ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LAN RỪNG Dendrobium THU THẬP TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ RỪNG NAM CÁT TIÊN BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:97

Thêm vào BST

Báo xấu

165
lượt xem 36
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Hoa lan là một trong những sản phẩm đặc thù của ngành nông nghiệp đô thị, không những góp phần tích cực vào việc nâng cao hiệu quả sử dụng lao động, đất, nƣớc và các nguồn lực khác, mà còn làm cho chất lƣợng môi trƣờng sống ngày càng mỹ quan hơn. Vì vậy phát triển hoa lan là một xu thế trong sản xuất nông nghiệp ở các đô thị hiện nay và ngay cả trong tƣơng lai. Với khí hậu nhiệt đới, Việt Nam nói chung và Thành phố Hồ Chí Minh, Nam Cát Tiên nói riêng...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LAN RỪNG Dendrobium THU THẬP TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ RỪNG NAM CÁT TIÊN BẰNG KỸ THUẬT RAPD

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ̀ TRƢƠNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LAN ̀ RƢNG Dendrobium THU THẬP TẠI THÀ NH PHỐ ̀ HỒ CHÍ MINH VÀ RƢNG NAM CÁT TIÊN BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG MINH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ̀ TRƢƠNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LAN ̀ RƢNG Dendrobium THU THẬP TẠI THÀ NH PHỐ ̀ HỒ CHÍ MINH VÀ RƢNG NAM CÁT TIÊN BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. TRẦN THỊ DUNG TRƢƠNG MINH DŨNG TS. VÕ THÁI DÂN ́ CN. LƢU PHUC LỢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007
̀ ̉ LƠI CAM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban Giám Đố c Viê ̣n Công Nghê ̣ Sinh Ho ̣c và Môi Trƣờng – Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm TP. HCM. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. Đã hỗ trợ và tạo điều kiện tốt trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin trân tro ̣ng gƣ̉i lời biế t ơn đế n các thầ y cô: - TS. Trần Thị Dung - TS. Võ Thái Dân - CN. Lƣu Phúc Lợi Đã tâ ̣n tình hƣớng dẫn , chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng nhƣ ta ̣o điề u kiê ̣n tố t nhấ t cho viê ̣c thƣ̣c hiê ̣n và hoàn tấ t đề tài tố t nghiê ̣p này . CN. Huỳnh Kim Hƣng và toàn thể các anh chị thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng – Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm TP. HCM đã quan tâm giúp đỡ trong suốt thời gian ở phòng thí nghiệm. Kỹ sƣ Huỳnh Tuấ n Anh – trƣởng Tra ̣m khuyế n nông huyê ̣n Tân Phú , tỉnh Đồng Nai đã tận tình hƣớng dẫn trong suốt thời gian thu mẫu tại rƣ̀ng Nam Cát Tiên. Cô Nguyễn Thị Cách và các anh Trƣờng , Tùng, chị Vân đã tận tình hƣớng dẫn trong suố t thời gian thu mẫu ta ̣i Thành phố Hồ Chí Minh. Toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. TP. HCM, tháng 09 năm 2007 Trƣơng Minh Dũng iii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN TRƢƠNG MINH DŨ NG , Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm Tp . Hồ Chí Minh, 9/2007. “Đánh giá đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium thu thâ ̣p ta ̣i Thành phố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cá t Tiên bằ ng kỹ thuâ ̣t RAPD.” Hô ̣i đồ ng hƣớng dẫn: TS. Trầ n Thi ̣Dung, TS. Võ Thái Dân, CN. Lƣu Phúc Lơ ̣i. Điạ điể m nghiên cƣ́u: Viê ̣n Công Nghê ̣ Sinh Ho ̣c và Môi Trƣờng , Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Viê ̣t Nam sở hƣ̃u nhiề u nguồ n gen quý hiế m , đô ̣c đáo, mới la ̣ của giố ng lan rƣ̀ng Dendrobium. Các giống Dendrobium không nhƣ̃ng đe ̣p , giá trị kinh tế cao , mà còn có giá trị y học . Vì vậy, trƣớc hế t chúng ta cầ n phải khảo sát sƣ̣ đa da ̣ng di truyề n của các giống lan rừng Dendrobium, tạo nền tảng cho công tác bảo tồn và tạo các giố ng mới, trên cơ sở đó, xây dƣ̣ng thƣơng hiê ̣u cho cây lan Viê ̣t Nam . Thiế t lâ ̣p quy trình li trích DNA tổ ng số tƣ̀ mẫu lá có đô ̣ tinh sa ̣ch và ổ n điṇ h cao. Bên ca ̣nh đó , xây dƣ̣ng phản ƣ́ng PCR với primer RAPD cho tinh đa hinh cao . ́ ̀ Tƣ̀ đó, phân tich tinh đa da ̣ng di truyề n của 10 giố ng lan rƣ̀ng Dendrobium thu thâ ̣p ́ ́ tại Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên dựa trên phần mềm NTSYSp c Version 2.1 và Winboot. Quy trình li trích DNA tƣ̀ mẫu lá có đô ̣ tinh sa ̣ch và ổ n đinh cao ̣ đã đƣơ ̣c tố i ƣu thành công . 6 primer ngẫu nhiên : OPAC10, OPAH13, 0PB01, OPB08, S1384, U693 đƣơ ̣c dùng trong phân tich đa da ̣ng di truyề n của các giố ng lan khảo sát bằ ng ́ kỹ thuật RAPD . Trên cơ sở đó , xây dƣ̣ng sơ đồ phân nhóm di truyề n của 10 giố ng lan rƣ̀ng Dendrobium. Sơ đồ phân nhóm di truyề n cho thấ y các giố ng lan khảo sát có sƣ̣ đa da ̣ng cao về mă ̣t di truyề n , phân thành 5 nhóm với mức tƣơng đồng gen từ 0.39 – 0.79. iv
SUMMARY Genetic diversity analysis of wild Dendrobium stem at Ho Chi Minh city and Nam Cat Tien forest by RAPD Supervisor: Tran Thi Dung1, PhD; Vo Thai Dan2, PhD; Luu Phuc Loi1, BSc Student: Truong Minh Dung1 1 Department of Biotechnology, Nong Lam university, Ho Chi Minh city 2 Faculty of Agriculture, Nong Lam university, Ho Chi Minh city To analysis the genetic diversity of wild Dendrobium orchid, six decamers were used for 10 wild Dendrobium species, collected from Ho Chi Minh city and Nam Cat Tien forest (Dong Nai province). Collecting 10 species from Ho Chi Minh city and Nam Cat Tien forest (Dong Nai province), optimizing of protocols for DNA extraction and purification, constructing of protocol for RAPD, analyzing the genetic of 10 wild Dendrobium species by RAPD and constructing the dendrogram by NTSYSpc 2.1 software, Winboot program are the objective of the study. Methods - To identify 10 wild Dendrobium species with genotype. - Extraction of total DNA from fresh tissue of 10 wild Dendrobium species. - Six random primer: OPAC10, OPAH13, OPB01, OPB08, S1384, U693 were used to analysis of genetic diversity. - Following RAPD reactions, dendrogram were constructed by NTSYSpc 2.1 and Winboot program. Conclusion Six decamers are enough to compare the identity of all samples. We could use those primers to establish the methodology to perform genetic comparisons in Vietnam. Besides, the genetic diversity among 10 wild Dendrobium species were established to support the breeder overcome difficulties in plant salection. v
MỤC LỤC CHƢƠNG Trang ̀ ̉ LƠI CAM TẠ .................................................................................................. iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN ............................................................................... iv SUMMARY ..................................................................................................... v MỤC LỤC ....................................................................................................... vi DANH SACH CHƢ̃ VIẾT TĂT ..................................................................... ix ́ ́ ́ ́ ̉ DANH SACH CAC BANG ............................................................................ x DANH SACH CAC BIỂU ĐÔ ........................................................................ x ́ ́ ̀ ́ ́ DANH SACH CAC HÌNH .............................................................................. xi ̉ ̀ 1. MƠ ĐÂU ..................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 2 1.2. Mục tiêu – nô ̣i dung – yêu cầ u đề tài ........................................................ 2 ̉ ̀ 2. TÔNG QUAN TAI LIÊ ̣U ............................................................................ 3 2.1.Giới thiệu tổng quan về giống lan rừng Dendrobium................................ 3 2.1.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................. 3 2.1.2. Các nhóm lan Dendrobium .................................................................... 5 2.1.3. Đặc điểm của 10 giống lan nghiên cứu trong đề tài .............................. 6 2.2. Quy trình li trích DNA ở tế bào thực vật .................................................. 8 2.3. Giới thiệu về kỹ thuật PCR ....................................................................... 11 2.3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR ................................................................ 11 2.3.2. Thành phần thực hiện một phản ứng PCR ............................................ 14 2.3.2.1. Mẫu ..................................................................................................... 14 2.3.2.2. Primer ................................................................................................. 14 2.3.2.3. dNTP ................................................................................................... 16 2.3.2.4. MgCl2 ................................................................................................. 17 2.3.2.5. Taq ...................................................................................................... 17 vi
2.3.5.6. Buffer .................................................................................................. 17 2.4. Đa dạng di truyền – một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền ........................................................................................................... 18 2.4.1. Đa dạng di truyền .................................................................................. 18 2.4.2. Một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền .............................. 18 2.4.2.1. Phƣơng pháp chỉ thị hình thái ............................................................. 18 2.4.2.2. Phƣơng pháp chỉ thị isozyme ............................................................. 19 2.4.2.3. Phƣơng pháp dùng chỉ thị phân tử ...................................................... 19 2.5. Đánh giá sƣ̣ đa da ̣ng di truyề n bằ ng phầ n mề m NTSYSpc và Winboot .. 26 2.5.1. NTSYSpc version 2.1 ............................................................................ 26 2.5.2. Winboot ................................................................................................. 28 2.6. Các công trình nghiên cứu có liên quan ................................................... 29 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .......................................................... 29 2.6.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc .......................................................... 31 3. VẬT LIÊ ̣U VA PHƢƠNG PHAP TIẾN HANH ........................................ 32 ̀ ́ ̀ 3.1. Nội dung, thời gian và địa điểm ............................................................... 32 3.1.1. Nội dung ................................................................................................ 32 3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ......................................................... 32 3.2. Vật liệu...................................................................................................... 32 3.2.1. Các giống lan Dendrobium thí nghiệm ................................................. 32 3.2.2. Thiết bị - dụng cụ................................................................................... 34 3.2.3 Hóa chất thí nghiệm ................................................................................ 34 3.3. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu .................................................... 36 3.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................ 36 3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 36 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ......................................................................... 45 4.1. Điề u tra và thu thâ ̣p các giố ng lan rƣ̀ng Dendrobium tƣ̀ Thành phố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên dƣ̣a trên đă ̣c điể m hinh thái .................. 45 ̀ vii
4.2. Tố i ƣu phƣơng pháp ly trích DNA tổ ng số tƣ̀ mẫu lá tƣơi cho đô ̣ tinh sa ̣ch và ổ n đinh cao ............................................................................. 48 ̣ 4.3. Xây dƣ̣ng quy trình PCR dƣ̣a trên kỹ thuâ ̣t RAPD cho tính đa hình cao ....................................................................................................... 53 4.4. Phân tich sƣ̣ đa da ̣ng di truyề n của 10 giố ng lan rƣ̀ng Dendrobium ́ dựa trên 30 primer RAPD ................................................................................ 54 4.5. Phân tich sƣ̣ đa da ̣ng di truyề n của 10 giố ng lan rƣ̀ng Dendrobium ́ bằng phầ n mề m NTSYSpc version 2.1 và Winboot........................................ 60 5. KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 69 5.1. Kế t luâ ̣n ..................................................................................................... 69 5.2. Đề nghi...................................................................................................... 70 ̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 71 PHỤ LỤC viii
́ ́ ́ ́ DANH SACH CAC CHƢ̃ VIÊT TĂT µg: microgram µl: microlite µM: micromol/lite AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism bp: base pair CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate EB: extraction buffer EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid mM: milimolar (milimol/lite) NCT: Nam Cát Tiên OD: Optical density PCR: Polymerase Chain Reaction pmol: Picomol RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism RNA: Ribonucleic acid Rnase: Ribonuclease SSR: Simple Sequence Repeat Ta : Annealing tenperature (nhiệt độ bắt cặp) TAE: Tris – Acetate – EDTA TE: Tris – EDTA Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy) TP. HCM: Thành phố Hồ Chí Minh U: Đơn vị hoạt tính UPGMA: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic VNTR: variable number tandem repeat ix
́ ́ ̉ DANH SACH CAC BANG BẢNG Trang Bảng 2.1. Nồng độ agarose và kích thƣớc đoạn cần phân tách. ...................... 11 Bảng 3.1. Primer .............................................................................................. 34 Bảng 3.2. Các giống lan thu thập từ Tp. Hố Chí Minh và rừng Nam Cát Tiên ..................................................................................... 37 Bảng 3.4. Điểm khác nhau giữa 3 quy trình li trích. ....................................... 40 Bảng 3.5. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR. ................................ 42 Bảng 3.6. Quy trình PCR. ................................................................................ 42 Bảng 4.1. So sánh các đă ̣c trƣng về lá của các giố ng lan rƣ̀ng Dendrobium .. 46 Bảng 4.2. So sánh các đă ̣c trƣng về thân của các giố ng lan rƣ̀ng Dendrobium ..................................................................................................... 47 Bảng 4.3. Tỉ lệ DNA tổng số tinh sạch trong 3 quy trình li trich khảo sát ...... 50 ́ Bảng 4.4. Nồ ng đô ̣ DNA (ng/µl) tổng số theo 3 quy trình .............................. 51 Bảng 4.5. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR ................................. 53 Bảng 4.6. Quy trình PCR ................................................................................. 53 Bảng 4.7. Số band khuếch đại và band đa hình trên một số primer. ............... 55 Bảng 4.8. Hệ số đồng dạng của 10 giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên ........................................ 62 ́ ́ ̉ DANH SACH CAC BIÊU ĐỒ BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1. Tỉ lệ DNA mẫu tổng số tinh sạch li trích theo 3 quy trình khảo sát. ........................................................................................ 50 Biểu đồ 4.2. Biểu đồ thể hiện tính ổn định của 3 quy trình khảo sát. ............. 51 x
́ ́ DANH SACH CAC HÌNH HÌNH Trang Hình 2.1. Các giống lan rừng Dendrobium ..................................................... 5 Hình 2.2. Nguyên lí của phản ứng PCR .......................................................... 13 Hình 2.3. Nguyên lí của phản ứng RFLP. ....................................................... 21 Hình 2.4. Nguyên lí của phản ứng AFLP. ....................................................... 23 Hình 2.5. Nguyên lí của phản ứng RAPD ....................................................... 25 Hình 2.6. Nguyên lí của phản ứng microsatellite... ......................................... 26 Hình 2.7. Giao diê ̣n NTSYSpc 2.10m ............................................................. 27 Hình 2.8. Giao diê ̣n chƣơng trinh Winboot ..................................................... 29 ̀ Hình 3.1. Các giống lan Dendrobium nghiên cứu trong đề tài........................ 33 Hình 4.1. So sánh các đă ̣c trƣng về lá của các giố ng lan rƣ̀ng Dendrobium ... 45 Hình 4.2. DNA li trích theo quy trình 1........................................................... 49 Hình 4.3. DNA li trích theo qui trình 2 ........................................................... 49 Hình 4.4. DNA li trích theo quy trình 3........................................................... 50 Hình 4.5. Ảnh điê ̣n di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 54 Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 55 Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 56 Hình 4.8. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAH13 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 56 Hình 4.9. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAH13 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 57 Hình 4.10. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB01 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 57 Hình 4.11. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB01 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................ 58 xi
Hình 4.12. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB08 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 58 Hình 4.13. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB08 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 59 Hình 4.14. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer S1384 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 59 Hình 4.15. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer S1384 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 60 Hình 4.16. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer U693 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 60 Hình 4.17. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer U693 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 61 Hình 4.18. Sơ đồ phân nhóm di truyề n dựa trên kết quả RAPD đối với nhóm lan rừng Dendrobium thu thập từ Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên .......................................................................................................... 63 Hình 4.19. Sơ đồ PCA dƣ̣a trên đă ̣c điể m hình thái của các giống lan rừng Dendrobium khảo sát. ............................................................................. 64 Hình 4.20. Sơ đồ 3D PCA dƣ̣a trên đă ̣c điể m hinh thái của các giống lan ̀ rừng Dendrobium khảo sát. ............................................................................. 65 xii
1 Chƣơng 1 MƠ ĐẦU ̉ 1.1. Đặt vấn đề Hoa lan là một trong những sản phẩm đặc thù của ngành nông nghiệp đô thị, không những góp phần tích cực vào việc nâng cao hiệu quả sử dụng lao động, đất, nƣớc và các nguồn lực khác, mà còn làm cho chất lƣợng môi trƣờng sống ngày càng mỹ quan hơn. Vì vậy phát triển hoa lan là một xu thế trong sản xuất nông nghiệp ở các đô thị hiện nay và ngay cả trong tƣơng lai. Với khí hâ ̣u nhiệt đới, Việt Nam nói chung và Thành phố Hồ Chí Minh, Nam Cát Tiên nói riêng có nhiều điều kiện tự nhiên thích hợp với việc phát triển nhiều loại phong lan, địa lan, đă ̣c biê ̣t là giố ng Dendrobium. Lan Dendrobium không nhƣ̃ng đe ̣p mà còn có giá tri ̣cao về mă ̣t kinh tế . Bên ca ̣nh việc nhập nội, lai tạo, nhân giống các giố ng mới, chúng ta còn sở hữu nhiều nguồn gen quý hiếm, độc đáo, mới lạ của giố ng lan rƣ̀ng Dendrobium. Do hiê ̣n nay , các giống lan rừng vẫn chƣa đƣợc quan tâm nhiều trong xã hội , nên tiề m năng phát tri ển của giố ng lan rƣ̀ng Dendrobium vẫn chƣa đƣơ ̣c khai thác triê ̣t để . Vì vậy , trƣớc hết chúng ta cần phải tiến hành khảo sát tính đa dạng di truyền các giống lan rƣ̀ng Dendrobium giƣ̃a các địa phƣơng, trên cơ sở đó thực hiện có hiệu quả việc nhân và tạo giống mới, đồng thời xây dựng các định hƣớng về kiểm tra, quản lý và bảo vệ nguồn gen giống lan Dendrobium trong nƣớc. Để nghiên cứu đa dạng di truyền, trên thế giới hiê ̣n có nhiều phƣơng pháp khác nhau: phƣơng pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chỉ thị phân tử (RFLP, AFLP, RAPD, SSR). Tùy vào đối tƣợng, điều kiện và mục đích nghiên cứu mà ngƣời ta lựa chọn phƣơng pháp phù hợp nhất. Trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính đa dạng về di truyền của giố ng lan rƣ̀ng Dendrobium bằng kỹ thuật RAPD vì đây là kỹ thuật đơn giản, cho kết quả nhanh, và đặc biệt là không cần phải biết trƣớc trình tự bộ gen của đối tƣợng.
2 Trên cở sở đó , chúng tôi đã tiế n hành nghiên cƣ́u và thƣ̣c hiê ̣n đề tài : “Đánh giá đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium thu thập ta ̣i Thành ph ố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên bằ ng kỹ thuâ ̣t RAPD”. Kế t quả của đề tài này tạo cơ sở cho việc xây dựng thƣơng hiệu cho cây lan Việt Nam nói chung và cây lan Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng. 1.2. Mục tiêu – nô ̣i dung – yêu cầu đề tài Mục tiêu Xây dựng phƣơng pháp nghiên cứu tối ƣu nhằm phân tích sự đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium, thu thập tƣ̀ Thành phố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên. Nô ̣i dung - Điề u tra và thu thâ ̣p các giố ng lan rƣ̀ng Dendrobium tƣ̀ Thành phố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên dƣ̣a trên đă ̣c điể m hinh thái . ̀ - Tố i ƣu phƣơng pháp ly trích DNA tổ ng số tƣ̀ mẫu lá tƣơi cho đô ̣ tinh sa ̣ch và ổn định cao. - Xây dƣ̣ng quy trình PCR dƣ̣a trên kỹ thuâ ̣t RAPD cho t ính đa hình cao. - Phân tich sƣ̣ đa da ̣ng di truyề n của các giố ng lan rƣ̀ng ́ Dendrobium dƣ̣a trên primer RAPD. - Phân tích sƣ̣ đa da ̣ng di truyề n của các giố ng lan khảo sát bằ ng phầ n mề m NTSYSpc version 2.1 và Winboot. Yêu cầu - Đinh danh chinh xác các giố ng lan dƣ̣a trên đă ̣c điể m hinh thái . ̣ ́ ̀ - Li trích DNA tổ ng số từ mẫu lá với độ tinh sa ̣ch cao. - Xây dựng đƣợc qui trình PCR – RAPD ổn định, cho tính đa hình cao. - Đánh giá sự khác biệt di truyền giữa các giống lan rừng Dendrobium qua việc phân tích RAPD với primer ngẫu nhiên. - Mô tả quan hệ di truyền của các giống lan rừng Dendrobium bằng phần mềm NTSYS và Winboot.
3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu tổng quan về giống lan rừng Dendrobium Dendrobium thuộc tông Epidendreae, họ phụ Epidendroideae, phân họ Orchidaceae. Lan Dendrobium có màu sắc phong phú, không thua kém bất cứ giống lan nào khác từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại Dendrobium có sọc nằm ngang hoặc thẳng đứng, hoặc có đốm to hay nhỏ. Giống Dendrobium có trên 1200 loài và càng ngày càng lai tạo ra rất nhiều giống mới. Loài hoa này có xuất xứ ở châu Á, Philippines, Borneo, Australia, New Guinea và New Zealand. Cây có thể mọc ở nhiều vùng địa lý khác nhau, vừa chịu đƣơ ̣c khí hậu nóng ẩm lại vừa chịu đƣơ ̣c khí hậu khô hạn, ví dụ nhƣ vùng rừng thấp nhiệt đới, đồi núi cao của dãy Himalaya hay kể cả sa mạc khô hạn của Australia. Điều kiện khí hậu lí tƣởng nhất cho việc nuôi trồng loài hoa này là từ 280C- 330C nên rất thích hợp với điều kiện Việt Nam nói chung, Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên nói riêng. Dendrobium không chỉ là loài hoa có giá trị về mặt mỹ thuật mà còn là một cây dƣợc liệu quí của nền y học cổ truyền. 2.1.1. Đặc điểm hình thái Rễ: Ngoài chức năng neo bám và nuôi dƣỡng cho cây, rễ còn có vai trò dự trữ , hô hấp và cả nhiệm vụ quang hợp (photosynthese). Rễ càng phát triển còn có khả năng gạn lọc hấp thu các muối khoáng , các chất dinh dƣỡng , các chất tan trong nƣớc mƣa hay trong sƣơng mai . Trên bề mă ̣t của rễ lan , chất nhung tơ (Vélamen) giữ nhiệm vụ hút nƣớc đƣợc nhiều nhất và nhanh nhất, là màng che nóng hết sức hiệu quả cho bộ rễ. Khi tiếp xúc với vỏ cây (giá thể) chúng tự hình thành một lớp các chất kết dính để cố định cho lan thật vững chắc trên giá thể hay giá đỡ của chúng.
4 Thân: Dendrobium thuộc nhóm đa thân. Thân có nhiều đoạn phình lớn thành củ giả (giả hành). Đó là bộ phận dự trữ nƣớc và các chất dinh dƣỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi sống bám trên cao. Củ giả rất đa dạng: hình cầu hoặc hình thuôn dài xếp sát nhau hay rải rác đều đặn hoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân giả. Cấu tạo củ giả: gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài là lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ, tránh sự mất nƣớc do mặt trời hun nóng. Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó làm nhiệm vụ quang hợp. Lá: Hầu hết các loài phong lan là cây tự dƣỡng, nó phát triển đầy đủ về hệ thống lá. Hình dạng của lá thay đổi rất nhiều, từ loại lá mọng nƣớc đến loại lá phiến mỏng. Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo các gân vòng cung hay chỉ gấp lại theo gân hình chữ V. Màu sắc lá thƣờng xanh bóng, nhƣng có trƣờng hợp 2 mặt lá khác nhau. Thƣờng mặt dƣới có màu xanh đậm hay tía, mặt trên lại khảm nhiều màu sặc sỡ. Hoa: hoa đối xứng qua một mặt phẳng. Bên ngoài có 6 cánh hoa, trong đó 3 cánh ngoài cùng là 3 cánh đài, thƣờng có màu sắc và kích thƣớc giống nhau. Một cánh đài nằm ở phía trên hay phía sau của hoa gọi là cánh đài lý, hai cánh đài nằm ở 2 bên gọi là cánh đài cạnh. Nằm kề bên trong và xen kẽ với 3 cánh đài là 3 cánh hoa, chúng giống nhau về hình dạng, kích thƣớc, màu sắc. Cánh còn lại nằm ở phía trên hay phía dƣới, có hình dạng và màu sắc khác hẳn với các cánh còn lại gọi là cánh môi. Cánh môi quyết định giá trị thẩm mỹ của hoa lan. Ở giữa hoa có một trụ nổi lên, đó là bộ phận sinh dục của cây, giúp cây duy trì nòi giống. Trụ gồm nhị và nhụy. Sau khi thụ phấn, các cánh hoa héo, cuống hoa hình thành quả lan. Quả và hạt: quả lan thuộc quả nang, nở ra theo 3 - 6 đƣờng nứt dọc. Quả có dạng cải dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa. Khi chín, quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Hạt lan rất nhiều, hạt liti. Hạt chỉ cấu tạo bởi một lớp chƣa phân hoá, trên một mạng lƣới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí. Hạt trƣởng thành sau 2 - 18 tháng.
5 2.1.2. Các nhóm lan Dendrobium Hình 2.1. Các giống lan rừng Dendrobium
6 Theo nhà phân loại học Việt Nam Phạm Hoàng Hộ, giống lan Dendrobium đƣợc chia thành 13 nhóm sau: Nhóm Bolbidium Nhóm Callista Nhóm Apoum Nhóm Strongyle Nhóm Gastridium Nhóm Conostalix Nhóm Rhopalanthe Nhóm Formosae Nhóm Pedilonum Nhóm Dendrobium Nhóm Breviflores Nhóm Dischophyllum Nhóm Stachyobium Trong đó, các giống lan nghiên cứu trong đề tài thuộc hai nhóm Callista và Dendrobium. 2.1.3. Đặc điểm của 10 giống lan nghiên cứu trong đề tài D. anosmum (Giả Hạc): Thân thòng dài (đến 1.2m); lá có phiến mỏng (dài 10cm - 18cm); hoa đơn độc trên các đốt già, to, ửng hƣờng với môi có tâm có sọc tía, cánh hoa nhọn (cao 3cm - 4cm), môi có lông nằm, xoan rộng. Cây phân bố rộng khắp từ Bắc vào Nam Trung Bộ (Tây Nguyên) và phân bố từ Srilanca, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Indonesia. D. chrysotoxum (Kim Điệp): Thân hình đùi hay bắp (dài 8cm - 40cm), có nhiều sóng dọc thấp; lá 2 - 8, phiến dài 8cm - 15cm, rộng 2.5cm - 3cm, chót lõm; hoa mọc thành chùm thƣa, xéo rồi thòng, dài 15cm - 20cm, hoa to, vàng ánh với môi có tâm cam, môi tròn, bìa dung, rìa lông mịn. Cây mọc chủ yếu ở Tây Nguyên: Kom Tum, Daklak, Lâm Đồng và phân bố ở Lào, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc.
7 D. densiflorum (Thủy Tiên mỡ gà): Thân cao 20cm - 30cm, có 4 cạnh tròn, từ hẹp đến đáy; lá 3 - 4, thon, dày, dài đến 15cm; hoa mọc thành chùm dày, to, thòng, hoa rộng 5cm, vàng cả, môi có tâm cam, tròn hình quặn, bìa có răng mịn. Cây mọc ở miền Trung (Vinh, Quãng Trị, Kon Tum, Lâm Đồng), nam bộ (Đồng Nai) và phân bố ở Lào, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc. D. farmeri (Thủy Tiên trắng vàng): Giả hành thon, đáy từ từ hẹp, có 4 cạnh tròn, cao 20cm - 40cm, long dài; lá 2 - 4, xoan thon, thon nhọn; hoa thòng, thƣờng mọc trên dã hành không lá, ít hay nhiều hoa, hoa thƣờng trắng với môi có bớt vàng (có thể toàn trắng), môi tròn, bìa có môi nhỏ, không đều. Cây mọc chủ yếu ở Tây Nguyên và các tỉnh phía Nam, còn phân bố ở Lào, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan. D. fimbriatum (Long Nhãn): Thân hình trụ hay đùi, cao đến 1m, lúc khô vàng tƣơi; lá có phiến mỏng, thon, dài 10cm - 13cm, bẹ ngắn; hoa mọc thành chùm, thòng, thƣa, hoa to, vàng nghệ, môi có bớt đỏ đậm, phiến hoa cao 3cm - 4cm, môi xoan rộng, bìa dung và có rìa mịn. Cây mọc nhiều ở Tuyên Quang, Bắc cạn, Ninh Bình, Vinh, Bảo Lộc, Kon Tu và phân bố ở Lào. D. heterocarpum (Nhất Điểm Hoàng): Mọc thành bụi đứng; than hình đùi, dài 20cm - 45cm, có rãnh; lá có phiến tròn, dài, thon, dài 10cm - 13cm, đầu tà, có 2 thùy. Hoa từng cặp, to, màu vàng rơm, môi cam có sọc đỏ hay nâu, phiến hoa dài 3cm, môi hình bánh bò, hay mũi giáo, dài 4cm. Cây mọc ở Đà Lạt (Lâm Đồng), và phân bố ở Lào, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc, Malaysia, Indonesia. D. primulinum (Long Tu): Thân mảnh, đứng hay thòng, hình trụ dài, dài 45cm ; lá có phiến thon, dài 8cm - 10cm, rộng 2cm. Hoa hƣờng, tím tím dợt, rộng 6cm, môi xoan rộng, có 3 thùy, bìa có răng mịn và rìa lông, gần nhƣ trắng, có đốm vàng và tím ở đáy. Cây mọc chủ yếu ở Tây Nguyên và phân bố Mianma, Thái Lan, Trung Quốc. D. lindleyi (Vẩy Rồng): Căn hành bò mang giả hành cao 3cm - 4cm, to 1.5cm, xanh, lúc khô vàng; lá 1, phiến cứng, tròn dài, chùm thòng, dài 20cm - 30cm; hoa vàng dợt, tâm cam, lá đài và cánh hoa dài 1.5cm - 1.7cm, môi tròn, có lông ở đáy và
8 tâm, bìa dúng, chót hơi lõm. Cây mọc từ Bắc vào Nam và phân bố ở Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc. D. thyrsiflorum (Thủy Tiên vàng): Thân hình đùi, có 4 rãnh, dài tới 40cm, lúc khô vàng nâu; lá 2 - 5, phiến dài 10cm, rộng 3cm - 4cm, dày, 5 - 7 gân; hoa thành chùm, dày, thòng, rộng 10cm, phiến hoa trắng hay vàng rất lợt, to 4cm, lá đài giữa cao 15mm, cánh hoa dài 2cm, môi vàng nghệ, có rìa mịn. D. moschatum (Thái Bình): Bụi cao đến 1.5m, thân hình trụ có rãnh, không lá khi phát hoa; lá có phiến tròn, dài, thon, đầu lõm, dài 7cm - 12cm, gân chánh 7 - 9; hoa mọc thành chùm dài 2cm - 30cm, hoa vàng ánh, to 4.5cm, môi có lông dày, hình chén, màu cam sậm, có hai bớt đỏ tròn, bìa rìa mịn. Cây mọc ở Đà Lạt và phân bố ở Lào, Mianma, Hymalaya, Thái Lan, Trung Quốc. 2.2. Quy trình li trích DNA ở tế bào thực vật Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lƣợng lớn nucleic acid tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận đƣợc các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trƣờng khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần đƣợc tách chiết ở nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (Desoxyribonuclease-DNase và Ribonuclease-RNase). Một qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật gồm 3 bƣớc cơ bản: Bƣớc 1: Phá vỡ màng tế bào. Thông thƣờng ngƣời ta nghiền tế bào hoặc mô trong một hỗn hợp dung dịch đệm chiết gồm Tris – HCl 1M (pH 7.5), NaCl 5M, EDTA 0.5M, sodium dodecyl sulfat 10% (SDS). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.