intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái Nhàu (Morinda citrifolia l.) lên sự sinh trưởng của tế bào 3D nuôi cấy

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:16

Thêm vào BST
Báo xấu
2
lượt xem 1
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái Nhàu lên sự sinh trưởng của tế bào 3D nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy nguyên bào sợi (NBS) tăng sinh tốt sau 15 ngày nuôi cấy lên vật liệu 3D có bổ sung 120 μg/ml cao chiết trái Nhàu (M. citrifolia L.).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái Nhàu (Morinda citrifolia l.) lên sự sinh trưởng của tế bào 3D nuôi cấy

  1. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 23, Số 2 (2023) ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA CAO CHIẾT TRÁI NHÀU (Morinda citrifolia L.) LÊN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO 3D NUÔI CẤY Nguyễn Thị Tâm*, Đặng Thị Kiều Dưỡng, Nguyễn Bình Linh Chi Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế *Email: nguyentam181000@gmail.com Ngày nhận bài: 24/4/2023; ngày hoàn thành phản biện: 26/4/2023; ngày duyệt đăng: 4/12/2023 TÓM TẮT Cao chiết methanol trái Nhàu (Morinda citrifolia L.) ức chế đáng kể việc sản xuất NO mà không ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào. Cao chiết trái Nhàu (M. citrifolia L.) đã được chứng minh là có tác dụng làm giảm yếu tố hoại tử khối u- alpha của các cytokine tiền viêm. Những kết quả này đã chứng tỏ tác dụng chống viêm của cao chiết trái Nhàu có liên quan đến việc giảm biểu hiện của các chất trung gian gây viêm và hỗ trợ tăng trưởng nuôi cấy tế bào 3D. Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái Nhàu lên sự sinh trưởng của tế bào 3D nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy nguyên bào sợi (NBS) tăng sinh tốt sau 15 ngày nuôi cấy lên vật liệu 3D có bổ sung 120 μg/ml cao chiết trái Nhàu (M. citrifolia L.). Từ khóa: Morinda citrifolia L., tế bào 3D, trái Nhàu. 1. MỞ ĐẦU Không giống như nuôi tế bào đơn lớp 2D, nuôi tế bào 3D là mô hình ngày càng được sử dụng rộng rãi nhờ những tính năng mới, mô phỏng các quá trình phức tạp được quan sát trong cơ thể như tín hiệu tế bào, hóa học, hình học, thể hiện chính xác hơn môi trường vi mô thực tế, các tế bào sau đó có thể phát triển trong cơ thể. Nuôi tế bào thu nhỏ 3D là xu hướng mới trong nghiên cứu y sinh, giúp các tế bào cùng loại và khác loại tương tác với nhau, tái sắp xếp tương tác đồng điệu để hình thành cấu trúc giống với mô thật. Hydrogel là scaffold 3D có khả năng tự hỗ trợ, trương nở, dễ dàng khuếch tán và gắn các tế bào. Các vật liệu khác như kim loại, thủy tinh, gốm sứ cũng được làm scaffold và dùng để kiểm soát các đặc tính bề mặt cấu trúc và hóa học của chúng. Chất nền ngoại bào được cấu tạo chủ yếu từ các sợi glicoprotein kết hợp với các chất vô cơ và hữu cơ khác nhau, giúp liên kết và thu nhận thông tin giữa các tế bào. 145
  2. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái nhàu (Morinda citrifolia L.) lên sự sinh trưởng của tế bào … Collagen là chất nền ngoại bào quan trọng nhất với khả năng tạo thành hệ scaffold hỗ trợ tế bào về mặt cơ học. Một số protein quan trọng khác trong thành phần của chất nền ngoại bào như laminin, fibronectin, prexonine, epigallocatechin gallate (EGCG) có hoạt tính chống oxy hóa và có hàm lượng cao trong trái Nhàu (M. citrifolia L.) được sử dụng làm giá thể cho tế bào phát triển. Trái Nhàu có hoạt tính sinh học đa dạng, là chất trung gian trong việc điều chỉnh tốc độ phân bào thông qua việc truyền tín hiệu nội bào, điều hòa và tiếp nhận tín hiệu, tăng tốc độ tái tạo mô, điều hòa miễn dịch. Nhằm sử dụng trái Nhàu cho thử nghiệm kích thích các protein gắn kết tạo chất nền ngoại bào tổng hợp trong nuôi tế bào 3D cho kỹ thuật y sinh. Do tính mới của nó, kỹ thuật này chưa được hiểu đầy đủ, việc phát triển ứng dụng để cải thiện việc nuôi tế bào 3D có thể mở ra một kỹ thuật nuôi mới thể hiện sự phong phú về tính ứng dụng của trái Nhàu. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Trái Nhàu (Morinda citrifolia L.) được thu mẫu tại đường Lê Văn Hưu, Thuận Thành, Thành phố Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam (Toạ độ 16.47776° B, 107.57497° Đ). Tuyển chọn các quả vừa chín tới, nguyên vẹn và không bị sâu hại. Hình 1: Trái Nhàu (Morinda citrifolia L.) Tế bào thử nghiệm Nguyên bào sợi (Fibroblast) được thu nhận từ lớp màng lót của dây rốn. Dây rốn được thu nhận tại Khoa Sản, Bệnh viện Trung ương Huế, được sự đồng ý của bệnh viện, bác sĩ và gia đình. Sản phụ trong độ tuổi từ 18 – 35 tuổi, âm tính HIV, âm tính viêm gan B và các bệnh truyền nhiễm. Vật liệu nuôi cấy 3D Vật liệu scaffold được nung bởi các muối canxi photphat (Ca3(PO4)2) do Phòng thí nghiệm Hóa học, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế cung cấp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Điều chế cao chiết từ trái Nhàu Trái Nhàu sau khi thu hái được rửa sạch, cắt nhỏ và sấy khô ở 50°C. Mẫu được nghiền nhỏ thành dạng bột mịn. Mẫu được ngâm với methanol 96o trong 20 giờ ở nhiệt 146
  3. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 23, Số 2 (2023) độ phòng với tỷ lệ 36: 200 (g/mL). Sau khi ngâm, dịch chiết được lọc qua giấy lọc và tiến hành cô đọng dung môi ở 40°C cho đến cao chiết có màu nâu đen sánh [14]. Thiết kế vật liệu nuôi cấy 3D Vật liệu scaffold được nung bởi muối canxi photphat (Ca3(PO4)2) trong lò nung Nabertherm (Đức), với điểm nóng chảy là 1670ºK (1391ºC). Xác định thành phần các hợp chất từ cao chiết trái Nhàu bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) Thành phần các hợp chất của cao chiết được xác định bằng máy sắc ký khí ghép phối phổ GC-MS tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Thừa Thiên Huế. Phân lập và nuôi tăng sinh nguyên bào sợi từ cuống rốn Tiến hành theo phương pháp của Larouch và cs (2008), có cải tiến phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm [1]. Dây rốn được thao tác trong điều kiện vô trùng, rửa dây rốn bằng PBS kháng sinh 5X, 1X. Loại bỏ máu dây rốn bằng 20 ml heparin và rửa lại bằng PBS 1X. Tách lớp màng lót bên ngoài dây rốn, cắt mảnh nhỏ (2-3 mm2). Nuôi sơ cấp: Đặt 5 mảnh mô vừa xử lý vào chai nuôi T-flask 25 cm2 với môi trường DMEM/F12 + 10% FBS + 1% kháng sinh, tiến hành ủ ở 37℃, độ ẩm 95% và 5% CO2. Sau 3-4 ngày thay môi trường một lần. Nuôi thứ cấp: Khi tế bào đạt mật độ 70 – 80 % bề mặt nuôi, tách bằng trypsin EDTA 0,25% và nuôi với mật độ 1000 tế bào/cm2. Đánh giá khả năng làm lành vết xước bằng cao chiết trái Nhàu Khi tế bào đạt 70 - 80%, tiến hành tạo vết xước 800 μm theo chiều rộng bằng đầu col 5 ml. Môi trường nuôi cấy sau đó được loại bỏ ngay lập tức. Rửa chai nuôi 2 lần với PBS và thay thế bằng môi trường DMEM/F12 + 10% FBS + 1% kháng sinh. Thêm vào môi trường nuôi các nồng độ khác nhau của cao chiết trái Nhàu. Theo dõi sau mỗi 3 giờ liên tục trong 72 giờ. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kích thước vết thương được theo dõi tại các thời điểm khác nhau bằng cách quan sát dưới kính hiển vi và đánh giá mức độ di chuyển của tế bào, định lượng bằng tỷ lệ khoảng cách 72 giờ so với 48 giờ. Nhuộm đánh giá nhiễm sắc thể (NST) đồ Nguyên bào sợi ở lần cấy chuyền thứ 3, trước và sau khi thử nghiệm vết xước được nhuộm để quan sát sự ổn định của bộ NST. 147
  4. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái nhàu (Morinda citrifolia L.) lên sự sinh trưởng của tế bào … Kỹ thuật nhuộm băng G được sử dụng để nhuộm NST ở kỳ giữa. NST ở kỳ giữa được xử lý bằng enzyme phân giải protein và được nhuộm với Giemsa. Băng tối là đoạn ADN giàu A, T (ngược lại với băng R), băng sáng là những đoạn giàu G, C. Nhuộm Giemsa 15 phút và đọc tiêu bản NST trên kính hiển vi huỳnh quang với sự hỗ trợ của phần mềm phân tích băng G. Thống kê và xử lý số liệu Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lí thống kê bằng phần mềm Excell 2010 với mức ý nghĩa p
  5. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 23, Số 2 (2023) Bảng 1: Thành phần các hợp chất từ cao chiết methanol trái Nhàu Kết quả ở Bảng 2 cho thấy 23 hợp chất đã được xác định từ cao chiết methanol trái Nhàu, bao gồm Eugenol (21,88%), 9,12-octadecadienoic acid (19,91%), Octanoid acid (15,40%) và một số thành phần khác như Humulene, Coumaran, Cinnamaldehyde, Anethole, Caryophyllene, Eugenol axetat, Dextromethorphan… Những hợp chất này thuộc nhóm alkaloids, carbohydrates, flavonoids, phenol... Kết quả này tương tự với công bố của Sasikumar và cs (2012) về thành phần các hợp chất từ cao chiết methanol trái Nhàu thu tại Nigeria, bao gồm Steroids, Cardiac Glycosides, Phenol, Tannins, Terpenoids, Alkaloids, Resins, Carbohydrates, Flavonoids, Reducing sugar, Saponins, Lipids. Nagalingam và cs (2012) khi nghiên cứu sự hiện diện của các chất chuyển hóa thứ cấp trong cao chiết ethanol và methanol quả M. citrifolia Ấn Độ đã phát hiện steroid, cardiac glycoside , phenol, tanins , terpenoids , alkaloids, carbohydrates, flavonoids, reducing sugar và chất béo [13]. Kết quả phân tích GC-MS của cao chiết methanol trái Nhàu đã thu được các hợp chất có giá trị trong ngành công nghiệp dược liệu và điều trị. Thành phần và hàm lượng các hợp chất phụ thuộc vào dung môi và quy trình bào chế. Eugenol có trong cao chiết methanol chiếm 21,88% là hợp chất có giá trị trong y học và công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm. Hợp chất này tác động lên hệ thần kinh 149
  6. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái nhàu (Morinda citrifolia L.) lên sự sinh trưởng của tế bào … trung ương, chống co giật và gây mê, đồng thời cũng là chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, giảm đau, kháng virus, kháng nấm, kháng oxy hóa và có khả năng ức chế sự tăng sinh của các tế bào u ác tính [2], [3]. Hợp chất Scopoletin chiếm 0,93% là một coumarin tự nhiên chính của trái Nhàu. Là hợp chất có giá trị trong y học, có hoạt tính giảm đau, kiểm soát serotonin, kháng ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng oxy hóa, chống đông máu, kháng virus, bảo vệ thần kinh, chống co giật và điều hòa huyết áp [4]. Octanoic acid chiếm 15,40% là hợp chất kháng khuẩn, chống động kinh, có khả năng ức chế khả năng tồn tại của các tế bào ung thư đại trực tràng, da và ung thư vú in vitro. Ngoài ra, axit caprylic có vai trò trong việc điều chỉnh giảm sự biểu hiện của các gen quan trọng đối với sự tiến triển và phân chia chu kỳ tế bào trong các tế bào ung thư ruột kết, bao gồm kinase phụ thuộc cyclin 2 (CDK2), CDK4, cyclin A2 (CCNA2) và CCND1 [5]. Cinnamyl alcohol chiếm 0,13% là hợp chất được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm, có hoạt tính chống viêm và kháng khuẩn tốt. Ngoài ra, cinnamyl alcohol còn là một loại hóa chất đa năng được ứng dụng trong quá trình tổng hợp các hợp chất có giá trị khác nhau, như cinnamyl ester (chất tạo hương và vị), flunarizine (điều trị nhiễm nấm), taxol (điều trị ung thư) và cinnamyl glycoside (tăng cường miễn dịch) [6]. Như vậy, từ kết quả về các thành phần hợp chất có trong cao chiết trái Nhàu cho thấy sự hiện diện của các thành phần có hoạt tính sinh học khác nhau như: flavonoid, alkaloid, steroid, saponin, Cinnamyl alcohol, Scopoletin. Trong những nhóm hợp chất trên thì flavonoid thuộc polyphenol được xem góp phần tích cực vào các hoạt động chống oxy hóa của các hợp chất tự nhiên. Bên cạnh việc có các hoạt động kháng oxi hóa, flavonoid và các hợp chất thuộc nhóm polyphenol cũng có vai trò hiệu quả là các yếu tố kháng viêm. Đặc biệt hợp chất cinnamyl glycoside một là một phân tử dược, trong đó một đường kết nối với một nhóm chức năng thông qua một liên kết glycosid, đóng nhiều vai trò quan trọng trong các sinh vật sống, chúng có thể được kích hoạt bằng cách thủy phân enzyme, làm cho phần đường bị phá vỡ và kích hoạt các enzyme tổng hợp quan trọng nhất trong tự nhiên. Điều này phù hợp cho việc lựa chọn quả Nhàu hỗ trợ làm giá thể cho khung 3D. 3.2. Kết quả phân lập và đánh giá chất lượng nguyên bào sợi Các đoạn dây rốn có kích thước dài từ 12-15 cm sau 3 đợt thu mẫu được sử dụng để phân lập nguyên bào sợi. Hầu hết các nghiên cứu phân lập nguyên bào sợi đều sử dụng phương pháp kết dính mô với bề mặt nuôi cấy và duy trì mô trong môi trường tăng trưởng để nguyên bào sợi dần đi ra, sau đó sẽ thu tế bào. 150
  7. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 23, Số 2 (2023) Theo dõi sau 10 ngày nuôi cấy, nguyên bào sợi đi ra khỏi mảnh mô bám trên bề mặt T-flask quan sát thấy có hình dạng tròn hoặc oval. Các nguyên bào sợi bám gần như hoàn toàn, một vài tế bào bắt đầu trải dạng hình thoi. Sau 15 ngày, nguyên bào sợi trải hoàn toàn, một số có hình dạng đặc trưng. Sau 22 ngày nuôi cấy, nguyên bào sợi hợp dòng, bám đều, trải rộng trên bề mặt bình nuôi và tăng sinh nhanh. Sau 25 ngày nuôi cấy, mật độ tế bào nguyên bào sợi đạt 70-80% diện tích bình nuôi, trải đều trên bề mặt chai nuôi (Hình 3). Hình 3: Nuôi cấy sơ cấp nguyên bào sợi dây rốn A.Tế bào sau 10 ngày; B. Sau 15 ngày; C. Sau 22 ngày; D. Sau 25 ngày Theo nghiên cứu của Takashima Akira (1998), nguyên bào sợi có khả năng thay đổi hình thái tùy thuộc vào mức độ hợp lưu hay mật độ tế bào [7], tuy nhiên hình thái của chúng vẫn có dạng chung là thon dài và tạo nhánh ở hai đầu. Quan sát hình ảnh tế bào nuôi cấy P3 và hình thái sau khi nhuộm H&E (Hình 4: A-B) cho thấy kết quả chúng tôi có những nét tương đồng với các công bố trước đó [8], [7]. Để theo dõi tốc độ tăng trưởng của các tế bào nuôi cấy, chúng tôi xây dựng đường cong tăng trưởng bằng hệ thống X-Celligence với các mẫu tế bào được thu hoạch ở giai đoạn nuôi cấy P3 (Hình 4 - C). Kết quả cho thấy ở quá trình nuôi cấy thứ cấp, tốc độ tế bào tăng sinh nhanh hơn so với quá trình nuôi cấy sơ cấp. Điều này tương ứng với các nghiên cứu về tốc độ tăng sinh của nguyên bào sợi nuôi cấy in vitro [9], [7]. 151
  8. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái nhàu (Morinda citrifolia L.) lên sự sinh trưởng của tế bào … Hình 4: Đặc điểm nguyên bào sợi in vitro nuôi cấy Để xác định các tế bào nuôi cấy là nguyên bào sợi, chúng tôi đã thực hiện phân loại tế bào được kích hoạt bằng huỳnh quang - FASC để xác định các dấu hiệu cụ thể của bề mặt nguyên bào sợi. Kết quả cho thấy các tế bào âm tính với CD34, mặt khác CD45 dương tính với CD90 và α-SMA (Hình 4 - D). Kết quả thu được cho thấy các dấu hiệu đặc trưng của nguyên bào sợi như công trình đã được công bố trước đó như của Paul Johnson và cs (2016) [9]. Từ kết quả nuôi cấy tăng sinh UCF cho thấy hình thái, tốc độ tăng sinh, các dấu hiệu bề mặt tế bào tương ứng với những nghiên cứu về nuôi cấy nguyên bào sợi trước đây, chứng minh rằng các tế bào chúng tôi phân lập và nuôi cấy là nguyên bào sợi. 3.3. Khảo sát nồng độ cao chiết tối ưu kích thích khả năng tăng sinh nguyên bào sợi trong mô hình nuôi tế bào 2D Sau khi xác định được nồng độ gây độc NBS của cao chiết trái Nhàu, tiến hành khảo sát khả năng kích thích tăng sinh NBS của cao chiết ở các nồng độ nhỏ hơn. NBS sẽ tăng khả năng phân chia tế bào khi nhận các yếu tố tăng trưởng từ môi trường. Sự tăng sinh và di chuyển của NBS đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm lành vết thương. NBS bị thu hút bởi các yếu tố tăng trưởng được tiết ra bởi tiểu cầu, bạch cầu đơn nhân để di chuyển đến vị trí vết thương và tăng sinh làm liền vết 152
  9. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 23, Số 2 (2023) thương. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát các nồng độ cao chiết khác nhau để tìm ra nồng độ tối ưu cho việc tăng khả năng phân chia tế bào bằng cách làm lành vết xước. Khi NBS đạt 70 - 80% diện tích đĩa 6 giếng, tiến hành tạo các vết xước với kích thước 800 μm. Vết xước được chọn phải đảm bảo đồng đều về kích thước vết xước và không làm thương tổn tế bào. Cho tế bào tiếp xúc với nồng độ khác nhau (20 - 160 μg/ml) của cao chiết để đánh giá khả năng gây tăng sinh nguyên bào sợi. Tiến hành theo dõi tế bào sau 48 giờ đến 72 giờ, kết quả nghiên cứu được thể hiện ở Hình 5. Hình 5: Ảnh hưởng của cao chiết methanol trái Nhàu ở các nồng độ khác nhau lên khả năng làm lành vết xước ở NBS (48 giờ - 64 giờ - 72 giờ) 153
  10. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái nhàu (Morinda citrifolia L.) lên sự sinh trưởng của tế bào … Ở thời gian 24 giờ sau khi bổ sung cao chiết trái Nhàu, các tế bào vẫn phát triển bình thường, kích thước vết xước chưa thay đổi ở tất cả các nhóm. Sau 48 giờ, bắt đầu có sự di chuyển của tế bào ra vùng rìa của vết xước ở các giếng, mật độ tế bào dày hơn so với nhóm đối chứng đặc biệt ở các nồng độ 40 μg/ml, 80 μg/ml, 120 μg/ml. Sau 64 giờ, các tế bào ở các giếng bổ sung cao chiết tăng sinh mạnh mẽ, trong đó nồng độ 120 μg/ml các tế bào có khả năng tăng sinh mạnh nhất và gấp 2,3 lần so với đối chứng. Sau 72 giờ theo dõi, hầu hết tế bào đã phủ đầy vết xước ở các giếng có bổ sung dịch chiết so với đối chứng. Riêng ở nồng độ 120 μg/ ml, tế bào ở vết xước dày nhất so với các nồng độ khác. Như vậy, kết quả nghiên cứu cho thấy kích thước vết xước thu hẹp nhanh nhất sau 72 giờ ở nồng độ 120 μg/ml. Từ đó có thể kết luận, trong nghiên cứu của chúng tôi nồng độ 120 μg/ml của cao chiết trái Nhàu là tối ưu cho sự phát triển và tăng sinh NBS. Khi so sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với các nghiên cứu trước đây về hoạt tính kích thích sự tăng sinh của hợp chất thứ cấp trong cây thảo dược, cho thấy sự tương đồng rõ rệt. Kim và cs (2005) đã báo cáo các hợp chất được tìm thấy trong cao chiết trái Nhàu (Morinda citrifolia) tham gia vào con đường tín hiệu BMP2, Runx2 và Wnt có tác dụng kích thích tổng hợp collagen type I và kích thích tăng sinh nguyên bào sợi in vitro so với nghiệm thức đối chứng [10]. Năm 2016, Wahedi và cs đã nghiên cứu khả năng làm liền vết xước từ hợp chất juglone trong quả Óc chó trên mô hình in vitro của nguyên bào sợi và thu được kết quả môi trường có bổ sung hợp chất julone làm lành vết xước nhanh hơn so với đối chứng trong 24 giờ theo dõi [11]. Năm 2009, Nayak cho thấy cao chiết ethanol của trái Nhàu có khả năng kích thích NBS và khẳng định tính hiệu quả cao chiết ethanol của trái Nhàu trong việc chữa lành vết thương trên mô hình chuột in vivo [12]. 3.4. Kết quả thử nghiệm nuôi tế bào nguyên bào sợi kết hợp cao chiết trái Nhàu lên vật liệu 3D NBS có nguồn gốc từ trung mô được duy trì trong các mô liên kết của cơ thể trưởng thành. Trong in vivo quần thể NBS hoạt động có thể được nhận biết bằng mạng lưới nội chất thô dồi dào, nhờ các NBS có một tế bào chất phân nhánh bao quanh một nhân tế bào hình elip, lốm đốm có hai hoặc nhiều nhân con. Theo nghiên cứu của Mamoru (2004), các NBS hình thái không đồng nhất với sự xuất hiện đa dạng tùy thuộc vào vị trí và trạng thái hoạt động của chúng. Các NBS cũng có thể di chuyển chậm trên nền đáy như các tế bào riêng lẻ. Mặc dù rời rạc và phân tán khi chúng phải che phủ một không gian rộng lớn, các nguyên bào sợi, khi nhiều, thường gắn cục bộ ở các cụm song song [15]. Với các đặc tính sinh học này, chúng tôi lựa chọn NBS cho thử nghiệm nuôi tế bào 3D kết hợp bổ sung cao chiết trái Nhàu với nồng độ 120 μg/ml. Cao chiết trái 154
  11. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 23, Số 2 (2023) Nhàu chứa các yếu tố hỗ trợ quá trình việc phân chia tế bào và đóng vai trò là yếu tố hỗ trợ NBS tiếp cận các mặt trận của vật liệu 3D. NBS có khả năng phân chia mạnh, tế bào có thể di động chủ yếu nhờ sợi actin và myosin ở ngoại vi bào tương. Tế bào có những nhánh là chân giả dạng sợi. Việc bổ sung cao chiết trái Nhàu ở nồng độ 120 μg/ml như là một cách thức bổ sung những tương tác dẫn đến tín hiệu của tế bào, kích hoạt các thành phần khác để tế bào thích ứng với điều kiện nuôi 3D. Quá trình nuôi thử nghiệm 3D được thực hiện trên đĩa nuôi. NBS được nuôi cấy chuyền P2. Mật độ 1000 tế bào/cm2. Thay môi trường 2 lần/tuần. Sau 15-20 ngày đánh giá kết quả. Hình 6: Nuôi tế bào trên vật liệu 3D Dựa trên chức năng chính của NBS là duy trì tính toàn vẹn cấu trúc của các mô liên kết bằng cách liên tục tiết ra tiền chất của cấu trúc nền. Vì vậy việc nuôi tế bào NBS trong vật liệu 3D này cũng có thể thúc đẩy tính năng sinh học của NBS tiết ra tiền chất của tất cả các thành phần của cấu trúc nền là chất nền và một loạt các sợi kết nối với khung scaffold của vật liệu 3D. Do khung này được chế tạo có độ cứng giống như mô phỏng chất nền ngoại bào khung xương nên không có thiết bị kính hiển vi TEM và SEM để chụp và phản ảnh được kết quả nuôi cũng như sự phát triển tế bào NBS. Trên thực tế, giống như bất kỳ scaffold nào khác, vật liệu xốp này hoạt động như một chất nền ngoại bào phong phú có thể lưu trữ các chất dinh dưỡng và các yếu tố hòa tan như cytokine và các yếu tố tăng trưởng có thể di chuyển qua lại. Các yếu tố hòa tan này được tiết ra bởi các tế bào NBS dưới sự kích thích từ các hợp chất như beta glycerophosphat, triterpenes, và flavonoid từ cao chiết trái Nhàu để cho thấy hợp chất đó hỗ trợ sự liên kết tế bào-tế bào [16]. Nghiên cứu này tập trung vào giai đoạn đầu của quá trình đưa tế bào NBS di chuyển vào khung xốp 3D mô phỏng khung xương nhân tạo dưới dạng một sự tương tác tế bào-tế bào liên quan đến không gian phối hợp giữa các tế bào và khung scaffold canxi photphat 3D, vật liệu sinh học này tính tương thích sinh học cao thuận lợi cho chất dinh dưỡng có thể khuếch tán vào sâu tới các ô xốp sâu bên trong. 155
  12. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái nhàu (Morinda citrifolia L.) lên sự sinh trưởng của tế bào … Hình 7: NBS nuôi cấy 3D nhìn dưới kính hiển vi huỳnh quang A. Sau 1 ngày B. Sau 15 ngày Tình trạng sống sót của các tế bào phát triển trên khung scaffold canxi photphat đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng nhuộm tế bào sống/chết, trong đó các đầu dò huỳnh quang màu xanh lá cây và đỏ được dán nhãn tương ứng cho các tế bào sống và chết, sau đó là kính hiển vi huỳnh quang. Các tế bào dần chiếm bề mặt và không gian bên trong của scaffold theo thời gian (Hình 35A-B). Chỉ có một số tế bào chết được phát hiện trong quá trình quan sát (Hình 7), cho thấy sự sống sót và nhân lên của tế bào mạnh mẽ đã được thiết lập trong môi trường nuôi cấy. Vai trò chính của nuôi 3D là mô phỏng cấu trúc của nền ngoại bào của mô, là một scaffold gồm các protein dạng sợi phi tế bào, các đại phân tử cấu trúc khác nhau và các phân tử kết dính cung cấp hỗ trợ về cấu trúc và sinh hóa cho tế bào và rất cần thiết cho nhiều nghiên cứu cơ bản. Trên thực tế, trong môi trường 3D, các tế bào có xu hướng chịu nhiều thay đổi về hình thái và sinh lý hơn so với các tế bào phát triển trong môi trường 2D. Điều này chủ yếu có thể được giải thích bằng vai trò cấu trúc và ảnh hưởng của scaffold hướng dẫn hành vi của tế bào. Các nghiên cứu đã phát hiện ra rằng hình dạng và thành phần của hỗ trợ tế bào giúp tăng cường giao tiếp giữa tế bào với tế bào. KẾT LUẬN Đã bào chế thành công cao chiết methanol trái Nhàu (M. citrifolia L.) chứa 23 hợp chất bao gồm Eugenol (21,88%), 9,12-octadecadienoic acid (19,91%), Octanoid acid (15,40%). Ngoài ra, trong cao chiết còn có mặt các thành phần khác như Humulene, Coumaran, Cinnamaldehyde, Anethole, Caryophyllene, Eugenol axetat, Dextromethorphan… Những hợp chất này thuộc nhóm Alkaloids, Carbohydrates, Flavonoids, Phenol... là những nhóm chất kích thích liên kết tế bào – chất nền ngoại bào phù hợp với scafffold 3D cần nghiên cứu. 156
  13. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 23, Số 2 (2023) Trên môi trường 2D, sau 64giờ nuôi cấy, cao chiết methanol trái Nhàu (M. citrifolia L.) với nồng độ 120 μg/ml cho thấy khả năng kích thích tăng sinh NBS nhanh nhất. Trên môi trường 3D, sau 15 ngày nuôi cấy, cao chiết methanol trái Nhàu (M. citrifolia L.) với nồng độ 120 μg/ml cho thấy khả năng kích thích tăng sinh NBS tạo cụm rõ rệt. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Larouche D, Cantin-Warren L, Desgagné M, Guignard R, Martel I, Ayoub A, Lavoie A, Gauvin R, Auger FA, Moulin VJ, Germain L (2016). Improved Methods to Produce Tissue-Engineered Skin Substitutes Suitable for the Permanent Closure of Full-Thickness Skin Injuries. BioResearch Open Access., 320-329. http://doi.org/10.1089/biores.2016.0036. [2]. Pisano M, Pagnan G, Loi M et al. (2007). Antiproliferative and pro-apoptotic activity of eugenol-related biphenyls on malignant melanoma cells. Mol Cancer, 6(8) .https://doi.org/10.1186/1476-4598-6-8. [3]. Al-Kharashi LA, BakheetT, AlHarbi WA, Al-Moghrabi N, Aboussekhra A (2021). Eugenol modulates genomic methylation and inactivates breast cancer-associated fibroblasts through E2F1-dependent downregulation of DNMT1/DNMT3A. Molecular carcinogenesis, 60(11) 784-795. https://doi.org/10.1002/mc.23344. [4]. Meilawati L, Dewi RM, Tasfiyati AN, Septama AW, Antika LD (2023). Scopoletin: Anticancer potential and mechanism of action. Asian Pac J Trop Biomed ,13, 1-8. [5]. Altinoz,MA, Ozpinar A, Seyfried,T.N.(2020). Caprylic (Octanoic) Acid as a Potential Fatty Acid Chemotherapeutic for Glioblastoma. Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 159, 102142. https://doi.org/10.1016/j.plefa.2020.102142. [6]. Zhang C, Xu Q, Hou H, Wu J, Zheng Z, Ouyang J (2020). Efficient biosynthesis of cinnamyl alcohol by engineered Escherichia coli overexpressing carboxylic acid reductase in a biphasic system. Microb Cell Fact., 19(1), 163. doi: 10.1186/s12934-020-01419-9. [7]. Akira T (1998). Establishment of Fibroblast Cultures. Current Protocols in Cell Biology, 00(1), 2.1.1-2.1.12. [8]. Mamoru KS, Masako FL, Alfredo G, Da Silva DI, Dos SIAN (2004). Experimental model for fibroblast culture. Acta Cirúrgica Brasileira, 19, 11-16. [9]. Paul J, Beswick Ellen J., Celia C, Powell Don W., Au – Hellmich Mark R., Au -Pinchuk Iryna V. (2016). Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens. JoVE, 107, e53691. [10]. Kim SW, Jo BK, Jeong JH, Choi SU, Hwang YI (2005). Induction of extracellular matrix synthesis in normal human fibroblasts by anthraquinone isolated from Morinda citrifolia (Noni) fruit. J Med Food., 8(4):, 52-55. doi: 10.1089/jmf.2005.8.552. 157
  14. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái nhàu (Morinda citrifolia L.) lên sự sinh trưởng của tế bào … [11]. Wahedi HM, Park YU, Moon EY, Kim SY (2016). Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair Regen., 24(5):, 86-794. doi: 10.1111/wrr.12452. [12]. Nayak BS, Sandiford S, Maxwell A,(2009), Evaluation of the wound-healing activity of ethanolic extract of Morinda citrifolia L. leaf. Evidence based complementary and alternative medicine, eCAM 2009;6(3)351–356 doi:10.1093/ecam/nem127 [13]. Nagalingam S, Sasikumar CS, Cherian KM (2012), Extraction and preliminary phytochemical screening of active compounds in Morinda citrifolia fruit. Asian J. Pharm. Clin. Res., 5 (2), 179-181. [14]. Taechowisan T, Sarakoat P, Phutdhawong WS (2019). Major Chemical Composition of Fruit Extracts of Morinda citrifolia L. and their Antibacterial, Antioxidant and Cytotoxicity Properties. Journal of Applied Sciences, 19, 366-375. Doi. 10.3923/jas.2019.366.375. [15]. Mamoru KS, Masako FL, Alfredo G, Silva DID, Dos SIAN (2004). Experimental model for fibroblast culture. Acta Cirúrgica Brasileira,19, 11-16. [16]. Zietarska M, Maugard CM, Filali-Mouhim A, Alam-Fahmy M, Tonin PN; Provencher DM, Mes-Masson AM (2007). Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC). Mol. Carcinog.,, 46, 872– 885. THE EFFECTS OF METHANOL EXTRACT OF NONI (Morinda citrifolia L.) FRUIT ON 3D CELL CULTURE Nguyen Thi Tam*, Dang Thi Kieu Duong, Nguyen Binh Linh Chi University of Sciences, Hue University *Email: nguyentam181000@gmail.com ABSTRACT Methanol extract of noni (Morinda citrifolia L.) fruit significantly inhibited of NO production without effecting on cell viability. The methanol extract of noni fruit was proven to reduce the tumor necrosis factor-alpha of pro-inflammatory cytokines. These results proved that the anti-inflammatory effect of extract of noni fruit was related to a reduction in the expression of inflammatory mediators and support 3D cell culture growth. The objective of this study is to evaluate the effects of methanol extract of noni (M. citrifolia L.) fruit on 3D cell culture. Our results showed that fibroblasts proliferated well after 15 days 3D cell culture containing 120 µg/ml noni extract. Keywords: Morinda citrifolia L., 3D cell, , noni fruit. 158
  15. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 23, Số 2 (2023) Nguyễn Thị Tâm sinh ngày 18 tháng 10 năm 2000 tại Thừa Thiên Huế. Hiện tại là sinh viên năm cuối chuyên ngành Công nghệ sinh học tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Lĩnh vực nghiên cứu: Tế bào gốc; sinh học phân tử; nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật. Đặng Thị Kiều Dưỡng sinh ngày 29 tháng 03 năm 2000 tại TP Huế. Hiện tại là sinh viên năm cuối chuyên ngành Công nghệ sinh học tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Lĩnh vực nghiên cứu: Tế bào gốc; sinh học phân tử; tối ưu hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/CAS9 ở nấm men; nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật. Nguyễn Bình Linh Chi sinh ngày 04 tháng 12 năm 2000 tại TP.Huế. Hiện tại đang là sinh viên năm cuối chuyên ngành Công nghệ sinh học tại trường Đại học Khoa học, Đại học Huế.a Lĩnh vực nghiên cứu: Tế bào gốc, nghiên cứu sự đề kháng và không dung nạp thuốc Imatinib trong bệnh Bạch cầu mạn dòng tủy, nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật. 159
  16. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái nhàu (Morinda citrifolia L.) lên sự sinh trưởng của tế bào … 160
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2