Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn địa lan (Cymbidium) khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:272

Thêm vào BST

Báo xấu

16
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án nhằm đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm địa phương thu thập tại các tỉnh miền núi Đông Bắc Việt Nam phục vụ cho công tác phân loại, bảo tồn và chọn tạo giống.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn địa lan (Cymbidium) khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM PHƯƠNG THU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN ĐỊA LAN (CYMBIDIUM) KHU VỰC MIỀN NÚI ĐÔNG BẮC VIỆT NAM PHỤC VỤ CÔNG TÁC BẢO TỒN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIIỆP HÀ NỘI, 2023
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM PHƯƠNG THU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN ĐỊA LAN (CYMBIDIUM) KHU VỰC MIỀN NÚI ĐÔNG BẮC VIỆT NAM PHỤC VỤ CÔNG TÁC BẢO TỒN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG Chuyên ngành : Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số : 9620111 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Ngô Xuân Bình 2. TS. Trần Ngọc Hùng HÀ NỘI, 2023
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Phạm Phương Thu
ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban Giám đốc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, các thầy cô giáo Ban Thông tin và Đào tạo, cũng như cán bộ của các Ban trong VAAS luôn động viên, tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS.TS. Ngô Xuân Bình và TS.Trần Ngọc Hùng, những người thầy tâm huyết đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hướng cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Thạc sĩ Nguyễn Thị Tình, các bạn bè đồng nghiệp khoa Công Nghệ Sinh Học & Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên và viện Nghiên cứu Rau quả đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi tiến hành nghiên cứu cũng như chia sẻ những kinh nghiệm để hoàn thành bản luận án. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới đồng nghiệp của tôi, các cán bộ đang công tác tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn tới gia đình của tôi là nguồn động viên và truyền nhiệt huyết để tôi hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2023 Nghiên cứu sinh Phạm Phương Thu
iii MỤC LỤC Lời cam đoan ............................................................................................................... i Lời cảm ơn ................................................................................................................. ii Mục lục ...................................................................................................................... iii Danh mục các chữ viết tắt ......................................................................................... vi Danh mục bảng ......................................................................................................... ix Danh mục hình .......................................................................................................... xi MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................1 2. Mục tiêu của luận án ......................................................................................2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .......................................................................2 3.1. Ý nghĩa khoa học ...........................................................................................2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................2 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu..................................................................2 4.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................2 4.2. Phạm vi nghiên cứu........................................................................................3 5. Những đóng góp mới của luận án ..................................................................3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI .........................................................................................................4 1. Giới thiệu chung về hoa lan ...........................................................................4 1.1. Đặc điểm thực vật học, phân loại và phân bố của chi lan kiếm.....................4 1.2. Nguồn gen lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam ........................6 1.3. Giá trị, thực trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen lan kiếm .........................9 2. Tình hình nghiên cứu chi lan kiếm trên thế giới và Việt Nam ....................13 2.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền chi lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam ....13 2.2. Nghiên cứu nhân giống và lai tạo chi lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam .....26 3. Các kết luận qua phân tích tổng quan ..........................................................37 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....39 2.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................39 2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................42
iv 2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................42 2.3.1. Phương đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái ...................................42 2.3.2. Kỹ thuật sinh học phân tử ............................................................................44 2.3.3. Phương pháp lai tạo giống nguồn gen lan kiếm...........................................47 2.3.4. Phương pháp nhân giống in vitro .................................................................48 2.3.5. Phần mềm xử lý số liệu ................................................................................57 2.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu................................................................57 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...........................58 3.1. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị hình thái ...................................................58 3.2. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị phân tử .....................................................68 3.2.1. Kết quả PCR các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu ......................................68 3.2.2. Kết quả giải trình tự vùng lục lạp mẫu giống lan kiếm nghiên cứu.............69 3.2.3. Kết quả nhận biết các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu ...............................70 3.2.4. Kết quả xác định các chỉ thị phân tử đặc trưng để nhận dạng các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu ...........................................................................76 3.2.5. So sánh, phân tích mối tương quan giữa tập đoàn lan kiếm nghiên cứu ở cây đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử ................86 3.2.6. Đề xuất các hướng nghiên cứu, sử dụng nguồn gen lan kiếm hiện có ........94 3.3. Nghiên cứu nhân giống một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng phương pháp nhân giống in vitro .......................................95 3.3.1. Kết quả nhân giống in vitro loài lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense) ...........................................................................95 3.3.2. Kết quả nhân giống in vitro loài địa lan Bạch ngọc (Cymbidium mastersii) ....................................................................................................108 3.4. Nghiên cứu lai, tạo vật liệu khởi đầu từ một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc .............................................................................119
v 3.4.1. Khả năng đậu quả của một số tổ hợp lai lan kiếm có nguồn gốc từ vùng núi Đông Bắc Việt Nam .............................................................................125 3.4.2. Khảo sát và xác định xác định marker nhận dạng con lai F1 ở giai đoạn sớm bằng chỉ thị phân tử SSR ....................................................................130 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................136 Kết luận ...................................................................................................................136 Đề nghị ....................................................................................................................136 Danh mục các công trình khoa học công bố liên quan đến luận án tiến sĩ .............138 Tài liệu tham khảo ...................................................................................................139 Phụ lục ....................................................................................................................154
vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải A Adenine ABI Applied Biosystems Incorporated Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài AFLP đoạn nhân bản) atpβ gene ATP synthase beta - subunit gene BA Benzyladenine Basic Local Alignment Search Tool (Công cụ tìm kiếm sắp gióng BLAST cột từng phần cơ bản) Bp Base pairs (Cặp bazơ) C Cytosine cpDNA Chloroplast DNA (DNA lục lạp); CT Công thức CTAB Cetyltrimethylammonium bromide (Dung dịch đệm) CTTN Công thức thí nghiệm CV Coefficient of Variation (Hệ số biến động) Cym Cymbidium D Dendrobium Đ/c Đối chứng DL Địa lan DNA Deoxyribonucleic acid (Axít Deoxyribonucleic) DNAse Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediamine tetraacetate EtBr Ethidium bromide G Guanin
vii GA3 Gibberellin (Hormone sinh trưởng thực vật) IAA Indole - 3 - acetic acid (Hormone sinh trưởng thực vật) IBA Indole - 3 - butyric acid (Hormone sinh trưởng thực vật) ISSR Inter - Simple Sequence Repeat (Đoạn lặp trình tự đơn) ITS Internal transcribed spacer IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry Ln Likelihood LSD Least Significant Difference Test matK Maturase K (Gen maturase K Molecular Evolution Genetics Analysis (Phân tích di truyền tiến MEGA hóa phân tử) ML Maximum Likelihood mtDNA Mitochondrial DNA National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông NCBI tin Công nghệ sinh học Quốc gia) ndhF NADH dehydrogenase subunit F nDNA Nuclear DNA ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction ( Phản ứng chuỗi Polymerase) PIC Polymorphism Information Content ( Hệ số Thông tin đa hình) PLBs Protocorm like Bodies QTLs Quantitative trait locus Random Amplified Polymorphic DNAs (DNA đa hình nhân ngẫu RAPD nhiên rbcL Ribulose - bisphosphate carboxylase RCB Randomized Completely Block (Khối Ngẫu nhiên đủ) rDNA Ribosomal DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình về chiều dài
viii của các đoạn DNA) RNA Ribonucleic acid RNAse Ribonuclease SCARs Sequence - Characterized Amplified Region Sect Section SSR Simple Sequence Repeats (Trình tự lặp lại đơn giản) T Thymine Taq Thermus aquaticus TBE Tris/Borate/EDTA THT Than hoạt tính Tm Melting Temperature UV Ultraviolet V Voltex α NAA α - Naphthalene acetic acid (Hormone sinh trưởng thực vật) ΣDNA DNA tổng số
ix DANH MỤC BẢNG TT Nội dung bảng Trang 2.1. Các mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam được sử dụng trong nghiên cứu.............................................................................39 2.2. Các cặp mồi được sử dụng trong các phản ứng PCR ..................................41 3.1. Bảng đánh giá một số đặc điểm hình thái theo quy phạm khảo nghiệm DUS cho lan kiếm của UPOV .....................................................................60 3.2. Bảng mã hoá theo ma trận các tính trạng hình thái của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm ..............................................................................................64 3.3. Tỉ lệ phần trăm thành phần nucleotide của 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu và các mẫu tham chiếu ..............................................................70 3.4. Hệ số tương đồng di truyền về trình tự nucleotide giữa 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu .....................................................................................71 3.5. Hệ số tương đồng di truyền về trình tự nucleotide giữa 24 mẫu giống lan kiếm với các mẫu tham chiếu.................................................................72 3.6. Một số vị trí sai khác về trình tự nucleotide của các mẫu giống nghiên cứu và mẫu tham chiếu ................................................................................77 3.7. So sánh phân nhóm dựa vào hình thái và chỉ thị phân tử của 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu ...........................................................................87 3.8. So sánh ảnh hưởng của bốn môi trường nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của hạt lan kiếm Bạch ngọc đuôi công ........................................................96 3.9. So sánh ảnh hưởng của cytokinin (Kinetin, TDZ, BA) đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần) .....................99 3.10. Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần) ..............................................................101 3.11. Ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA, IAA) đến khả năng tái sinh rễ lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần) .....................................................103
x 3.12. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng tái sinh rễ của chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần).............107 3.13. Ảnh hưởng của 3 loại auxin (IBA, NAA, IAA) đến khả năng tái sinh rễ của cây l an kiếm Bạch ngọc......................................................................110 3.14. Ảnh hưởng của NAA kết hợp THT đến khả năng nhân nhanh rễ lan kiếm Bạch ngọc trong điều kiện in vitro (sau 10 tuần) ..............................112 3.15. Ảnh hưởng của nhóm cytokinins (Kinetin; TDZ, BA) đến khả năng tái sinh chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc (sau 8 tuần) ........................................114 3.16. Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng tạo chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc trong điều kiện in vitro (sau 8 tuần) .........................................116 3.17. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng tạo cây con lan kiếm Bạch ngọc từ rễ trong điều kiện in vitro ( sau 8 tuần) ...............................118 3.18. Một số đặc điểm hình thái hoa, lá của các mẫu giống dùng làm bố, mẹ tạo quần thể lai F1 ......................................................................................119 3.19. Tỷ lệ đậu quả của một số tổ hợp lai lan kiếm vùng núi Đông Bắc ............125
xi DANH MỤC HÌNH TT Nội dung hình Trang 3.1. Mặt hoa 24 mẫu giống lan kiếm thu thập tại vùng núi Đông Bắc ...............59 3.2. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 24 mẫu giống lan kiếm dựa trên chỉ thị hình thái ..............................................................................65 3.3. Kết quả PCR 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu với cặp mồi rbcL - F/rbcL - R; M: Marker 100bp ladder ...........................................................69 3.4. Sơ đồ hình cây của 24 mẫu giống lan kiếm và các mẫu giống tham chiếu .......75 3.5. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 1 đến nucleotide số 70 .....................................83 3.6. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 210 đến nucleotide số 280 ...............................83 3.7. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 280 đến nucleotide số 350 ...............................84 3.8. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 350 đến nucleotide số 420 ...............................84 3.9. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 420 đến nucleotide số 490 ...............................85 3.10. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 490 đến nucleotide số 560 ...............................85
xii 3.11. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 560 đến nucleotide số 620 ...............................86 3.12. Hạt lan kiếm Bạch ngọc đuôi công nảy mầm và phát triển trên môi trường MS ....................................................................................................97 3.13. Ảnh hưởng của cytokinin (Kinetin, TDZ, BA) đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần) .........................................98 3.14. Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần) ..............................................................101 3.15. Ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA, IAA) đến khả năng tái sinh rễ lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần) .....................................................104 3.16. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng tái sinh rễ của chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần) ............................107 3.17. Ảnh hưởng của nhóm cytokinins (Kinetin; TDZ, BA) đến khả năng tái sinh chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc (sau 8 tuần) ........................................113 3.18. Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng tạo chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc trong điều kiện in vitro (sau 8 tuần) .........................................117 3.19. Một số hình ảnh kết quả lai tạo nguồn gen lan kiếm vùng núi Đông Bắc Việt Nam (sau 8 tháng thụ phấn) ...............................................................126 3.20. Một số hình ảnh từ khi lai tạo trên cây mẹ ♀ DL19 đến khi thu nhận quả của cặp lai ♀ DL19 (Kiếm lô hội) x ♂ DL21 (Kiếm vàng) ................127 3.21. Một số hình ảnh từ khi lai tạo trên cây mẹ ♀ DL17 đến khi thu nhận quả lai của cặp lai ♀ DL17 (Mạc xuân) x ♂ DL21 (Kiếm lô hội).............127 3.22. Kết quả khảo sát đa hình bố mẹ của cặp lai giữa ♀ DL21 (Kiếm vàng) x ♂ DL15 (Kiếm trắng) với chỉ thị phân tử SSR .......................................131 3.23. Kết quả khảo sát đa hình bố mẹ của cặp lai giữa ♀ DL19 (Kiếm lô hội) x ♂ DL15 (Kiếm vàng) với chỉ thị phân tử SSR .......................................132 3.24. Kết quả khảo sát đa hình bố mẹ của cặp lai giữa ♀ DL17 (Mạc xuân) x ♂ DL21 (Kiếm lô hội) với chỉ thị phân tử SSR .........................................133
xiii 3.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR các cá thể con lai của cặp lai giữa ♀ DL21 (Kiếm vàng) x ♂ DL15 (Kiếm trắng) với chỉ thị CS8 ....................134 3.26. Kết quả điện di sản phẩm PCR các cá thể con lai của cặp lai giữa ♀ DL19 (Kiếm lô hội) x ♂ DL21 (Kiếm vàng) với chỉ thị CS7 ...................134 3.27. Kết quả điện di sản phẩm PCR các cá thể con lai của cặp lai giữa ♀ DL17 (Mạc xuân) x ♂ DL21 (Kiếm lô hội) với chỉ thị CS11 ...................135
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Họ lan (Orchidaceae) là họ thực vật có hoa, thuộc bộ lan (Orchidaceae), lớp thực vật một lá mầm (Monocotydonea). Đây là một trong những họ lớn nhất của thực vật bao gồm 800 chi khác nhau, chúng được phân bố trên toàn thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực [65]. Chi lan kiếm (Cymbidium) phân bố khắp Đông Nam Á. Các loài trong chi lan kiếm có hoa lớn, đẹp, bền, đa số sống phụ trên thân cây khác hoặc trên các hốc đá có mùn nên được gọi là địa lan. Theo các số liệu đã công bố, chi lan kiếm trên thế giới hiện nay có khoảng 120 loài trong đó châu Á có 52 loài, tại Việt Nam có 24 loài [28, 45]. Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm với thảm thực vật phong phú, nơi đây tập trung nhiều loài lan rừng đẹp nhất thế giới, chúng phân bố chủ yếu ở khu vực miền núi phía Bắc, miền Trung và Tây Nguyên. Các loài lan kiếm nước ta rất đa dạng, nhiều loài hiếm và có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên với sự khai thác ồ ạt, nạn phá rừng khiến các loài lan kiếm Việt Nam đang bị đe dọa tiêu diệt và biến mất nhanh chóng khỏi nơi sống tự nhiên của chúng. Có thể thấy, bên cạnh những thuận lợi về điều kiện thiên nhiên, lan kiếm nước ta đang phải đối mặt với sự thiếu hụt nguồn gen do sự khai thác cạn kiệt của người dân địa phương, trong khi đó các nghiên cứu về lan kiếm hầu hết chỉ tập trung vào việc đánh giá, nhân giống một số loài lan nhập nội hoặc một số loài có giá trị kinh tế. Các nghiên cứu một cách có hệ thống về đặc điểm hình thái và mức độ đa dạng di truyền chi lan kiếm ở Việt Nam chưa nhiều, vấn đề nghiên cứu lai tạo với mục tiêu tạo giống hoa lan kiếm mới mang bản quyền Việt Nam còn đang bỏ ngỏ. Chúng ta chưa khai thác được vốn gen quý mà thiên nhiên ban tặng trong khi đó nguồn gen đang có nguy cơ dần biến mất. Vì vậy, việc đánh giá chi tiết các nguồn gen chi lan kiếm, nghiên cứu nhân giống và lai tạo là hết sức cần thiết nhằm khai thác bền vững nguồn gen lan kiếm địa phương trong khu vực.
2 Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã thực hiện luận án: “Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn địa lan (Cymbidium) khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống”. 2. Mục tiêu của luận án Mục tiêu của luận án nhằm đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm địa phương thu thập tại các tỉnh miền núi Đông Bắc Việt Nam phục vụ cho công tác phân loại, bảo tồn và chọn tạo giống. Nhân giống và lai tạo một số nguồn gen lan kiếm địa phương vùng Đông Bắc Việt Nam. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả của luận án cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về quan hệ di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm địa phương, đây là tài liệu tham khảo tốt cho công tác nghiên cứu, bảo tồn và phát triển nguồn gen lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam. Cung cấp thông tin về khả năng đậu quả của một số tổ hợp lai trong chi lan kiếm vùng Đông Bắc Việt Nam, xác định một số marker nhận dạng con lai F1 ở giai đoạn sớm. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Đánh giá khả năng lai tạo một số nguồn gen lan kiếm địa phương vùng Đông Bắc và tạo quần thể lai F1 qua đó cung cấp vật liệu khởi đầu phục vụ công tác chọn tạo giống mới. Nhân giống 02 nguồn gen lan kiếm quý, có giá trị kinh tế bằng phương pháp nuôi cấy in vitro góp phần bảo tồn những nguồn gen quý trước nguy cơ tuyệt chủng. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng nghiên cứu Đa dạng di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm được thu thập từ khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam.
3 4.2. Phạm vi nghiên cứu Luận án tập trung nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm địa phương thu thập tại vùng núi Đông Bắc Việt Nam, nhân giống một số nguồn gen lan kiếm quý phục vụ công tác bảo tồn đồng thời đánh giá khả năng lai tạo của một số tổ hợp lai và đề xuất một số chỉ thị phân tử để nhận diện con lai sớm phục vụ công tác chọn tạo giống. Thời gian triển khai các thí nghiệm và nghiên cứu trong 5 năm. 5. Những đóng góp mới của luận án - Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu về đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử, nhận dạng các mẫu giống lan kiếm của khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam dựa vào trình tự vùng gen rbcL qua đó tạo lập được bộ dữ liệu về đa dạng di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm địa phương thu thập tại vùng núi Đông Bắc Việt Nam, phục vụ cho công tác bảo tồn và khai thác sử dụng nguồn gen lan kiếm. - Nhân giống in vitro 02 nguồn gen lan kiếm Bạch ngọc đuôi công từ hạt và lan kiếm Bạch ngọc từ vật liệu khởi đầu là rễ. - Lai tạo thành công một số nguồn gen lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc, qua đó cung cấp nguồn vật liệu khởi đầu (quần thể cây lai F1) phục vụ công tác chọn tạo giống.
4 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1. Giới thiệu chung về hoa lan Họ lan (Orchidaceae) là họ thực vật có hoa, thuộc bộ lan (Orchidaceae), lớp thực vật một lá mầm (Monocotydonea). Đây là một trong những họ lớn nhất của thực vật bao gồm 800 chi khác nhau, chúng được phân bố trên toàn thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực [65]. Hoa địa lan gồm nhiều chi khác nhau như chi lan kiếm, chi lan hài… Đối tượng của luận án tập trung nghiên cứu chi lan kiếm Chi lan kiếm (Cymbidium) phân bố khắp Đông Nam Á, các loài trong chi lan kiếm có hoa lớn, đẹp, bền, đa số sống phụ trên cây mục khác hoặc trên các hốc đá có mùn nên được gọi là địa lan. Theo các số liệu đã công bố, chi lan kiếm trên thế giới hiện nay có khoảng 120 loài trong đó châu Á có 52 loài, tại Việt Nam có 24 loài [28, 45]. Nghiên cứu mới nhất về lan kiếm cho biết, các loài trong chi lan kiếm có bộ NST 2n = 2x = 40 [40, 136]. 1.1. Đặc điểm thực vật học, phân loại và phân bố của chi lan kiếm Phân loại Chi lan kiếm (Cymbidium) thuộc họ lan (Orchidaceae), bộ măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành thực vật hạt kín (Mongoliophyta). Tại Việt Nam chi lan kiếm có 24 loài [27]. Theo nghiên cứu của giáo sư Trần Duy Quý [18], trong 24 loài lan kiếm tại Việt Nam, có 13 loài bám trên cây, 5 loài mọc trên đất hoặc bám trên đá, 5 loài bám trên cây hoặc hoặc bám trên đá, có 1 loài không có lá chỉ sống trong mùn nhờ một hệ thống rễ rất phát triển [18]. Phân bố Trên thế giới, chi lan kiếm được phân bố rộng khắp từ Triều Tiên, Nhật Bản, Trung Quốc, Himalaya, qua Philippines, Đông Nam châu Á, Tân Ghi Nê đến Australia,… Các loài lan kiếm thuộc chi Cymbidium có hình thái đa dạng, phong phú theo địa hình phân bố. Các báo cáo cho thấy, chi lan kiếm thường được tìm thấy ở độ cao từ 1500 - 2000 m so với mực nước biển [31, 118]. Tại châu Á, chi lan kiếm có
5 khoảng 52 loài phân bố chủ yếu ở khu vực có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới [31]. Trung Quốc là một trong những quốc gia có số lượng các loài lan kiếm phong phú bậc nhất, chúng được phân bố tại các thảm rừng núi chủ yếu là ở 16 tỉnh miền Trung và Nam Trung Quốc, phân thành 49 loài trong đó có 19 loài đặc hữu [140]. Tại Việt nam, các kết quả điều tra cho thấy có 6 vùng phân bố lan kiếm chính bao gồm: (1) phía Tây Bắc Bộ, (2) phía Đông Bắc Bộ và trung tâm Bắc Bộ, (3) Bắc Trung Bộ, (4) khu vực Trung Bộ, (5) Tây Nguyên, (6) Nam Trung Bộ và Nam Bộ [13]. Trong 6 vùng trên, chi lan kiếm được phân bố chủ yếu ở vùng núi Đông Bắc và các tỉnh lân cận như Quảng Ninh, Hưng Yên,… nguyên nhân chủ yếu của sự phân bố này là do điều kiện khí hậu thích hợp cho sự sinh trưởng phát triển của các loài lan kiếm [13]. Đặc điểm thực vật học Lan kiếm là một trong số những loài lan phổ biến và có sức hấp dẫn nhất trong họ lan bởi vẻ đẹp kiều diễm, hương thơm quyến rũ của loài hoa này [75]. Hoa thường nở trong suốt mùa đông [90], một số loài nở vào mùa xuân và mùa thu, đặc biệt loài Cymbidium ensifolium nở vào các tháng 2, 6, 10, 12. Hoa lan kiếm có phổ màu sắc rất rộng bao gồm màu trắng, màu xanh, màu vàng - xanh, màu kem, màu vàng, màu nâu, màu hồng và màu đỏ, đặc biệt một số loài có thể biến đổi màu theo thời gian trong ngày. Hoa lan kiếm bền, đẹp có thể giữ được khoảng 10 tuần nhờ chúng có một lớp sáp bảo vệ trên bề mặt, hoa có mùi thơm [13]. Một số đặc điểm thực vật học của chi lan kiếm: - Thân ngầm (căn hành) nối các củ với nhau, thân ngầm thường ngắn. Các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành, khi tách củ già ra khỏi căn hành cũ chúng có thể phát sinh đoạn căn hành mới. Từ các căn hành mới này sẽ mọc lên những cây con, do đó người ta xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân [18]. - Củ lan (giả hành) thường có hình ô van, hình cầu, hình bầu dục hay hình trứng,… Củ lan có đường kính từ 1 - 10 cm được bao bọc bởi các bẹ lá xếp xít vào nhau [18]. - Rễ lan có cấu tạo rất độc đáo, thuộc loại rễ thịt, dạng thô, mập, màu trắng ngà