Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá đa dạng di truyền một số giống lạc địa phương phục vụ chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:60

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm 2 mục tiêu: Đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn giống lạc thu thập ở một số địa phương Việt Nam; chọn được một số cặp lai ưu tú phục vụ cho việc chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá đa dạng di truyền một số giống lạc địa phương phục vụ chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -------- NGÔ THỊ THÙY LINH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG LẠC ĐỊA PHƯƠNG PHỤC VỤ CHO VIỆC CHỌN TẠO GIỐNG LẠC KHÁNG BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -------- NGÔ THỊ THÙY LINH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG LẠC ĐỊA PHƯƠNG PHỤC VỤ CHO VIỆC CHỌN TẠO GIỐNG LẠC KHÁNG BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ NGÀNH: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Lê Thị Bích Thủy Hà Nội, 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Ngô Thị Thùy Linh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Bích Thủy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đặc biệt đến tập thể cán bộ Phòng Di truyền tế bào thực vật đã giúp đỡ tôi về mặt tinh thần, cũng như tạo mọi điều kiện về vật chất, các phương tiện kỹ thuật cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong ban đào tạo Viện sinh thái Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình đào tạo. Cuối cùng tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian làm luận văn. Tác giả Ngô Thị Thùy Linh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic acid RNA : Axit ribonucleotide AFLP : Amplyfied Fragment Length Polymorphism Bp : Cặp base (base pair) CTAB : Cetyltrimethyl amoniumbromide dNTP : Deoxynucleosid triphosphat EDTA : Ethylene diamin tetra acetate EtBr : Ethidium bromide Kb : Kilo base NST : Nhiễm sắc thể PCR : Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction) QTL : Locut tính trạng số lượng (Quantitative Trait Loci) Rnase : Ribonuclease RFLP : Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism) RAPD : Rvàom Amplyfied Polymorphic DNA SSR : Các trình tự lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeats) Taq Polymerase: Thermus aquaticus Polymerase TBE : Tris base, Boric acid, EDTA. TE : Tris EDTA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách 50 giống lạc nghiên cứu ..................................................... 20 Bảng 3.1. Hệ số PIC và số allen trên các chỉ thị nghiên cứu ............................... 30 Bảng 3.2. Các chỉ thị cho allen đặc trưng ............................................................ 32 Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền giữa các cặp giống lạc ............................ 38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của 25 mẫu lạc ..................................... 29 Hình 3.2. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Ah041 với 30 giống lạc trong tập đoàn ....................................................................................... 32 Hình 3.3. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi EM31 với 30 giống lạc trong tập đoàn ....................................................................................... 33 Hình 3.4. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Ah408 với 30 giống lạc trong tập đoàn ....................................................................................... 34 Hình 3.5. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Seq3F03 với 30 giống lạc trong tập đoàn .................................................................................. 34 Hình 3.6. Biểu đồ quan hệ di truyền giữa 50 giống lạc nghiên cứu .................... 37 Hình 3.7. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi 7G2 với 30 giống lạc trong tập đoàn. ...................................................................................... 39 Hình 3.8. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi 3A8 với 25 giống lạc trong tập đoàn. ...................................................................................... 40 Hình 3.9. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi 14H6 với 25 giống lạc trong tập đoàn ....................................................................................... 40 Hình 3.10. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi 16C6 với 25 giống lạc trong tập đoàn ....................................................................................... 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4 1.1. Tổng quan về cây lạc ................................................................................. 4 1.2. Diện tích trồng lạc trên thế giới và Việt Nam ........................................... 4 1.2.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới ..................................................... 4 1.2.2. Diện tích và năng suất trồng lạc ở Việt Nam ...................................... 5 1.3. Chỉ thị phân tử SSR .................................................................................... 6 1.3.1. Khái niệm............................................................................................. 6 1.3.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong chọn giống cây trồng ................... 6 1.3.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong phân tích đa dạng di truyền các giống lạc ........................................................................................................... 9 1.4. Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ........................................... 10 1.4.1. Lịch sử phát hiện, phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc…………… ............................................................................................... 10 1.4.2. Thành tựu chọn giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn nhờ chỉ thị phân tử ……………………………………………………………………...12 1.5. Vai trò của việc chọn cặp lai trong chọn giống ....................................... 16 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 20 2.1. Vật liệu ....................................................................................................... 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 22 2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ................................................. 22 2.2.2. Phương pháp chạy PCR với các mồi SSR ........................................... 24 2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose .................................................. 24 2.2.4. Phương pháp điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide ............ 25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2.2.5. Phương pháp phân tích số liệu ............................................................. 27 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 29 3.1. Kết quả tách DNA tổng số....................................................................... 29 3.2. Đa dạng di truyền các giống lạc bằng chỉ thị phân tử SSR ..................... 30 3.2.1. Hệ số PIC và số allen trên các chỉ thị nghiên cứu ............................ 30 3.2.2. Các allen hiếm trong tập đoàn giống lạc nghiên cứu ........................ 31 3.2.3. Quan hệ di truyền của các giống lạc nghiên cứu .............................. 35 3.3. Khuyến cáo một số cặp lai....................................................................... 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 43 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ............................................ 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Lạc (Arachis hypogage L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, cây thực phẩm có giá trị kinh tế cao, đã được gieo trồng trên 100 nước trên thế giới. Năm 2009, diện tích lạc thế giới là 23,95 triệu ha, trong đó lớn nhất là Ấn Độ với diện tích 5,47 triệu ha (chiếm 22,83%). Trung Quốc dẫn đầu về sản lượng lạc hàng năm (14,76 triệu tấn/năm), chiếm tới 40,49% tổng sản lượng thế giới. Một số nước như Hoa Kì, Trung Quốc, Achentina,... thuộc nhóm các quốc gia đạt năng suất lạc cao nhất thế giới (38,24 tạ/ha; 33,56 tạ/ha; 23,52 tạ/ha tương ứng) (FAO, 2009) do tập trung đầu tư vào nghiên cứu và áp dụng các tiến bộ kỹ thuật trên cây lạc. Hiện nay diện tích trồng lạc tăng lên tuy nhiên năng suất và sản lượng lạc tăng chưa tương xứng với tiềm năng. Nguyên nhân chủ yếu là hầu hết các địa phương trồng lạc, đặc biệt là vùng đất trồng lạc nhờ nước trời như đất đồi gò, đất cạn và đất bãi ven sông đều bị bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại làm giảm năng suất và sản lượng. Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia Solanacerum Smith gây ra là đối tượng gây hại nặng và chủ yếu trên cây lạc với khoảng 20 % diện tích trồng bị nhiễm bệnh. Bệnh gây hại trên địa bàn các tỉnh có diện tích và sản lượng cao như Bắc Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình,Tây Ninh. Bên cạnh đó bệnh cũng làm suy giảm phẩm cấp, dinh dưỡng và hàm lượng dầu trong hạt lạc để làm chế biến dầu thực vật. Đã có một số nghiên cứu và áp dụng biện pháp canh tác để hạn chế bệnh héo xanh hại lạc nhưng hiệu quả chưa cao. Dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra ở các vùng và gây thiệt hại khá nặng cho người sản xuất. Kinh nghiệm ở các nước trồng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2 lạc trên thế giới cho thấy sử dụng giống kháng bệnh là giải pháp hữu hiệu nhất để hạn chế tác hại của bệnh. Trong thời gian qua Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt nam cũng đã chọn tạo thành công giống lạc kháng bệnh héo xanh MD7 và phát triển ở một số vùng góp phần hạn chế tác hại của bệnh. Tuy nhiên giống này còn một số hạn chế về đặc điểm nông học như vỏ dầy, hàm lượng dầu chưa cao. Cần phải chọn tạo các giống vừa có khả năng kháng bệnh, lại có các đặc tính nông sinh học tốt. Tuy nhiên kết quả chọn giống kháng bệnh theo phương pháp truyền thống còn hạn chế do hiệu quả chuyển các gen kháng bệnh vào con lai bằng phương pháp truyền thống còn khó khăn và thời gian còn dài. Ngày nay việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống kháng bệnh là con đường ngắn nhất và hiệu quả. Chỉ thị phân tử là công cụ mạnh mẽ trong việc đánh giá các biến dị di truyền, giải thích mối quan hệ di truyền trong và giữa các loài, hỗ trợ việc quản lý các nguồn tài nguyên di truyền thực vật (Virk và cs, 2000; Song và cs, 2003; Teixeira da Silva., 2005). Trình tự lặp lại đơn giản (SSR) là công cụ quan trọng để xác định sự biến đổi di truyền nguồn gen (Powell và cs, 1996; Ma và cs, 2011). Nhờ có ưu điểm là đánh giá nhanh chóng, chính xác, cho đa hình cao và ổn định, do đó chỉ thị SSR được sử dụng rộng rãi trong phân tích đa dạng di truyền, lập bản đồ phân tử (Zhang và cs, 2007; Ma và cs, 2011), xây dựng dấu vân tay DNA (Xiao và cs, 2006; Ma và cs, 2011), kiểm tra độ tinh khiết di truyền (Peng và cs, 2003; Ma và cs, 2011), phân tích sự đa dạng các nguồn gen (Zhou và cs, 2003; Jin và cs, 2010; Ma và cs, 2011). Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền một số giống lạc địa phương phục vụ chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
3 khuẩn” nhờ chỉ thị phân tử SSR nhằm chọn lựa cặp lai phục vụ chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn, góp phần hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật cũng như tác hại của bệnh, bảo vệ môi trường và tạo sự đa dạng sinh học đối với cây lạc. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài  Đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn giống lạc thu thập ở một số địa phương Việt Nam.  Chọn được một số cặp lai ưu tú phục vụ cho việc chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. 3. Nội dung nghiên cứu  Tách DNA tổng số của 50 giống lạc nghiên cứu  Phân tích DNA tổng số với các mồi SSR xác định các mồi cho đa hình, số lượng allen của mỗi mồi, hệ số PIC.  Phân nhóm di truyền các giống lạc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây lạc Lạc (danh pháp khoa học: Arachis hypogaea) là một cây thực phẩm họ đậu có nguồn gốc tại Trung và Nam Mỹ ở các nước Bolivia, Brazil và Peru. Nó là loài cây thân thảo, thân cao từ 3 - 50 cm. Lá mọc đối, kép hình lông chim với bốn lá chét, kích thước lá chét dài 1 - 7 cm và rộng 1 - 3 cm. Hoa dạng hoa đậu điển hình màu vàng có điểm gân đỏ, cuống hoa dài 2 - 4 cm. Sau khi thụ phấn, quả phát triển thành một dạng quả đậu dài 3 - 7 cm, chứa 1 - 4 hạt, và quả thường giấu xuống đất để phát triển. Lạc thích hợp với những thành phần cơ giới nhẹ và thoát nước tốt, như đất cát pha, đất thịt nhẹ… và thường được trồng phổ biến ở Trung Quốc, Ấn Độ, Senagal, Nigieria, Myanmar, Sudan, Mỹ, Argentina và Indonesia. Ngoài việc tạo năng suất và hiệu quả kinh tế cao thì cây lạc cũng là một loại cây trồng có khả năng cải tạo đất rất tốt (đó là nhờ sự cộng sinh của nhóm vi khuẩn cộng sinh với lạc ở rễ, chúng có khả năng cố định đạm từ nguồn nitơ từ không khí làm tăng lượng đạm trong đất đồng thời làm tăng độ phì của đất). Cây lạc cũng là một cây phân xanh có thể sử dụng toàn bộ rễ thân lá của cây lạc làm phân bón cho đất được luôn. Ngoài ra cây lạc còn có nhiều ứng dụng trong đời sống (dùng để sản xuất dầu thực vật, thực phẩm…), trong y học (vỏ lạc và lụa lạc được dùng làm thuốc…). 1.2. Diện tích trồng lạc trên thế giới và Việt Nam 1.2.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới Theo số liệu FAOSTAT (2013), diện tích trồng lạc năm 2013 trên thế giới đạt 25,45 triệu ha và có trên 112 nước trồng lạc. Trong đó diện tích trồng lạc ở các nước châu Á chiếm 47,84%, châu Phi 47,83%, châu Mỹ 4,2%, châu Âu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
5 0,45% so với tổng diện tích. Các nước có diện tích lớn gồm 10 nước, trong đó Ấn Độ có diện tích lớn nhất đạt 5.250.000 ha, Trung Quốc đạt 4.680.000 ha, Nigieria đạt 2.360.000 ha. Diện tích trồng lạc trên thế giới trong 3 năm 2011, 2012 và 2013 biến động từ 24,59 triệu ha đến 25,45 triệu ha. Năng suất lạc bình quân của thế giới là 1,640 - 1,777 tấn/ha. Năng suất lạc của các nước chênh lệch khá lớn và không ổn định qua các năm. Sản lượng lạc bình quân của thế giới trong 3 năm đạt từ 40,48 - 45,23 triệu tấn. Các nước có sản lượng đứng đầu là Trung Quốc đạt từ 16,11 - 16,92 triệu tấn, thứ đến là Ấn Độ đạt từ 4,69 - 9,47 triệu tấn, Mỹ đạt từ 1,66 - 3,06 triệu tấn. Theo nhận định của các nhà khoa học, tiềm năng nâng cao năng suất và sản lượng lạc ở các nước còn rất lớn cần phải khai thác. Trong khi các loại cây như lúa mì và lúa nước đã gần đạt tới năng suất trần và có xu hướng giảm dần ở nhiều nước trên thế giới thì năng suất lạc trong sản xuất vẫn còn khác xa so với năng suất tiềm tàng. Thực tế này đã gợi mở khả năng nâng cao năng suất và hiệu quả sản xuất lạc trên cơ sở áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật vào sản xuất để khai thác tiềm năng. Chiến lược này đã được áp dụng thành công ở nhiều nước và đã trở thành bài học kinh nghiệm trong phát triển sản xuất lạc của các nước trên thế giới. 1.2.2. Diện tích và năng suất trồng lạc ở Việt Nam Cây lạc được trồng ở Việt Nam từ lâu đời, và là cây lấy dầu đứng thứ nhất về diện tích, sản lượng và xuất khẩu, hàng năm đóng góp khá lớn vào tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu của nước ta. Giai đoạn từ 2009 - 2013, diện tích lạc trên cả nước biến động trong khoảng 216.215 - 245.000 ha, cao nhất là vào năm 2009 sau đó có xu hướng giảm dần (FAOSTAT ,2013). Tuy nhiên trong giai đoạn này, năng suất tiếp tục Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
6 có xu hướng tăng lên và cao hơn so với năng suất bình quân thế giới 0,5 tấn/ha (năng suất lạc của thế giới năm 2013 đạt 1,777 tấn/ha). 1.3. Chỉ thị phân tử SSR 1.3.1. Khái niệm Simple sequence repeat (SSR) là một chỉ thị phân tử quan trọng trong nghiên cứu đa dạng di truyền. Trong genome của Eukaryota tồn tại rất nhiều các trình tự lặp lại rải rác như satellite, minisatellites, microsatellites. Các đoạn lặp lại đơn giản (SSR) hay còn gọi là vi vệ tinh (microsatellites) là những đoạn DNA ngắn gồm một số cặp nu liên tiếp, mỗi đơn vị có chiều dài từ 4 đến 6 cặp base, số lượng đơn vị lặp lại thay đổi từ 1 đến 40 đơn vị. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng khác nhau. SSR phát triển và được sử dụng rộng rãi do nó có khả năng phát hiện số lượng lớn các đoạn trình tự lặp lại ở tất cả các cơ thể bậc cao, nó có tiềm năng cho đa hình cao hơn và đơn giản hơn so với các chỉ thị phân tử khác. SSR là chỉ thị đồng trội vì vậy nó chứa đựng thông tin cao. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là quá trình thiết kế mồi rất tốn kém do phải thiết kế mồi đặc hiệu cho từng locus SSR khác nhau, có bao nhiêu locus SSR thì cần bấy nhiêu mồi mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài. Việc đọc trình tự SSR cũng gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, chỉ có một số loài được quan tâm như người, lúa, ngô... được thiết kế mồi SSR. 1.3.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong chọn giống cây trồng Phân tích đa dạng di truyền và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài thực vật là những thông tin quan trọng cho chiến lược bảo tồn và phát triển các giống cây trồng (Romero và cs, 2009). Hơn nữa, những thông tin này cũng hữu ích cho việc mô tả nguồn gen và phân loại thực vật. Trong những năm gần Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
7 đây, chỉ thị SSR đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc xác định đa dạng di truyền (sự thay đổi trong trình tự nucleotide, cấu trúc gen, nhiễm sắc thể và toàn bộ hệ genome) và các mối quan hệ phát sinh loài của loài dựa trên trình tự bảo thủ cao của nó. Một ứng dụng khác của chỉ thị SSR là xác định hiệu quả của cặp lai hữu tính, trong đó đặc tính di truyền đồng trội của chỉ thị SSR đóng vai trò quyết định và cho phép xác định mức đóng góp các allen của cá thể bố mẹ cho con lai trong phép lai. Một số loại thực vật có hoa sinh sản lưỡng tính. Trong đó, chỉ những cá thể cái mới có giá trị thương mại nhờ tạo ra các loại trái cây (đu đủ, kiwi, seabuckthorn ...) và các loại hạt (quả hồ trăn, hạt tiêu đen, jojoba vv ...) Tuy nhiên, các loại cây này không có sự khác biệt về mặt hình thái giữa cây đực và cây cái nên không phân biệt được ở giai đoạn cây còn non và chỉ phân biệt được vào thời kỳ ra hoa. Thời gian ra hoa của các loại cây này có thể mất vài tháng đến vài năm. Việc này gây tốn kém và lãng phí rất nhiều. Sử dụng các chỉ thị SSR liên kết với giới tính giúp chọn lọc ngay từ giai đoạn cây non, đem lại lợi ích kinh tế cao hơn. Một số chỉ thị phân tử SSR liên kết với giới tính đã được sử dụng ở một số loài như: gai dầu (Rode và cs, 2005), dâu tây hoang dã (Spigler và cs, 2008), hop (Jakse và cs, 2008), đu đủ Carica (Parasnis và cs, 1999). Chỉ thị phân tử SSR đã chứng minh có hiệu quả trong xác định các vùng gen chịu trách nhiệm cho sự biểu hiện của các tính trạng nông học và quá trình sinh lý quan trọng. Ngoài ra, chúng cũng được sử dụng trong phân tích các locus tính trạng số lượng (quantitative trait loci - QLT), mà qua đó có thể xác định được các gen quy định các tính trạng mong muốn. Một số tính trạng liên quan đến các yếu tố cấu thành năng suất, chất lượng quả, hạt, khả năng kháng sâu bệnh và các điều kiện bất lợi của môi trường (Neeraja và cs, 2007; Romero và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
8 cs, 2009). Tuy nhiên, trái ngược với các chỉ thị phát triển từ phát triển từ thư viện genome, Các chỉ thị EST-SSRs có thể đóng góp trực tiếp allen chọn lọc bởi vì đã biết được chức năng của chúng và chúng có thể liên kết với tính trạng mong muốn (Varshney và cs, 2005). Bản đồ liên kết cũng đề cập đến mối liên kết chặt chẽ giữa chỉ thị phân tử với các tính trạng kiểu hình. Điều này đặc biệt có ích trong quá trình chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử với các tính trạng số lượng trong các chương trình chọn tạo giống (Breseghello và cs, 2006). Đối với cây lạc, SSR là một công cụ về di truyền được ưa thích trong việc lập bản đồ liên kết di truyền, phân tích đa dạng và trong các chương trình chọn giống. Bản đồ liên kết di truyền với các chỉ thị SSR đã được xây dựng cho bộ đôi lặp lại AA trong genome, bộ bốn AABB (Hong và cs, 2010). Gần đây, có nhiều nghiên cứu về cơ sở di truyền có tính chuyên sâu để phát triển chỉ thị SSR cung cấp các công cụ di truyền phục vụ cho nghiên cứu tổng thể giống lạc (Guo và cs, 2009). Trong trường hợp chọn tạo giống lạc ở mức độ phân tử: Dữ liệu cho phân tích phân tử của thực vật thì khá dễ dàng để chọn lọc, nhưng việc quan sát những quần thể có ý nghĩa để giải quyết những vấn đề lai tạo thì thường phức tạp và khó khăn. Nhiều vấn đề đang thu được kết quả tốt nhờ sự phân tích số liệu cho những tính trạng mong muốn. Nhiều nghiên cứu đã công bố về các chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh đốm lá ở lạc gây ra bởi Cercospora arachidicola Hori và đã mô tả những khó khăn trong việc chọn lọc bố mẹ dưới những điều kiện đồng ruộng, nơi chọn lọc có ý nghĩa có thể xảy ra (Staker và cs, 2001). Ngoài ra, gần đây những thông tin thu được về sự liên kết các chỉ thị phân tử với tính trạng kháng bệnh và hình thái ở lạc đã được giới thiệu như bệnh héo xanh vi khuẩn (Jiang và cs, 2007), rỉ sắt (Mace và cs, 2006; Mondal và cs, 2005), bệnh nấm (Chenault và cs, 2008)... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
9 1.3.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong phân tích đa dạng di truyền các giống lạc Để khai thác nguồn tài nguyên di truyền cây lạc có hiệu quả, trước hết phải nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và mối quan hệ di truyền của các dòng giống trong tập đoàn. Trên cơ sở đó có thể xác định được nguồn thực hiện làm bố mẹ phục vụ tốt cho chương trình lai tạo giống. Ngoài việc đánh giá phân loại tập đoàn dựa trên đặc tính hình thái gần đây người ta sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền của tập đoàn lạc và cho kết quả tốt, có nhiều hứa hẹn: SSR, AFLP, đa hình nucleotide đơn (SNP- single nucleotide polymorphisms), nhân bản đa hình vùng quan tâm (TRAP- target region amplification polymorphism), trình tự gen mục tiêu (EST- expressed sequence tags). Sử dụng chỉ thị SSR để phân tích đa dạng ở lạc đã có những nghiên cứu ở Trung Quốc (Tang và cs, 2007), Nhật Bản (Naito và cs, 2008), Krishna và cs, 2004) và một số nơi (Barkley và cs, 2007; Guo và cs, 2009, Luu và cs, 2008, Ferguson và cs, 2004; Fonceska và cs, 2009). Nhìn chung nhiều chỉ thị SSR được phát triển từ các chuỗi EST cho thấy tỷ lệ AG/TC lặp lại chiếm ưu thế (Guo và cs, 2009). Sử dụng nguồn gen của các giống lạc hoang dại là con đường làm tăng đa dạng di truyền của các giống lạc đang trồng. Nghiên cứu của Song (2010) đã tìm được 600 EST chứa ít nhất 1 chỉ thị SSR trong số 12000 EST. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa hình thấp ở các giống lạc trồng và cao ở các giống hoang dại (Song và cs, 2010). Chen (2008) đã tiến hành đánh giá khả năng kháng bệnh đối với 79 dòng của 18 loài Arachis từ năm 2004 đến 2006. Qua đó, chọn lọc được kiểu gen có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
10 tính kháng cao với bệnh héo xanh vi khuẩn. Mối quan hệ và mức độ đa dạng di truyền của 15 kiểu gen kháng bệnh đã được ghi nhận dựa trên các chỉ thị phân tử SSR. Kết quả cho thấy, loài tứ bộ A. monticola có mối quan hệ gần nhất với loài lạc được trồng A. hypogaea so với các loài được nghiên cứu trong này. Loài lưỡng bội A.duranensis và A.chacoense của phân chi Arachis có mối quan hệ rất gần với loài lạc trồng (Chen và cs, 2008). Naito (2008) đã phân tích đa dạng và quan hệ di truyền các giống lạc ở Nhật bằng cách so sánh sự khác nhau của các allen khi sử dung 13 chỉ thị SSR. Qua đó cho thấy hai loài A. lypogaea và A. monticola được phân thành 2 nhóm riêng biệt. 1.4. Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 1.4.1. Lịch sử phát hiện, phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc Năm 1896 nhà bác học người Mỹ E.F. Smith là người đã phát hiện vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra bệnh héo xanh (Hayward, 1990). Bệnh héo xanh vi khuẩn đặc biệt gây hại nặng ở vùng Nhiệt đới, Á nhiệt đới và các vùng có nhiệt độ ấm áp. Phạm vi ký chủ của bệnh rộng, gây hại trên 400 loài cây trồng thuộc 80 họ khác nhau. Vi khuẩn có thể tồn tại lâu trong hạt giống, trong đất và cỏ dại (Seal và Elphinstone, 1994). Chính vì vậy việc phòng trừ bệnh gặp nhiều khó khăn. Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây ra là một trong những yếu tố quan trọng hạn chế năng suất, diện tích và sản lượng lạc trên thế giới. Bệnh có thể làm giảm năng suất lạc từ 30 – 65% (Hayward 1994, CAB 2004). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn