh học phân tử chuyên dụng, sử dụng trong nghiên

cứu:

o Máy PCR (hãng Eppendorf)

o Máy li tâm lạnh (Eppedorf 5810 – R và 2K15 Sigma)

o Máy điện di ngang Bio-Rad GT (Anh), máy điện di đứng Bio-Rad

o Máy soi gel (T2201, sigma), mặt nạ chắn tia UV (Sigma)

o Thiết bị Votex (Genie 2 và MS1 Minishaker)

o Nồi hấp thanh trùng (05MBI-160T-3- Nga)

o Cân điện tử Sartorious (Đức)

o Máy lắc

o Lò vi sóng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

o Micropipet, ống Eppendorf, bình tam giác các loại

30

- Các hóa chất sử dụng để chiết ADN, PCR, điện di, thanh lọc mặn...của hãng

chuyên dụng thuộc quản lí của phòng Sinh Học Phân Tử-Viện Di Truyền

Nông nghiệp: Acrylamide, Ammonium persulfate (APS), Agarose, Bis –

acylamide, Boric acid, Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB),

Chloroform Ethylenediaminetetra acetic acid (EDTA) 0,5M; pH = 8.0,

N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine (TEMED), Sodium dedoxyl sulfat

(SDS), Sodium thiosulfates, Tris base 1M; pH= 8.0, Tris HCl 1M; pH = 8.0...

2.2. Địa điểm nghiên cứu

Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, đường Phạm

Văn Đồng, Hà Nội.

Thí nghiệm đồng ruộng được thực hiện tại huyện Giao Thủy, tỉnh Nam

Định.

2.3. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu đánh giá vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu chọn tạo giống

lúa chịu mặn

- Ứng dụng chỉ thị phân tử xác định cá thể mang locus gen Saltol.

- Đánh giá và trồng thử nghiệm các dòng chịu mặn được chọn tạo bằng

phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử. Xác định các dòng chịu mặn

triển vọng phục vụ công tác phát triển giống lúa chịu mặn cho sản xuất.

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Phƣơng pháp lai hữu tính giữa giống lúa cho và nhận gen

Các giống lúa TL6, FL478 được gieo trồng trên đồng ruộng. Khi thời

kỳ cây lúa ra hoa, tiến hành chọn các cây sinh trưởng khỏe, không sâu

bệnh để tiến hành lai.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2.4.1.1. Chuẩn bị cây mẹ

31

- Chọn cây: Chọn cây sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, chuyển cây

vào chậu (đã được chuẩn bị trước), cột thẻ ghi tên giống vào cây. Chọn 2-3

bông/tổ hợp lai. Chọn bông đã trổ khỏi bẹ 50–60%. Cẩn thận tách bông

được chọn ra khỏi các bông xung quanh, cắt bỏ các bông đã trổ.

- Chọn cây lai: loại bỏ những hoa trên (chóp bông) và hoa dưới (gần

cổ bông); chỉ giữ lại các hoa có chiều cao bao phấn ở khoảng ½ - ⅓ vỏ trấu

(nhìn xuyên qua vỏ trấu). Mỗi bông giữ lại 15-20 hoa tốt, đúng thời điểm

để lai.

- Cắt vỏ trấu: cắt xiên vỏ trấu, bỏ từ ⅓ - ⅔ vỏ trấu để lộ ra những túi

phấn. Không cắt quá thấp sẽ làm tổn thương nhụy cái. Nếu cắt quá cao sẽ

khó khử đực và phấn sẽ khó rơi xuống nhụy cái.

2.4.1.2. Khử đực

- Dùng mũi nhọn kẹp các túi phấn ra ngoài. Thao tác này phải làm rất

cẩn thận để tránh thiệt hại đến nhụy cái (6 túi phấn phải được loại bỏ bao

bông lúa)

- Sau khi khử đực, bao bông lúa lại bằng bao giấy bóng mờ (trên bao

giấy bóng mờ ghi ngày khử đực, tên người khử đực), để giữ bông cho chặt

2.4.1.3. Chọn cây bố

- Chọn bông từ những cây đại diện, tốt, có nhiều hoa sẽ nở, hoa ở

chóp bông đã tung phấn. Cắt bông lúa có độ dài thích hợp, cắt bỏ lá cờ. Cột

các bông lúa cùng cây cha lại và gắn các thẻ ghi vào bó bông. Mang các

bông từ ruộng vào nơi thụ phấn.

- Đặt các bông vào chậu nước, nơi ít gió, dễ di chuyển. Sắp xếp các

bông để rút bất cứ bông nào mà không ảnh hưởng đến bông khác

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2.4.1.4. Thụ phấn

32

- Quan sát kỹ các bông, khi nào túi phấn vươn ra khỏi vỏ trấu của cây

cha phải thụ phấn ngay khi hoa nở, càng nhanh càng tốt, tận dụng thời gian

thụ phấn nhiều nhất.

- Lấy bao giấy ra khỏi bông cây mẹ (TL6), rút một bông của cây cha

(FL478) đang nở rắc lên các bông cây mẹ đã khử đực. Bao bông cây mẹ lại

sau khi thụ phấn. Xếp cạnh miệng bao, dùng kẹp giấy kẹp vào trục bông để

giữ bông cho chặt (ghi rõ cây cha được thu phấn cho cây mẹ và ngày thụ

phấn)

2.4.2. Phƣơng pháp chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC)

Những chỉ thị di truyền liên kết chặt với các gen được sử dụng để chọn

lọc các cá thể ngay ở giai đoạn sớm mà không phụ thuộc vào điều kiện môi

trường.

Trong nghiên cứu này, đã tiến hành xây dựng mô hình sàng lọc trong

các thế hệ chọn giống như sau:

Bước 1: Lai tạo tổ hợp F1

- Các dòng bố mẹ được lựa chọn là cây nhận QTL/Saltol (TL6) sẽ

được lai tạo với giống cho QTL/Saltol (FL478).

- Khi hai giống lúa cùng trỗ bông, tiến hành thực hiện phép lai hữu

tính, để tạo thế hệ F1.

Bước 2: Tạo thế hệ BC1F1,

- Các tổ hợp lai F1 được lai trở lại với giống nhận QTL/Saltol (TL6) để

tạo quần thể BC1F1

- Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình, liên kết chặt với QTL/Saltol để xác

định các cá thể mang gen trong quần thể BC1F1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Bước 3: Tạo cây BC1F2,

33

- Để tạo các cây BC1F2 , các cây BC1F1 tự thụ trong điều kiện nhà lưới.

- Sử dụng chỉ thị phân tử để xác định và chọn lọc các cá thể BC1F2

mang QTL/Saltol đồng hợp tử.

- Đánh giá khả năng chịu mặn nhân tạo và khả năng sinh trưởng phát

triển của các dòng chịu mặn được chọn tạo.

Bước 4: Chọn lọc tạo dòng thuần năng suất và chịu mặn.

- Chọn lọc và tạo thuần về các đặc điểm nông sinh học, yếu tố cấu

thành năng suất các dòng mang locus gen Saltol chịu mặn trong các thế hệ

BC1F3, BC1F4 , …

TL6

FL478

X

TL6

F1

X

BC1F1

Chọn lọc cá thể mang gen bằng chỉ thị SSR

- Đánh giá các dòng mang locus gen chịu mặn Saltol trên đồng ruộng.

BC1F2

Chọn lọc cá thể mang gen Saltol đồng hợp tử bằng chỉ thị SSR

 Tự thụ

 Tự thụ

BC1F3

Đánh giá các dòng mang gen chịu mặn Saltol trên đồng ruộng

 Tự thụ

BC1F4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp MABC

34

2.4.3. Phƣơng pháp thí nghiệm đồng ruộng

Các thí nghiệm một nhân tố được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên

(RCB), mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

- Bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng:

o Cấy 1 dảnh, mật độ 45 khóm/m2

o Cây cách cây 15cm, hàng cách hàng 18cm

o Bón phân, chăm sóc như đại trà.

- Đánh giá các chỉ tiêu theo dõi về khả năng sinh trưởng, phát triển cũng

như các chỉ tiêu cấu thành năng suất của các dòng/giống lúa trên đồng

ruộng theo phương pháp nghiên cứu của IRRI, 1980. Các chỉ tiêu theo dõi

gồm có:

o Thời gian sinh trưởng

o Chiều cao cây: đo từ mặt đất đến chóp lá cao nhất theo từng lần

lặp lại, đơn vị tính cm.

o Chiều dài lá đòng: Đo từ cổ lá đến chóp lá

o Độ thoát cổ bông

o Chiều dài bông: đo từ cổ bông đến chóp bông lúa trước thu

hoạch 3 ngày, đơn vị tính là cm.

o Số gié/bông

o Số bông/khóm

o Tỷ lệ hạt chắc (%) = Số hạt chắc/tổng số hạt x 100

o Tỷ lệ hạt lép (%) = Số hạt lép/tổng số hạt x 100

2.4.4. Phƣơng pháp thử độ mặn nhân tạo

* Thanh lọc mặn nhân tạo giai đoạn mạ bằng chậu và dung dịch

Yoshida có muối theo phương pháp đề xuất của IRRI năm 1997.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

- Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida được thể hiện ở bảng 2.2

35

Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida

Lượng cần

Nguyên tố

Hoá chất

(g/2L dd mẹ)

Macronutrient

365,6

N

Ammonium nitrate (NH4NO3)

Sodium

phosphate,

monosasic

142,4

P

monohydrate (NaH2PO4.H2O)

285,6

K

Potassium sulfate (K2SO4)

469,4

Ca

Calcium sulfate, dihydrate (CaCl2.2 H2O)

Magensium

sulfate,

7-

hydrate

1.296,0

Mg

(MgSO4.7H2O)

Micronutrient

Hoà tan làn lượt từng nhóm chất với 2L

nước cất, sau đó thêm 200 ml H2SO4 cuối

cùng lên thể tích đầy đủ.

Mangannuos chloride, 4-hydrate

6,000

Mn

(MnCl2.4H2O)

Ammonium molybdate, 4-hydrate

0,296

Mo

[(NH4)6MoO24.4H2O]

0,140

Zn

Zinc sulfate, 7-hydrate (ZnSO4.7 H2O)

3,736

B

Boric acid (H3BO3)

0,124

Cu

Cupric sulfate, 5-hydrate (CuSO4.5H2O)

30,800

Fe

Ferric chloride, 6-hydrate (FeCl3.6H2O)

Citric acid, monohydrate (C6H8O7.H2O)

47,600

C

(Yoshida và ctv, 1976)

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối, 3 lần nhắc lại với công thức

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

EC= 12 dS/m(6g/l Nacl).

36

- Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng được chọn tạo

được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, có lặp lại trong điều kiện pH = 5, với công

thức có bổ sung muối (NaCl) vào dung dịch Yoshida là 6‰. NaCl tương

đương với độ dẫn điện EC=12dS/m.

- Vật liệu nghiên cứu:

o Sử dụng giống Pokkali (giống chịu mặn có nguồn gốc từ Ấn độ,

làm đối chứng)

o Giống IR29 (giống mẫn cảm có nguồn gốc từ IRRI)

o Giống TL6

o Các dòng triển vọng

- Trước khi tiến hành thử nghiệm khả năng chịu mặn, tiến hành xử lý hạt giống bằng cách đặt trong lò đối lưu ở 500C trong 3 ngày để phá ngủ cho

giống tránh tác động ảnh hưởng của sự ngủ nghỉ đến khả năng nảy mầm của

hạt.

- Sau thời gian phá ngủ (3 ngày), tiến hành đem hạt đã khử trùng cho vào đĩa Petri với giấy thấm ẩm, đặc trong tủ thúc mầm ở nhiệt độ 300C trong 48

giờ.

- Khi hạt đã nảy mầm, tiến hành gieo hạt vào các hốc của phao cấy. Cây

mạ con sinh trưởng, rễ có thể xuyên qua lớp lưới xuống dung dịch bên dưới.

Để hạt có thể làm quen với môi trường, đồng thời tránh gây bất kỳ tổn hại

nào đến hệ thống rễ cây - cơ quan trực tiếp ảnh hưởng đến cơ chế chống chịu

mặn, chúng tôi đặt các phao cấy trong nước đã tiệt trùng (3-4 ngày), trước khi

đưa vào dung dịch dinh dưỡng đã mặn hóa.

- Sau 3 đến 4 ngày, khi mạ ổn định, thay nước tiệt trùng bằng dung

dịch Yoshida có NaCl nồng độ 6‰, định kỳ thay dung dịch 7 ngày 1 lần,

hàng ngày đo pH, luôn duy trì tại pH = 5,0. Sau 14 ngày thử mặn, bắt đầu tiến

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

hành đánh giá tính chống chịu của các dòng/giống thanh lọc qua quan sát sinh

37

trưởng dựa vào điểm đánh giá chuẩn SES (Standard Evaluation System) của

IRRI.

Bảng 2.3. Đánh giá tiêu chuẩn cải tiến (SES) qua quan sát mức hại của mặn ở giai đoạn mạ (IRRI, 1997)

Khả năng chống

Mức độ

Quan sát

chịu

Sinh trưởng bình thường, lá không có triệu

1

Chống chịu cao

chứng, rễ phát triển mạnh

Sinh trường gần như bình thường, một vài lá hơi

3

Chống chịu khá

trắng và cuộn

Sinh trưởng đã bị chậm lại, hầu hết lá bị cuộn lại,

5

Mức trung bình

chỉ một vài lá vươn ra

Hoàn toàn ngừng tăng trưởng, hầu hết lá bị khô,

7

Mẫn cảm

một số cây chết

Tất cả cây chết hoặc sắp chết (khô)

9

Mẫn cảm cao

- Để đánh giá khả năng chịu mặn được sử dụng thang điểm đánh giá

tiêu chuẩn cải tiến (bảng 2.2) để ghi triệu chứng quan sát được của ngộ độc

muối, cho điểm phân biệt kiểu gen nhiễm và kiểu gen chống chịu vừa phải.

2.4.5. Phƣơng pháp tách chiết DNA và phân tích di truyền chỉ thị

phân tử

a. Phương pháp tách CTAB

Phương pháp CTAB cải tiến trên cơ sở phương pháp của Shagai –

Maroof (năm 1984). Quy trình thực hiện gồm các bước:

- Lá của các giống lúa nghiên cứu được cắt lấy mẫu sau khi cấy 2 -3

tuần. Mẫu được lấy vào sáng sớm là lúc nồng độ muối trong lá thấp, các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

enzym hoạt động ít là điều kiện tốt để tách chiết ADN.

38

- Nghiền mẫu cùng với nitơ lỏng trong eppendorf (hoặc cối) thành

dạng bột mịn, khi nghiền luôn để mẫu trong nitơ lỏng.

- Cho mẫu vào eppendorf 2ml và cho 1ml đệm chiết (100mM Tris

HCl, pH 8): 500mM NaCl: 50mM EDTA, pH 8,0): 0,07% - Mercaptol

ethanol) rồi đảo đều, giữ trong đá và thêm 50 l SDS 10%.

- Đặt vào nồi cách thủy ủ trong 30 phút ở 650C, thỉnh thoảng đảo cho

dịch được trộn đều.

- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 20 phút.

- Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới. Thêm 1ml isopropanol alcohol rồi để vào tủ 40C cho kết tủa khoảng 30 phút (hoặc qua đêm) không để vào tủ lạnh sâu -200C vì sẽ gây hiện tượng kết tủa muối.

- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 25 phút.

- Đổ hết dịch nổi ở trên rồi giữ lại tủa ở dưới đáy eppendorf. Cho

400 l đệm TE (10mM Tris HCl pH=8,0; 0,5 mM EDTA pH=8,0) cho vào tủ 650C ủ trong 5 phút. Dùng pipet nhỏ hoặc búng nhẹ hoà tan tủa, bước này có thể giữ ở 40C qua đêm.

- Cho 3 l Rnase (10mg/ml) vào mỗi eppendorf. Ủ ở 37oC khoảng 3

tiếng.

- Thêm 400 l đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút, thỉnh

thoảng trộn, lắc đều.

- Cho và tủ hút, thêm vào 800 l chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc

trộn từ 5 – 7 phút nhằm loại bỏ protein.

- Ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 10 phút. Dung dịch bên trong

eppendorf tách thành 2 phần. Sử dụng pipet hút chuyển dịch nổi ở phía trên

sang một eppendorf mới. Nếu chưa sạch có thể chiết lại lần 2 bằng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

chloroform/isoamyl alcohol (24:1).

39

- Thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% và giữ trong tủ lạnh sâu (-200C).

- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ cồn để giữ lại tủa

trắng ở đáy ống.

- Rửa tiếp bằng 400 l cồn 70% rồi đưa vào máy ly tâm 13500

vòng/phút trong 5 phút. Dùng pipet rút bỏ cồn giữ lại tủa, cho vào máy làm

khô chân không khoảng 10 phút làm khô tủa (ADN), sau đó cho 100 l TE

(10: 1) vào mỗi eppendorf hoà tan tủa.

- Giữ ADN trong tủ lạnh sâu (- 200C) để sử dụng cho các bước nghiên cứu

tiếp theo.

b. Kỹ thuật PCR với các mồi SSR

Các chu trình của phản ứng PCR với các mồi SSR, qua các bước: o Bước biến tính: ở chu kỳ đầu tiên biến tính mẫu DNA ở nhiệt độ 940C

trong 5phút, 30 giây

o Bước gắn mồi: thực hiện ở 550C trong 30 giây o Bước tổng hợp thực hiện ở nhiệt độ 720C trong 30 giây

- Thành phần phản ứng

STT

Thành phần

Thể tích (µl)

1

5,3

H2O (nước cất 2 lần)

2

Buffer 10X

1

3

1

dNTPs (2mM)

4

0,6

MgCl2 (5mM)

5

Mồi thuận (5µM)

0,5

6

Mồi nghịch (5µM)

0,5

7

Taq Polymerase (5U/µl)

0,1

8

DNA (20ng/µl)

1

9

Tổng số

10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

40

- Thực hiện các bước trên với 35 chu kỳ, sau đó ở chu kỳ cuối cùng

chạy thêm 720C trong 7 phút sau đó bảo quản ở nhiệt độ 40C

- Sau khi chạy PCR xong, cất giữ mẫu ở nhiệt độ 40C. Trước khi đem

phân tích phải được nhỏ thuốc nhuộm Ethidium Bromide vào các mẫu, sau đó đưa vào máy PCR gây biến tính ở 940C trong 5phút sau đó để mẫu vào

luôn khay đựng đá lạnh rồi tiến hành tra mẫu DNA vào bản gel điện di.

c. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%

- Nguyên tắc : DNA tích điện âm không đổi nhờ khung phosphate vì thế

khi đặt trong điện trường, các phân tử DNA dịch chuyển từ cực âm sang cực

dương và các phân tử DNA có khối lượng và điện tích khác nhau sẽ được

phân tách.

- Mục đích : Nhằm phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau, xác

định được sự có mặt các đoạn DNA quan tâm

* Chuẩn bị bản gel

- Cân 0,8g agarose cho vào 100 ml đệm TBE ở nhiệt độ phòng, khuấy đều

trên máy khuấy từ, để yên 1 phút, cho vào lò vi sóng – mục đích làm nóng

chảy gel và không tạo bọt.

- Làm nguội gel đến 50-55oC, thêm 1µl Ethidium Bromide vào.

- Đổ gel vào khuôn gel và lắp lược

- Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ đệm

chạy vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 3-5mm

* Kỹ thuật điện di trên gel agarose

- Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ đệm

chạy vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 3-5mm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

- Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn vào các giếng tương ứng theo thứ tự mẫu

41

- Đậy nắp, cắm điện cực

- Điện di trong 30 phút với điện thế 100-120V

- Lấy bản gel ra, cho vào máy chụp UV, chụp ở bước sóng 254nm.

d. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 6% không biến tính

Chuẩn bị dung dịch 6%,acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide

(19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g trong 1 lít dung dịch)

 Chuẩn bị kính

Rửa kính bằng xà phòng sau đó rửa sạch lại bằng nước cất. để khô tự

nhiên hoặc lau bằng giấy lau,

Chọn mặt kính bám gel, lau lại bằng nước cất khử trùng 2 lần sau đó

lau lại bằng cồn 70% 2 lần.

Giữ tấm kính dài, kẹp miếng lót cao su từ một đầu của tấm kính đến

hết tấm kính, miếng lót phải bịt kín các góc. Sau đó đặt 2 thanh kẹp ở hai bên

của tấm kính dài.

Lau tấm kính ngắn 2 lần bằng nước cất khử trùng sau đó lau lại với còn

70%. Đặt tấm kính ngắn lên trên tấm kính dài sao cho không bị hở và dùng

kẹp kẹp chặt hai tấm kính với nhau.

 Chuẩn bị dung dịch gel

Dung dịch được chuẩn bị trong cốc đong với một thanh khuấy từ và

thêm các thành phần 50 l TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine)

và 250 l APS 20%, 2,5ml TBE 10X, 7,5ml 40% acrylamide, 39,44 ml H2O)

Đổ từ một góc cho đến khi gel đầy tấm kính ngắn, cài lược sao cho để

răng lược hướng vào trong.

Sau 15 phút gel đông lại có thể dùng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

 Điện di

42

Bỏ kẹp hai bên kính, lấy miếng lót cao su ra, lắp vào bể điện di sao cho

không để lại bọt khí dưới tấm kính, thêm đệm TBE 0,5x ngập mặt gel khoảng

0,5cm.

Rút lược ra và tra khoảng 7 l mẫu cho mỗi giếng (đã thêm dye) các

mẫu chạy với marker chuẩn 25bp.

Điện di từ 1,5 – 5h ở 100V tùy từng kích thước cặp mồi pcr và tùy

từng nồng độ gel.

 Nhuộm gel

Sau khi điện di xong, tháo kính, lấy gel ra cho vào một hộp kín có chứa

TBE 0,5X. Cho dung dịch nhuộm Syber Safe 5 l cho mỗi gel, ngâm trong 30

phút. Sau đó chụp ảnh bằng máy soi UV.

e. Phương pháp xử lý số liệu

- Thí nghiệm đồng ruộng được xử lý dữ liệu qua chương trình Irristat 5.0,

Excel 2010

- Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu bằng phương pháp

của IRRI và phương pháp thanh lọc mặn của Yoshida và cs (1976).

- Phân tích đánh giá đa hình DNA của các dòng giống bố mẹ của các tổ

hợp lai triển vọng theo các chỉ thị đã lựa chọn qua thông tin đã công bố và

các thông tin tự lựa chọn, thiết kế trên cơ sở bản đồ phân tử đã được công bố

về các gen quan tâm. Chọn ra các chỉ thị cho đa hình giữa các dòng giống bố

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

mẹ của tổ hợp lai.

43

Chƣơng 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả đánh giá xác định vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu

chọi tạo giống lúa chịu mặn

3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa trong

điều kiện nhân tạo

Kết quả thanh lọc mặn của các giống lúa nghiên cứu có bổ sung NaCl

6‰ vào dung dịch Yoshida được thể hiện qua bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các giống

Cấp hại sau 2 tuần xử lý NaCl 6‰

TT

Tên giống

Lặp 1 Lặp 2

Lặp 3

Trung bình

1

Pokkali đối chứng kháng

1

1

3

1.7

2

IR29 (mẫn cảm)

7

7

9

7.7

3

FL478 giống cho gen

1

3

3

1.7

4 TL6

7

7

7

7

Theo đánh giá tính chịu mặn của các giống lúa của IRRI, 1997 khi

giống lúa IR29 có biểu hiện tổn thương, tăng trưởng bị ngưng lại hoàn toàn,

hầu hết các lá bị khô, một vài chồi bị chết (điểm 7) hoặc tất cả các cây đều bị

chết khô (điểm 9) thì tiến hành quan sát, đánh giá theo tiêu chuẩn SES.

Sau 2 tuần xử lý mặn ở nồng độ NaCl 6‰ giống IR29 sinh trưởng bị

ngưng lại hoàn toàn, hầu hết các lá bị khô (điểm 7) trong khi đó giống

Pokkali vẫn sinh trưởng bình thường, chỉ xuất hiện một vài lá có vết trắng, lá

hơi cuốn lại (điểm 1-3) tương đương với giống FL478 (điểm 1-3). Trong khi

đó, giống TL6 không có khả năng chịu mặn nên sau 2 tuần, hầu hết các cây

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

trong thí nghiệm đều bị khô lá.

44

3.1.2.

Với mục đích là cải tiến tính trạng chịu mặn của giống lúa trồng phục

vụ nhu cầu giống chịu mặn cho các vùng ven biển Đồng bằng Sông Hồng,

chúng tôi sử dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị chỉ thị phân tử nhằm

chuyển gen chịu mặn saltol

.

K

3.2.

Bảng 3.2.

FL478

Chỉ tiêu Giống FL478 Giống TL6

Ch Nguồn gốc

TGST 130-137 ngày (vụ Xuân), 108 – 115 ngày (vụ Mùa)

Cao cây

Viện lúa Quốc tế IRRI 130 - 140 ngày (xuân muộn) và 105 – 110 ngày (mùa sớm) 95 – 104 cm 21-23 cm 110-115 cm 19-22 cm.

6-9 bông/khóm 5 – 8 bông/khóm

109 hạt/bông 95 – 103 hạt/bông. bông

Trung bình Năng suất

Tiềm năng năng suất cao, có thể đạt 7- 9 tấn/ha (vụ Đông Xuân), đạt 5 – 6 tấn/ha (vụ Hè thu)

Từ bảng thông tin trên cho thấy giống FL478 có thời gian sinh trưởng

tương đương TL6, do đó thuận lợi cho việc lai tạo giữa giống nhận và cho

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

gen.

45

Bên cạnh đó, từ việc đánh giá khả năng chống chịu mặn ở nồng độ

muối NaCl 6‰ giữa các giống TL6, FL478, IR29, Pokkali, đã thu được một

số kết quả như sau:

Các giống đều ngừng sinh trưởng, hầu hết lá bị khô, và một vài chồi bị

chết, đặc biệt là giống IR29, một giống chuẩn nhiễm, được nhập từ IRRI, bị

chết hoàn toàn sau 2 tuần xử lý mặn. Tuy nhiên, giống lúa TL6 trong cùng

điều kiện đánh giá cũng bị ngưng sinh trưởng, các lá bị khô, thậm chí là vài

chồi bị chết, do đó, chúng tôi nhận thấy giống TL6 không có khả năng chống

chịu mặn trong thí nghiệm.

Trong khi đó, giống FL478 có khả năng chịu mặn điểm 3 tương đương

với giống chuẩn kháng Pokali có khả năng chịu mặn tốt nhất, đây là giống

hiện đang được trồng khá phổ biến tại một số nước Nam và Đông Nam châu

Á, trong đó có Việt Nam.

Như vậy, từ việc thu thập và đánh giá các đặc điểm nông sinh học,

tiềm năng năng suất cũng như tính chống chịu mặn của các giống lúa, đã xác

định được vật liệu sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn là

giống FL478 làm nguồn cho QTL/Saltol và giống TL6 làm nguồn nhận

QTL/Saltol.

3.2. Kết quả chọn tạo dòng lúa chịu mặn từ tổ hợp lai TL6/FL478

saltol đa hình giữa

FL478 và TL6

Kế thừa từ các kết quả, vật liệu và phương pháp nghiên cứu các chỉ thị

phân tử có liên quan trong nghiên cứu và chọn tạo giống lúa chịu mặn từ dự

án “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước

biển dâng cho các vùng bờ biển đồng bằng Việt Nam” do chính phủ Đan

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Mạch tài trợ giai đoạn 2010-2012, đã xác định được có 6 chỉ thị phân tử nằm

46

trong khu vực QTL/Saltol từ AP3206 (tại vị trí 11,2Mb) đến RM10825 (tại vị

trí 13,3Mb). Các chỉ thị này được sử dụng trong việc sàng lọc các cá thể

mang gen đích trong quần thể FL478 và TL6. Vị trí của các chỉ thị phân tử đa

hình tại QTL Saltol từ 11,2 Mb đến 13,3 Mb, cụ thể: AP3206 (11,2 Mb);

RM3412b (11,6 Mb); RM10748 (11,8 Mb); RM493 (12,3 Mb); RM140(12,3

Mb) và RM10825 (13,3 Mb).

Trong khuôn khổ của luận văn này, chúng tôi sử dụng 2 chỉ thị

RM3412b và RM493 là hai chỉ thị cho đa hình với giống TL6 để sàng lọc các

cá thể mang QTL/Saltol trong quần thể lai 3.1).

3.1. Kết quả kiểm tra đa hình giữa giống TL6 (P1) và

FL478 (P2)

Đa hình giữa hai giống lúa có thể được phát hiện bằng chiều dài khác

nhau của các đoạn lặp lại được khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng

cùng một cặp mồi SSR. Việc nhận dạng đa hình ADN giữa các giống cho gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

và nhận gen với chỉ thị liên kết chặt là điều kiện tiên quyết để có thể sử dụng

47

chỉ thị phân tử nhằm phát hiện sự có mặt của gen kháng trong các cá thể con

lai.

locus gen chịu mặn trong quần thể BC1F1.

.

Trong thế hệ BC1F1, đã sử dụng 15 cá thể BC1F1 từ hạt lai F1 giữa TL6

và FL478. Khi lúa được 2 tuần tuổi, tiến hành thu nhận mẫu lá của 15 cá thể

thuộc quần thể BC1F1 để phân tích DNA, kiểm tra sự có mặt của QTL/Saltol,

mỗi cá thể được đeo thẻ theo số thứ tự các dòng và thứ tự cây thu mẫu. Hai

chỉ thị phân tử RM493 và RM3412b được sử dụng để xác định các cá thể

mang gen QTL/Saltol trong quần thể BC1F1.

Kết quả xác định được cá thể BC1F1mang QTL/Saltol bằng chỉ thị

phân tử RM493 được thể hiện trên kết quả băng điện di ở hình 3.2.

Qua phân tích trên hình 3.2, đã chọn ra được các cá thể được đánh số

lần lượt là 1, 2, 4, 7, 9, 11, 13, 14, 15 là các cá thể mang QTL/Saltol

(ký hiệu là H) có 2 TL6 và FL478.

Hình 3.2.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

BC1F1;; - BC1F1

48

1F1, chúng tôi cũng thu nhận được băng điện di. Trong 15 cá thể

Tương tự, khi chạy điện di với chỉ thị RM493 trên 15 cá thế trong q

nghiên cứu, đã chọn ra được các cá thể mang số 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11, 12, 14 là

các cá thể mang QTL/Saltol nhờ vào sự hiển thị băng DNA giống với dòng

bố mang gen Saltol và dòng mẹ TL6 (Hình 3.3).

Hình 3.3.

BC1F1

-

BC1F1 Kết hợp hai chỉ thị RM493 và RM3412b đã sàng lọc được 6 cá thể

1F2.

mang QTL/Saltol

3.2.3. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen

chịu mặn trong quần thể BC1F2

Từ 6 cá thể thu nhận được ở quần thể BC1F1, tiến hành tự thụ để tạo

quần thể BC1F2. Các cá thể được gieo trồng và thu nhận mẫu lá để kiểm tra

trên gel polyacrylamide nhằm xác định các cá thể mang gen đồng hợp tử nhờ

vào việc sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Saltol là RM493. Kết

quả sau khi chạy điện di trên gel polyacrylamide được thể hiện trên hình 3.4.

Qua kết quả chạy điện di với 20 cá thể của quần thể BC1F2, chúng tôi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

đã xác đị 2,

49

Saltol (hình 3.4

BC1F3, BC1F4

.

Hình 3.4.

BC1F2

P1: TL6, P2: FL478, A: TL6, H: dị hợp tử, B: FL478, từ 1-20: các cá thể

BC1F2

3.3. Đánh giá vật liệu sử dụng trong nghiên cứu và chọn tạo giống

lúa chịu mặn.

3.3.1. Đánh giá tính chịu mặn của các dòng lúa chọn tạo trong điều

kiện nhân tạo.

Kết quả thanh lọc mặn của các dòng lúa nghiên cứu có bổ sung NaCl

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

6‰ vào dung dịch Yoshida được thể hiện qua bảng 3.3.

50

Bảng 3.3. Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các dòng

Cấp hại sau 2 tuần xử lý NaCl 6‰

TT

Tên dòng/giống

Lặp 1

Lặp 2

Lặp 3 Trung bình

1

3

1 Dòng số 01

3.0

5

3

3

2 Dòng số 02

3.7

5

3

3

3 Dòng số 03

3.0

3

1

3

4 Dòng số 04

3.0

5

3

3

5 Dòng số 05

3.0

3

3

3

6 Dòng số 11

3.7

5

1

3

7 Dòng số 12

2.3

3

3

3

8 Dòng số 13

3.0

3

3

3

9 Dòng số 14

3.7

5

3

3

10 Dòng số 15

3.0

3

1

1

23 Pokkali (chuẩn kháng)

1.7

3

7

7

24

IR29 (mẫn cảm)

7.7

9

1

3

25 FL478

1.7

1

5

7

26 TL6

6.3

7

Sau 2 tuần xử lý mặn ở nồng độ NaCl 6‰ giống IR29 sinh trưởng bị

ngưng lại hoàn toàn, hầu hết các lá bị khô (điểm 7) trong khi đó giống

Pokkali vẫn sinh trưởng bình thường, chỉ xuất hiện một vài lá có vết trắng, lá

hơi cuốn lại (điểm 1-3) tương đương với giống FL478 ( -

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

12.

51

3.3.2. Đánh giá các đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng

suất và khả năng chịu mặn của các dòng đƣợc tạo ra mang QTL/Saltol

trong vụ mùa 2013.

3.3.2.1. Đánh giá các hình thái của một số dòng chịu mặn tại Giao

Thủy, Nam Định trong vụ mùa 2013.

Bảng 3.4. Một số đặc điểm nông học và hình thái của các dòng lúa 2013 tại Giao Thủy, Nam Định. tham gia thí nghiệm

TT Tên TGST Chiều Chiều dài Độ thoát Số

dòng/giống (ngày) cao cây lá đòng cổ bông gié/bông

(cm) (cm) (cm)

1 Dòng 1 105 100,5 24,5 2,9 10,6

2 Dòng 4 105 100 25,6 3,2 10,6

3 Dòng 12 105 100,6 23,7 2,7 10,6

4 TL6 105 98,6 23,6 2,4 10,0

CV 2,3 1,25 2,7 0,8

LSD(5%) 3,4 3,2 2,7 1,6

Các hình thái của một số dòng chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định

trong vụ mùa 2013 được thể hiện ở bảng 3.4

Từ bảng 3.4 cho thấy:

TGST của các dòng trong thí nghiệm giống nhau và giống với giống

đối chứng là 105 ngày, với thời gian sinh trưởng 105 ngày là phù hợp với cơ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

cấu mùa vụ ở đồng bằng sông hồng.

52

Chiều cao cây của các dòng trong thí nghiệm lệch nhau 0,6cm có thể

coi như bằng nhau và cao hơn so với giống TL6 đối chứng là 0,2cm trong sai

số cho phép. Như vậy, trong thí nghiệm vụ mùa các dòng và giống đối chứng

có chiều cao bằng nhau. Trong điều kiện nhiễm mặn chỉ xảy ra ở các đồng

bằng ven biển, trong vụ mùa thì thường gặp bão và gió mạnh thì với chiều

cao thấp 100cm là phù hợp cho canh tác tại những khu vực này, cấy sẽ giảm

đổ gãy khi cây vào quả.

Lá đòng là yếu tố quan trọng quyết định đến sự tích lũy tinh bột của

hạt, ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất. Nhất là đối với vụ mùa, trong điều

kiện thời tiết vào mùa mưa ở đồng bằng sông hồng, lá đòng không có sự ổn

định nên ảnh hưởng trực tiếp đến trọng lượng khô của hạt. Qua thí nghiệm

cho thấy chiều dài lá đòng của giống TL6 là 23,6cm; dòng 1 là 24,5 ; dòng 4

là 25,6 và dòng 12 là 23,7. Là phù hợp với các giống được gieo trồng hiện

nay.

Độ thoát cổ bông là yếu tố gián tiếp quyết định đến năng suất của cây

lúa, nếu độ thoát cổ bông quá dài trong điều kiện thời tiết ven biển gió nhiều

sẽ làm có cây bị gãy cổ bông. Trong thí nghiệm các dòng tham gia có độ dài

cổ bông ngắn dao động trong khoảng 2,7cm (dòng 12) đến 3,2 cm (dòng 1)

và giống đối chứng là 2,4cm.

Số gié trên bông là một trong những yếu tố quyết định số hạt trên

bông, trong thí nghiệm số gié trên bông trung bình là 10 gié trên bông.

3.3.2.2. Đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng

chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ mùa 2013

Các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng chịu mặn tại Giao

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Thủy, Nam Định trong vụ mùa 2013 được thể hiện ở bảng 3.5.

53

Bảng 3.5. Năng suất và các yếu tố cấu tăng năng s

2013

P1000 Tên Số Hạt Hạt NSLT NSTT hạt TT Dòng Bông/khóm chắc/bông lép/bông Tạ/ha Tạ/ha (gram)

7,15 126,35 24,67 20,75 84,35 57,4 1

7,65 122,45 19,67 20,34 85,74 57,5 2

7,61 119,23 16,33 21,08 86,07 56,6 3 Dòng 1 Dòng 4 Dòng 12

TL6 6,76 120,58 17,33 20,10 73,72 53,4 4

CV LSD(5%) 4,47 5,34 4,52 12,91 4,32 6,75 5,61 8,36

Chú thích: NSTL – Năng suất lý thuyết; NSTT – Năng suất thực tế

Số bông trên khóm là yếu tố quyết định trực tiếp đến năng suất của cây

lúa, trong thí nghiệm ta thấy số bông trên khóm dao động từ 7,15 (dòng 1)

đến 7,65 (dòng 4) và nhiều hơn so với giống đối chứng là 6,67. Điều này cho

thấy trong cùng 1 ruộng thí nghiệm bị nhiễm mặn các dòng TL6 mang QTL

chịu mặn sinh trưởng tốt hơn so với giống TL6 không mang QTL chịu mặn.

Số hạt chắc trên bông là yếu tố cuối cùng quyết định đến năng suất của

cây lúa, hạt vào chắc tốt và tỷ lệ mẩy cao sẽ nâng cao khối lượng khô của hạt

giúp tăng năng suất. Qua bảng theo dõi các chỉ tiêu cấu thành năng suất

chúng ta có thể nhận thấy rằng các dòng tham gia thí nghiệm có số hạt chắc

là 126,35 (dòng 1); 122,45 (dòng 4) và 119,23 (dòng 12), giống TL6 là

120,58.

Số hạt lép trên bông, của cá dòng giống đối chứng TL6 là cao hơn so

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

với những vụ khác, điều này có thể lý giải rằng, vụ mùa năm 2013 tại Giao

54

Thủy - Nam Định có sự biến đổi khí hậu mưa nhiều và kéo dài suốt tháng 8

đến hết tháng 9 đúng vào thời kỳ lúa trỗ nên ảnh hưởng đến tỷ lệ giao phấn

nên làm cho cây có tỷ lệ lép cao.

Trọng lượng nghìn hạt cũng có sự thay đổi, tất cả các dòng đều có

trọng lượng nghìn hạt cao hơn TL6 20,1 (gram/1000 hạt), dòng 1 20,75

(gram/1000 hạt); dòng 4 20,34 (gram/1000 hạt) và dòng 12 21,08 (gram/1000

hạt). Nguyên nhân của sự khác nhau là do trong quá trình lai tạo khi chuyển

gen.

NSLT là yếu được tính dựa trên thu thập các chỉ tiêu cấu thành năng

suất. NSLT của TL6 là 73,72 (tạ/ha) thấp hơn so với các dòng mang gen

dòng là 1 84, 35 (tạ/ha); dòng 4 là 85,74 (tạ/ha) và dòng 12 là 86,07 (tạ/ha).

NSTT là năng suất thực chất thu được trên ruộng thí nghiệm, tất cả các

biện pháp kỹ thuật tác động vào cây lúa cũng chỉ với mục đích cuối cùng là

nâng cao NSTT. Trong thí nghiệm này NSTT của TL6 thấp hơn hẳn so với

các dòng tham gia thí nghiệm, điều này là do TL6 không thể sinh trưởng và

phát triển tốt trong môi trường bị nhiễm mặn. Trong khi đó, các dòng khác có

NSTT là dòng 1 là 57,4 (tạ/ha); dòng 4 là 57,5 (tạ/ha) và dòng 12 là 56,6

(tạ/ha) cao hơn so với TL6.

Tóm lại, trong vụ mùa 2013 tuy gặp khó khăn về thời tiết do biến đổi

của khí hậu, mưa nhiều vào giai đoạn lúa trỗ nhưng kết quả của thí nghiệm

cũng phản ánh chân thực về hiệu quả của phương pháp chuyển QTL chịu

mặn vào giống lúa TL6. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhiễm

mặn tự nhiên các chỉ tiêu đo nông học và năng suất thu được đã chỉ ra rằng

các giống có mang QTL chịu mặn có thể sinh trưởng và phát triển tốt trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

điều kiện đất canh tác bị nhiễm mặn. Tuy nhiên đây chỉ là kết quả đánh giá

55

trong vụ mùa, cần có thêm thí nghiệm trong vụ xuân để có các đánh giá

khách quan trong canh tác với cơ cấu một năm 2 vụ ở miền bắc.

3.3.3. Đánh giá các đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng

suất và khả năng chịu mặn của các dòng đƣợc tạo ra mang QTL/Saltol

trong vụ xuân 2014

3.3.3.1. Đánh giá các hình thái của một số dòng chịu mặn tại Giao

Thủy, Nam Định trong vụ xuân 2014

Quá trình sinh trưởng, phát triển của cây lúa phụ thuộc vào đặc tính di

truyền của giống và điều kiện ngoại cảnh đặc biệt là điều kiện khí hậu của

từng vùng, từng mùa vụ cụ thể, Theo dõi các đặc tính nông học của một

giống có thể phản ánh mức độ chịu thâm canh cũng như phạm vi sản xuất của

từng dòng/giống góp phần khai thác tiềm năng năng suất của giống,

Trong vụ xuân 2014, thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tự nhiên

tại Giao Thủy, Nam Định với các dòng chịu mặn được tuyển chọn từ thế hệ

BC1F2, Kết quả đánh giá đặc điểm nông học của các dòng được thể qua bảng

3.6.

Bảng 3.6. Một số đặc điểm nông học và hình thái của các dòng lúa 2014 tại Giao Thủy, Nam Định tham gia thí nghiệ

Tên dòng/giống TGST (ngày) TT Số gié/bông

1 Dòng 1 135 Chiều cao cây (cm) 96,5 Chiều dài lá đòng (cm) 25,3 Độ thoát cổ bông (cm) 2,6 11,3

2 Dòng 4 135 95,6 24,6 1,6 11,6

3 Dòng 12 130 93,7 25,2 3,1 10,7

4 TL6 130 90,3 24,6 1,3 11,3

CV 4,02 1,72 0,63 1,3

Chú thích: TGST – Thời gian sinh trưởng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

LSD(5%) 3,24 2,56 2,11 3,45

56

Từ bảng 3.6. cho thấy:

TGST của lúa được tính từ lúc hạt thóc nảy mầm cho đến khi chín,

TGST dài hay ngắn phụ thuộc vào giống lúa, mùa vụ gieo trồng và kỹ thuật.

Qua bảng 3.6, TGST của các dòng là hơn kém nhau 5 ngày, dòng 12 có thời

gian sinh trưởng 130 ngày bằng với thời gian sinh trưởng của TL6, 2 dòng só

1 và số 4 có thời gian sinh trưởng là 135 ngày nhiều hơn giống TL6 đối

chứng là 5 ngày, Tuy nhiên, với thời gian sinh trưởng hơn kém nhau 5 ngày

không khác nhau nhiều trong sản xuất.

Về chỉ tiêu đánh giá chiều cao cây, kết quả nghiên cứu cho thấy không

có sự biến động đáng kể nào về sự tăng trưởng chiều cao cây giữa các dòng,

Hầu hết các dòng đều có chiều cao lớn hơn so với đối chứng là giống TL6

(90,3cm), Tuy nhiên, chiêu cao của các dòng cao hơn TL6 chi không đáng kể

chỉ từ 3cm – 6cm và có thể coi như chiều cao của cá dòng như nhau, cụ thể

dòng 1 là 96,5cm; dòng 4 là 95,6cm; dòng 12 là 93,7cm.

Về chỉ tiêu đánh giá lá đòng, kết quả nghiên cứu cho thấy có sự sai khác

không nhiều giữa các dòng tham gia thí nghiệm và giống đối chứng với nhau,

Trong đó, chiều dài lá đòng của TL6 là 24,6cm ; dòng 1 là 25,3cm; dòng là

24,3cm; dòng 12 là 25,2cm.

Về chỉ tiêu chiều dài cổ bông, theo kết quả đánh giá, không có sự sai

khác giữa các dòng với giống đối chứng, giao động từ 1,6 cm (dòng 4 ) đến

3,1 cm (dòng 12 ) trong khi TL6 đối chứng là 1,3cm.

Từ số liệu đo đếm được, số gié/bông của các dòng đều ít hơn giống đối

chứng, Tuy nhiên, sự chênh lệch này không nhiều, Từ 10,7 (dòng 12) đến

11,6 (dòng 4) và giống đối chứng là 11,3cm.

Bước đầu đánh giá các tính trạng kiểu hình có thể nhận thấy không có sự

khác nhau nhiều về kiều hình giữa các giống mang QTL chịu mặn được

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

chuyển bằng phương pháp MAS và giống đối chứng nhận QTL.

57

3.3.3.2. Đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng

chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ xuân 2014

Song song với việc đánh giá các đặc điểm nông sinh học về sinh trưởng

và hình thái, tiến hành đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng

chịu mặn trong thí nghiệm, Các chỉ tiêu theo dõi gồm: tổng số hạt/bông, số

hạt chắc/bông, số hạt lép/bông, Đây chính là các chỉ tiêu đóng vai trò quan

trọng trong việc quyết định năng suất của lúa, Kết quả được thể hiện trong

bảng 3.7

Bảng 3.7. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất các dòng tham gia thí nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định 2014

P1000

Tên

Số

Hạt

Hạt

NSLT

NSTT

hạt

TT

Dòng

Bông/khóm

chắc/bông

lép/bông

(Tạ/ha)

(Tạ/ha)

(gram)

7.67 128.24 9,45 21.8 96,49 61 1

6.67 131.63 8.31 21.72 85,81 61 2

6.67 123.8 10,65 21.93 81,49 59,4 3 Dòng 1 Dòng 4 Dòng 12

6.67 124.19 4,68 21.14 78,8 58,8 TL6 4

4,47 5,34 4,52 12,91 4,32 6,75 5,54 7,61 CV LSD(5%)

Từ bảng 3.7. cho thấy:

Số bông/khóm là một trong 4 yếu tố quyết định cấu thành năng suất,

Số bông/khóm tùy thuộc vào mật độ cấy, điều kiện đất đai, thời tiết, lượng

phân bón, chế độ nước… Do đó, yếu tố này có ảnh hưởng thuận tới năng

suất, Từ số liệu trong bảng trên cho thấy, số bông/khóm của các dòng/giống

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

tương đương nhau là 6,67 bông/khóm và giống đối chứng, trừ dòng 1 là 7,67.

58

Số lượng hạt/bông là yếu tố quan trọng cuối cùng quyết định đến kết

quả của thí nghiệm và tất cả các biện pháp kỹ thuật đều nhằm mục đích nâng

cao số hạt trên bông để nâng cao năng suất, Số hạt trên bông của các dòng

dao động trong khoảng từ 123,8 hạt (dòng 12) đến 131,63 hạt (dòng 4), trong

khi giống đối chứng TL6 là 124,19 hạt chắc trong khi số hạt lép là 4,68

hạt/bông, các dòng tham gia thí nghiệm là dòng 1 là 9,45 hạt/bông ; dòng 4 là

8,31 hạt/bông và dòng 12 là 10,65 hạt/bông. Khác hẳn với vụ mùa 2013 thời

tiết vụ xuân 2014 tỷ lệ hạt vào chắc cao hơn và mẩy hạt hơn là do thời tiết vụ

xuân thường ổn định hơn.

Trọng lượng nghìn hạt cũng cao hơn vụ mùa 2013, do có sự ổn định về

thời tiết, dòng 1 là 21,8 (gram/1000hạt); dòng 4 là 21,72 (gram/1000hạt) và

dòng 12 là 21,93 (gram/1000hạt) còn giống đối chứng TL6 là 21,14

(gram/1000hạt).

NSLT của các dòng lần lượt là: dòng 1 là 96,44 (tạ/ha); dòng 4 là

85,81 (tạ/ha); dòng 12 là 81,49 (tạ/ha) còn giống TL6 đối chứng là 78,8

(tạ/ha); rõ ràng các dòng TL6 có QTL chịu mặn vẫn thích nghi tốt hơn với

các vùng đồng bằng ven biển.

NSTT của các dòng thu được trong thí nghiệm vụ mùa là: dòng 1 và

dòng 4 là 6,1 (tạ/ha); dòng 12 là 59,4 (tạ/ha) còn giống TL6 đối chứng là 58,8

(tạ/ha). Như vậy, ngay cả với NSTT cũng thể hiện sự thích nghi tốt hơn của

các giống TL6 có QTL chịu mặn.

Qua đánh giá thêm 1 lần nữa ở vụ xuân 2014 chúng ta cũng có thể

nhận thấy rằng các dòng mang gen ưu thế hơn giống gốc TL6, trong điều

kiện đất nhiễm mặn và cũng cho thấy rằng các dòng trong thí nghiệm đã

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

thành công trong việc dùng phương pháp MAS để chuyển QTL chịu mặn.

59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

1.1 Đã đánh giá được vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa

chịu mặn, cụ thể:

- Giống FL 478 có khả năng chịu mặn ở điểm 3 sau 2 tuần xử lý mặn ở nồng

độ muối NaCL6‰, tương đương với giống chuẩn kháng Pokali có khả năng

chịu mặn tốt nhất.

- Giống TL 6 không có khả năng chống chịu mặn, nhưng lại có chất lượng và

tiềm năng cho năng suất cao.

1.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử đã xác định được 4 cá thể (ký hiệu số 2,14, 17,

18) ở thế hệ BC1F2 là các cá thể đồng hợp tử tại vị trí locus gen Saltol,

- có

nồng độ NaCl 6‰.

1.3.

(D1, D4, D12)

6.

2. Kiến nghị

2.1. Tiếp tục trồng thử nghiệm và đánh giá khả năng thích ứng của các dòng

D1, D4 và D12 được chọn tạo với nhiều mùa vụ ở các vùng sinh thái khác

nhau để đánh giá khả năng thích nghi ứng phó với điều kiện BĐKH ở các

tỉnh ven biển Đồng bằng Sông Hồng.

2.2. Nghiên cứu một cách có hệ thống về các đặc điểm sinh lý, sinh hóa cũng

như đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng/giống được tạo ra nhằm phát

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

triển mở rộng trong sản xuất.

60

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Đỗ Hữu Ất (2005), “Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tạo giống lúa chịu

mặn cho vùng đồng bằng ven biển Bắc bộ”, TT Khoa học và Công nghệ

Hạt nhân, 4/2005, 28-30.

2. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu

đối với thiệt hại do môi trường của cây lúa, Nxb Nông nghiệp, TP. Hồ

Chí Minh.

3. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Duy Bảy, Phùng Bá Tạo, Đỗ Xuân Trường và

Nguyễn Thị Lang (2000), “chọn tạo giống lúa cho vùng bị nhiễm mặn ở

đồng bằng sông Cửu Long”, Omon Rice 8: 16-26.

4. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2004), Di truyền phân tử, Nxb Nông

Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh.

5. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1995), Ứng dụng công nghệ sinh học

trong cải tiến giống lúa, Nxb Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh.

6. Nguyễn Thị Lang (2002), Những phương pháp cơ bản trong công nghệ

sinh học. Nxb Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh.

7. Nguyễn Thị Lang, Phạm Thị Xim, Bùi Chí Bửu (2008), “Nghiên cứu ứng

dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng kỹ thuật nuôi

cấy túi phấn”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, (8/2008),

13-17, ISSN, 0866-7020.

8. Đỗ Khắc Thịnh, Nguyễn Ngọc Quỳnh, Dương Ký, Nguyễn Văn Huấn

(1997), “Kết quả tuyển chọn giống lúa mùa FRG67 cho vùng đất phèn,

nhiễm mặn, ảnh hưởng thuỷ triều ven thành phố Hồ Chí Minh”, Tạp chí

Nông nghiệp và Công Nghiệp Thực Phẩm, (11/1997), tr 475-476.

61

9. Ngô Đình Thức (2006), Nghiên cứu phát triển giống lúa chống chịu mặn

cho vùng đồng bằng sông Cửu Long, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, trường

Đại học Nông lâm TP.HCM.

10. Vương Đình Tuấn, Fukutu Y., Yano M. và Ban T. (2000), “Lập bản đồ

xác định vị trí của gen di truyền số lượng ảnh hưởng đến tính chống chịu

mặn của cây lúa (Oryza satica)”, Omon Rice, 8: tr27-35.

Tiếng Anh

11. Bonilla P., Dvorak J., Mackill D.J., Deal K. and Gregorio G. (2002),

“RFLP and SSLP mapping of salinity tolerance genes in chromosome 1 of

rice (Oryza sativa L.)” using recombinant inbred lines. Philipp. Agric. Sci,

85:68–76.

12. Collard B.C.Y., Mackill D.J. (2008), “Marker - aide selection: an

approach for precision plant breeding in the twenty first century”, Philos.

Trans. R. Soc. Lonf. B. Biol. Sci, 363: 557 - 572.

13. F.A.O., AGL (2000), “Extent and causes of salt-affected soils in

participating countries. Global network on intergrated soil management

for sustainable use of salt-affected soils. Land and plant nutrition

management service” .

14. FAO (Food and Agriculture Organization), (2010), “Report of salt

affected agriculture”. Link access: (http://www.fao.org/ag/agl/agll/spush/,

latest verified 8 October 2011).

15. Flowers T.J., Koyama M.L., Flowers S.A., Sudhakar C., Singh K.P., Yeo

A.R. (2000), “QTL: their place in engineering tolerance of rice to

salinity”, J Exp Bot, 51:99–106.

16. Flowers T. J. (1987), “Salinity resistance in rice”, University of Sussex,

pp. 9-11.

62

17. Flowers, T. J. and Yeo A.R. (1988), “Salinity and rice: A physiological

approach to breeding for resistance”, School of biological sciences,

University of Sussex, Brighton, U.K, pp.993-959.

18. Gregorio G.B, Senadhira D., Mendoza R.D., Manigbas N.L.,Rosxas J.P.,

Guerta C.Q. (2002), “Progress in breeding for salinity tolerance and

associated abiotic stresses in rice”, Field crio Research. Elsevier.

19. Gregorio G.B., Senadhira D. (1993), “Genetic analysis of salinity

tolerance in rice (Oryza sativa L.)”, Theor. App.l Genet. 86, pp.333-338.

20. IPCC (2007) The 4th assessement report of the Intergovernmental Panel

on Climate Change. http://en.wikipedia.org/wiki.

21. Ismail A.M, Heuter S., Thomson M.J and Wissuwa M. (2007),

“Geneticand Genomic approaches to develop rice germplasm for problem

soils”, Plant Molecular Biology, 4: 547-570.

22. Ismail A.M., Thomson M.J., Singh R.K., Gregorio G.B., Mackill D.J.

(2009), “Designing rice varieties adapted to coastal areas of South and

Southeast Asia”, J Indian Soc. Coastal Agric Res, 26: 335-362.

23. Kawasaki S., Borchert C., Deyholos M.,Wang H., Brazille S., Kawai K.,

Galbraith D., Bohnert H.J. (2001), “Gene expression profiles during the

initial phase of salt stress in rice”, The Plant Cell, 13:889-905.

24. Koyama M.L., Levesley A., Koebner R.M., Flowers T.J., Yeo A.R.

(2001), “Quantitative trait loci for component physiological traits

determining salt tolerance in rice” , Plant Physiol 125:406–422.

25. Lee K.S. (1995), “Variability and genetics of salt tolerance in japonica

rice”, University of Philippine, Los Banos, Philippine, pp.108-110.

63

26. Lin H.X., Zhu M.Z., Yano M., Gao J.P., Liang Z.W., Su W.A., Hu X.H.,

Ren Z.H., Chao D.Y. (2004), “QTLs for Na+ and K+ uptake of the shoots

and roots controlling rice salt tolerance”, Theor Appl Genet ,108:253–260.

27. Lorieux M., Petror M., Huang N., Guiderdoni E., Ghesquier A. (1996),

“Aroma in rice: genetic analysis of a quantitative trait”. Theor Appl Genet

93:1145–1151.

28. Mishra B., Akbar M., Seshu D.V. (1990), “Genetic studies on salinity

tolerance in rice towards better productitivity in salt effected soils”,

Proceedings of the Rice Research Seminar, Jul. 12-12, IRRI, Los Ba

Laguna, pp: 25-25.

29. Mishra B., Akbar M., Seshu D.V and Senadhira D. (1996), “Geneticss of

salinity tolerance and ionic uptake in rice”, IRRN 21:38-39.

30. Munns R. (2002), “Comparative physiology of salt and water stress”,

Plant Cell and Envriron, 25: 239-250

31. Nandi S., Subudhi P.K., Senadhira D., Maigbas N.L., Sen-Mandi S.,

Huang N. (1997), “Mapping QTLs for submergence tolerance in rice by

AFLP analysis and selective genotyping”, Mol Gen Genet, 255:1–8.

32. Narayanan K.K., Krishnaraj S., Sree Rangaswamy S.R.,(1990), “Genetic

analysis for salt tolerance in rice, Paper presented during the Second

International Rice Genetic Symposium”, May 14-18, 1990. IRRI, Manila,

Philippine.

33. Niones J.M. (2004), Fine mapping of the salinity tolerance gene on

chromosome 1 of rice (Orysa sativa) using near-isogenic lines, MSc

thesis, University of the Philippines Los Banos.

64

34. Prasad K.V.S.K., Sharmila P., Kumar P.A., Saradhi P.P. (2000b),

“Transformation of Brassica juncea (L.) Czern with bacterial codA gene

enhances its tolerance to salt stress”, Mol Breed, 6:489–499.

35. Prasad S.R., Bagali P.G., Hittalmani S., Shashidhar H.E. (2000a),

“Molecular mapping of quantitative trait loci associated with seedling

tolerance to salt (Oryza sativa L.)”. Curr Sci, 78:162–164.

36. Ren Z.H., Gao J.P., Li L.G., Cai X.L., Huang W., Chao D.Y., Zhu M.Z.,

Wang Z.Y., Luan S., Lin H.X. (2005), “A rice quantitative trait locus for

salt tolerance encodes a sodium transporter”, Nat Genet, 37:1141–1146.

37. Takehisa H., Shimodate T., Fukuta Y., Ueda T., Yano M., Yamayad T.,

Kameya T., Sato T. (2004), “Identification of quantitative trait loci for

plant growth of rice in paddy field flooded with salt water”, Field Crops

Res, 89:85–95.

38. Teng S. (1994), Gene tagging for salt tolerance in rice (Oryza sativa L.),

The University of Philippine, Los Banos, Laguna, Philippine, 118p.

39. Thomson MJ., Ocampo M., Egdane J., Rahman M.A., Saiise AG.,

Adorada DL., Raiz E.T. 2010. “Characterizing the Saltol quantitative trait

locus for salinity tolerance in rice”. Rice, 3:148-160.

40. Tsunematsu H., Yoshimura A., Horushima Y., Nagamura Y., Kurata N.,

Yano M., Sasaki T., Iwata N. (1996), “RFLP framework map using

recombinant inbred lines in rice”, Breed Sci, 46:279–284.

41. Wang G.L., Mackill D.J., Bonman J.M., McCouch S.R., Champoux M.C.,

Nelson R.J. (1994), “RFLP mapping of genes conferring complete and

partial resistance to blast in a durably resistant rice cultivar”, Genetics

136:1421–1434.

65

42. Xiao J., Li J., Yuan L., Tanksley S.D. (1996), “Identification of QTLs

affecting traits of agronomic importance in a recombinant inbred

population derived from a subspecific rice cross”, Theor Appl Genet,

92:230–244.

43. Yadav R., Courtois B., Huang N., McLaren G. (1997), “Mapping genes

controlling root morphology and root distribution in a doubledhaploid

population of rice”, Theor Appl Genet , 94:619–632.

44. Zhang Wen-Long, Y.W.-P., Chen Zhi-Wei, Wang Ming-Chun, Yang Liu-

Qi, and Cai Yi-Lin (2010), “Molecular Marker-Assisted Selection for o2

Introgression Lines with o16 Gene in Corn”, Acta Agronomica Sinica ,

36:1302–1309.

Internet

45. http://www.gramene.org

46. http://www.monre.gov.vn

47. http://www.khoahoc.com.vn/doisong/moi-truong/tham-hoa/18435_Bien-

doi-khi-hau-22-trieu-nguoi-Viet-Nam-se-bi-mat-nha-cua.aspx/ngày

29/11/2007