Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự ức chế tăng sinh tế bào và cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư của cao chiết cây sâm đá (Curcuma singularis)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:81

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học "Nghiên cứu sự ức chế tăng sinh tế bào và cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư của cao chiết cây sâm đá (Curcuma singularis)" trình bày các nội dung chính sau: Đánh giá hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào in vitro của cao chiết hay cao phân đoạn từ cây sâm Đá trên một số dòng tế bào ung thư; Đánh giá hoạt tính cảm ứng apoptosis tế bào ung thư in vitro của cao chiết hay cao phân đoạn từ cây sâm Đá.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự ức chế tăng sinh tế bào và cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư của cao chiết cây sâm đá (Curcuma singularis)

ĐẶNG THỊ MINH THƯ BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- SINH HỌC THỰC NGHIỆ M Đặng Thị Minh Thư NGHIÊN CỨU SỰ ỨC CHẾ TĂNG SINH TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG APOPTOSIS TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT CÂY SÂM ĐÁ (CURCUMA SINGULARIS) LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NĂM 2021 Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Đặng Thị Minh Thư NGHIÊN CỨU SỰ ỨC CHẾ TĂNG SINH TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG APOPTOSIS TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT CÂY SÂM ĐÁ (CURCUMA SINGULARIS) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn 1: TS. Đoàn Chính Chung Hướng dẫn 2: PGS. TS. Nguyễn Thị Phương Thảo TP. HỒ CHÍ MINH - 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu sự ức chế tăng sinh tế bào và cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư của cao chiết cây Sâm đá (Curcuma singularis)” là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu dưới sự hướng dẫn nhiệt tình của thầy TS. Đoàn Chính Chung và cô PGS. TS. Nguyễn Thị Phương Thảo. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm. Tp.Hồ Chí Minh, ngày tháng 5 năm 2021 Học viên cao học Đặng Thị Minh Thư
LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Quý Thầy/Cô trong Học viện Khoa học và Công nghệ đã tận tình chỉ dạy và trang bị cho tác giả những kiến thức cần thiết trong suốt thời gian vừa qua để luận văn này hoàn thành một cách tốt nhất có thể. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS. Đoàn Chính Chung và cô PGS. TS. Nguyễn Thị Phương Thảo, người đã hướng dẫn, dẫn dắt trực tiếp và là cố vấn cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học. Thầy cũng là người đã cho tôi rất nhiều bài học về cả chuyên môn và cả cách làm việc thông qua các đề tài dự án của mình, giúp tôi định hướng phát triển trong sự nghiệp. Một lần nữa tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy bằng tất cả lòng chân thành và sự biết ơn của mình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình của tôi đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc học tập của tôi để đạt được thành công như ngày hôm nay. Tôi xin cám ơn tất cả mọi người! Đặng Thị Minh Thư
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại và cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa .................... 17 Bảng 1.2. Ưu nhược điểm của một số mô hình đánh giá khả năng kháng oxy hóa ............................................................................................................................ 21 Bảng 2.1. Các thuốc thử dùng để phân tích sơ bộ thành phần hóa học ............. 28 Bảng 3.1. Khả năng kháng oxy hóa in vitro của chất đối chứng acid ascorbic ở các nồng độ khác nhau .............................................................................................. 35 Bảng 3.2. Khả năng kháng oxy hóa in vitro của các mẫu cao chiết tổng từ củ rễ cây Sâm Đá ở các nồng độ khác nhau ................................................................ 36 Bảng 3.3. Mức độ gây độc 50% quần thể tế bào (IC50) của cao tổng củ rễ cây Sâm Đá trên các dòng tế bào khác nhau sau 48 giờ xử lý .......................................... 40
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mẫu cây Sâm đá (Curcuma singularis) .............................................. 7 Hình 1.2. Các protein và con đường tín hiệu liên quan đến quá trình apoptosis ở tế bào ................................................................................................................. 8 Hình 1.3. Các protein và con đường tín hiệu liên quan quá trình autophagy ở tế bào. ..................................................................................................................... 10 Hình 1.4. Phản ứng trung hoà gốc tự do ............................................................ 18 Hình 1.5. Phản ứng hoá học trong phương pháp sử dụng TBA – đo lượng MDA ............................................................................................................................ 19 Hình 1.6. Phản ứng FRAP ................................................................................. 20 Hình 3.1. Phương trình đường chuẩn axit oleanolic sử dụng định lượng terpenoid tổng trong cao chiết ............................................................................................ 39 Hình 3.2. Ảnh hưởng của cao chiết tổng củ rẽ cây Sâm Đá lên sự tăng sinh của tế bào ung thư vú .................................................................................................... 40 Hình 3.3. Ảnh hưởng của cao chiết tổng củ rẽ cây Sâm Đá lên sự tăng sinh của các dòng tế bào ung thư khác nhau .................................................................... 41 Hình 3.4. Ảnh hưởng của cao chiết lên sự tăng sinh của nguyên bào sợi WS1 và tế bào nội mô HUVEC ....................................................................................... 44 Hình 3.5. Ảnh hưởng của cao chiết củ rẽ cây Sâm Đá lên sự tăng sinh của tế bào ung thư đại trực tràng Caco2 .............................................................................. 45 Hình 3.6. Ảnh hưởng của của cao chiết củ rẽ cây Sâm Đá lên hàm lượng enzyme LDH được giải phóng ra môi trường nuôi cấy từ tế bào ung thư đại trực tràng Caco2 .................................................................................................................. 46
Hình 3.7. Ảnh hưởng của cao chiết củ rẽ cây Sâm Đá lên hình thái của tế bào ung thư đại trực tràng Caco2 ..................................................................................... 47 Hình 3.8. Ảnh hưởng của của cao chiết củ rẽ cây Sâm Đá lên sự hình thành bào lạc của tế bào ung thư đại trực tràng Caco2 ....................................................... 50 Hình 3.9. Ảnh hưởng của cao chiết lên hình thái nhân của tế bào ung thư Caco2 ............................................................................................................................ 51
1 MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục bảng Danh mục hình Mục lục ........................................................................................................... 1 Mở đầu ............................................................................................................ 4 Chương 1. Tổng quan tài liệu ...................................................................... 6 1.1. Tổng quan tài liệu .................................................................................... 6 1.1.1 Ung thư là gì .......................................................................................... 6 1.1.2 Tổng quan về cây Sâm đá ...................................................................... 7 1.1.3 Tổng quan về con đường tín hiệu liên quan tới sự chết của tế bào ....... 8 1.1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của hoạt chất germacrone .......... 11 1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................... 12 1.2.1 Một số nghiên cứu về hỗ trợ điều trị bệnh ung thư bằng dược liệu tự nhiên ............................................................................................................... 12 1.2.2. Một số các nghiên cứu về cây Sâm Đá ................................................. 14 1.2.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của hoạt chất germacrone ......... 15 1.2.4. Chất kháng oxy hóa .............................................................................. 16 1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................ 22 Chương 2. Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu....................................... 25 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu .......................................................... 25 2.1.1. Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 25 2.1.2. Các dòng tế bào sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 25 2.1.3. Các bộ kit sử dụng trong nghiên cứu .................................................... 26
2 2.1.4. Các môi trường và hóa chất dùng trong nghiên cứu ............................ 26 2.1.5. Các thiết bị dụng cụ dùng trong nghiên cứu......................................... 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 26 2.2.1. Phương pháp tách chiết cao ................................................................. 26 2.2.2. Phương pháp phân tích sơ bộ các hợp chất trong cao chiết ................ 27 2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro ...................... 28 2.2.4. Phương pháp giải đông và nuôi cấy tăng sinh tế bào ........................... 30 2.2.5. Phương pháp đánh giá mức độ gây độc hay ức chế tăng sinh tế bào ... 30 2.2.6. Phương pháp xác định hàm lượng enzyme LDH ................................. 31 2.2.7. Phương pháp đánh giá thay đổi hình thái tế bào .................................. 32 2.2.8. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết lên sự ức chế hình thành bào lạc của tế bào (phương pháp colony assay) ............................................. 32 2.2.9. Phương pháp nhuộm nhân bằng thuốc nhuộm DAPI ........................... 33 2.2.10. Phương pháp xác định sự chuyển dịch phân tử PS và apoptosis tế bào ........................................................................................................................ 33 2.2.11. Phân tích thống kê .............................................................................. 34 Chương 3. Kết quả - bàn luận ..................................................................... 35 3.1.Kết quả đánh giá khả năng kháng oxy hoá của các cao chiết củ rễ cây Sâm Đá ................................................................................................................... 35 3.2. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào của cao chiết củ rễ cây Sâm Đá ........................................................................................................................ 38 3.2.1. Khả năng gây độc của cao chiết trên tế bào ung thư ............................ 38 3.2.2. Khả năng gây độc của cao chiết trên tế bào thường ............................. 41 3.3. Ảnh hưởng của cao chiết lên sự tăng sinh của tế bào ung thư đại trực tràng ........................................................................................................................ 42 3.3.1. Ảnh hưởng của cao chiết lên khả năng sống của tế bào ung thư đại trực
3 tràng ................................................................................................................ 42 3.3.2. Ảnh hưởng của cao chiết lên hàm lượng enzyme LDH giải phóng từ tế bào ung thư đại trực tràng............................................................................... 44 3.3.3. Ảnh hưởng của cao chiết lên hình thái của tế bào ung thư đại trực tràng ........................................................................................................................ 46 3.3.4. Ảnh hưởng của cao chiết lên sự hình thành bào lạc của tế bào ung thư đại trực tràng ........................................................................................................ 47 3.4. Ảnh hưởng của cao chiết lên sự cảm ứng apoptosis của tế bào ung thư da ........................................................................................................................ 49 3.4.1. Ảnh hưởng của cao chiết lên hình thái nhân của tế bào ung thư .......... 49 3.4.2. Ảnh hưởng của cao chiết lên tỉ lệ apoptosis của tế bào ung thư .......... 51 Chương 4. Kết luận – kiến nghị .................................................................. 53 4.1. Kết luận ................................................................................................... 53 4.2. Kiến nghị ................................................................................................. 53 Tài liệu tham khảo .......................................................................................... 54 Phụ lục
4 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, tỉ lệ mắc ung thư trên thế giới đang có xu hướng tăng nhanh và đáng báo động. Theo dự đoán của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), đến năm 2020 số người mới mắc ung thư có thể đạt tới 16 triệu người mỗi năm. Tại Việt Nam, mỗi năm có khoảng 150.000 trường hợp mới mắc ung thư và khoảng 75.000 trường hợp tử vong do ung thư Hiện nay, việc điều trị ung thư (đặc biệt là u phủ tạng) chủ yếu dựa trên ba phương pháp cơ bản, gồm phẫu thuật cắt bỏ khối u (có thể kết hợp với hóa trị hoặc xạ trị), xạ trị (sử dụng tia xạ để tiêu diệt khối u) và hóa trị (sử dụng hóa chất gây độc để tiêu diệt tế bào ung thư). Bên cạnh phương pháp hiện đại, phương pháp truyền thống sử dụng các dược liệu tự nhiên (Y học cổ truyền) trong việc điều trị hay hỗ trợ điều trị ung thư cũng là một hướng nghiên cứu thú vị. Phương pháp này giúp nâng cao hiệu quả điều trị ung thư ở hai khía cạnh: tăng cường đáp ứng miễn dịch của cơ thể và ức chế sự phát triển của khối u, giúp tăng khả năng sống sót của bệnh nhân. Sự kết hợp giữa Y học hiện đại và Y học cổ truyền trong điều trị ung thư đã phát huy được thế mạnh của các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu tự nhiên, nâng cao sức đề kháng của cơ thể, hạn chế được tối đa tình trạng tái phát và di căn khối u và các tác dụng không mong muốn của hóa - xạ trị, nên các triệu chứng lâm sàng được cải thiện. Do vậy, một trong những hướng nghiên cứu của Y học cổ truyền là tìm các chất thảo dược nguồn gốc thiên nhiên có tác dụng tăng cường miễn dịch và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Cây Sâm Đá hay còn gọi là cây khỏe (tên địa phương), có tên khoa học là Curcuma singularis, thuộc chi Nghệ (Curcuma), họ Gừng (Zingiberaceae), bộ Gừng (Zingiberales), có các điểm tương đồng với loài Curcuma vitellina và loài Curcuma sahuynhensis. Cây Sâm Đá được phát hiện lần đầu tiên ở Việt Nam và phân bố chủ yếu ở các vùng diện tích nhỏ thuộc huyện Kbang (Gia Lai) và thị trấn Măng Đen, huyện Kplông (Kon Tum). Thân rễ và củ của cây Sâm Đá được ghi nhận có tác dụng bồi bổ sức khỏe, cường gân, bổ cốt, tăng sinh lực, trị phong thấp, bổ thận, hạn chế suy nhược cơ thể và hỗ trợ điều trị một số bệnh. Tuy nhiên, các tác dụng dược lý của cây này chưa được nghiên
5 cứu nhiều. Do vậy, đây là hướng nghiên cứu khá mới và cần thiết ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã có một số kết quả ban đầu cho thấy hiệu quả ức chế tăng sinh tế bào ung thư của cao chiết cây Sâm Đá. Vì vậy, để đánh giá sâu hơn về mặt phân tử, đề tài “Nghiên cứu sự ức chế tăng sinh tế bào và cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư của cao chiết cây Sâm đá (Curcuma singularis)” được đề xuất thực hiện. Kết quả nghiên cứu cũng làm cơ sở nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo khi tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình động vật. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu cũng là cơ sở tham khảo cho các nghiên cứu tương tự khi tiến hành tách chiết, phân lập và đánh giá chức năng của các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư từ nguồn dược liệu tự nhiên. Mục đích của đề tài Nghiên cứu sự ức chế tăng sinh tế bào và cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư của cao chiết cây Sâm đá (Curcuma singularis). Nội dung chi tiết của đề cương luận văn thạc sĩ Nội dung 1: Đánh giá hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào in vitro của cao chiết hay cao phân đoạn từ cây Sâm Đá trên một số dòng tế bào ung thư Nội dung 2: Đánh giá hoạt tính cảm ứng apoptosis tế bào ung thư in vitro của cao chiết hay cao phân đoạn từ cây Sâm Đá.
6 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.1 Ung thư là gì? Theo hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ năm 2015 thì bệnh ung thư có thể xuất hiện ở bất kỳ phần nào trên cơ thể. Nó bắt đầu khi các tế bào phát triển vượt mức kiểm soát và chèn lấn các tế bào bình thường. Điều này làm cho cơ thể khó hoạt động như bình thường. Ung thư có thể được điều trị rất tốt ở nhiều người. Thực tế, hiện tại số người trở lại có cuộc sống bình thường sau khi được điều trị ung thư là nhiều hơn bao giờ hết. Ung thư không chỉ là một bệnh. Có nhiều loại ung thư, chứ nó không chỉ là một bệnh đơn thuần. Ung thư có thể bắt đầu ở phổi, vú, đại tràng, hoặc thậm chí trong máu. Các loại ung thư đều giống nhau ở một số phương diện, nhưng khác nhau ở cách phát triển và lan rộng. Các tế bào trong cơ thể chúng ta đều phải làm những công việc nhất định. Những tế bào bình thường phân chia một cách có trật tự. Chúng chết đi khi bị yếu hoặc bị tổn thương, và các tế bào mới thế chỗ của chúng. Ung thư xảy ra khi các tế bào bắt đầu phát triển vượt mức kiểm soát. Các tế bào ung thư tiếp tục phát triển và tạo ra các tế bào mới. Chúng chèn lấn các tế bào bình thường. Điều này gây ra các vấn đề ở phần cơ thể nơi mà ung thư xuất hiện. Tế bào ung thư cũng có thể lan rộng sang các phần khác của cơ thể. Ví dụ, các tế bào ung thư trong phổi có thể di chuyển đến xương và phát triển ở đó. Khi các tế bào ung thư lan rộng, hiện tượng này được gọi là di căn. Khi ung thư phổi lan đến xương, nó vẫn được gọi là ung thư phổi. Đối với bác sĩ, các tế bào ung thư trong xương nhìn vẫn giống như các tế bào ung thư trong phổi. Ung thư không được gọi là ung thư xương trừ khi nó bắt đầu từ trong xương. Một số loại ung thư phát triển và lan truyền nhanh. Một số loại khác phát triển chậm hơn. Các bệnh ung thư khác nhau cũng đáp ứng với việc điều trị theo những cách khác nhau. Một số loại được điều trị tốt nhất bằng phẫu thuật; những loại khác đáp ứng tốt hơn khi dùng loại thuốc được gọi là hóa trị. Người ta thường sử dụng 2 hay nhiều biện pháp điều trị để có được kết quả tốt nhất.
7 Khi một người nào đó bị ung thư, bác sĩ sẽ cần tìm hiểu xem đó là loại ung thư nào. Những người bị ung thư cần được điều trị bằng phương pháp có hiệu qủa cho loại ung thư của họ. Hầu hết các bệnh ung thư hình thành một cục u được gọi là khối u hoặc bướu. Nhưng không phải tất cả các cục u đều là ung thư. Bác sĩ sẽ lấy ra một phần của khối u và kiểm tra nó để tìm hiểu xem có phải là ung thư không. Những cục u mà không phải là ung thư được gọi là lành tính. Những cục u mà là ung thư được gọi là ác tính. Có một số loại ung thư, như bệnh bạch cầu (ung thư máu), không hình thành các khối u. Ung thư này phát triển trong các tế bào máu hay tế bào khác của cơ thể. 1.1.2 Tổng quan về cây Sâm đá Cây Sâm Đá hay còn gọi là cây khỏe (tên địa phương), có tên khoa học là Curcuma singularis, thuộc chi Nghệ (Curcuma), họ Gừng (Zingiberaceae), bộ Gừng (Zingiberales), có các điểm tương đồng với loài Curcuma vitellina và loài Curcuma sahuynhensis. Cây Sâm Đá được phát hiện lần đầu tiên ở Việt Nam và phân bố chủ yếu ở các vùng diện tích nhỏ thuộc huyện Kbang (Gia Lai) và thị trấn Măng Đen, huyện Kplông (Kon Tum). Thân rễ và củ của cây Sâm Đá được ghi nhận có tác dụng bồi bổ sức khỏe, cường gân, bổ cốt, tăng sinh lực, trị phong thấp, bổ thận, hạn chế suy nhược cơ thể và hỗ trợ điều trị một số bệnh [1]. Tuy nhiên, các tác dụng dược lý của cây này chưa được nghiên cứu nhiều. Hình 1.1. Mẫu cây Sâm đá (Curcuma singularis) [1]
8 1.1.3. Tổng quan về con đường tín hiệu liên quan tới sự chết của tế bào. Apoptosis là một cơ chế nội mô quan trọng đảm bảo sự cân bằng giữa sự tăng sinh và sự chết của tế bào nhằm đảm bảo số lượng tế bào thích hợp trong mỗi cấu trúc mô. Việc hoạt hóa quá trình apoptosis được xem là một trong các cách tiếp cận chính để loại bỏ tế bào ung thư. Apoptosis thường được đặc trưng bởi những thay đổi điển hình về mặt cấu trúc của tế bào, bao gồm sự co lại tế bào, sự cô đặc của chromatin, sự phân mảnh DNA và sự dịch chuyển của phân tử Phosphatidylserine (PS) từ bên trong ra bên ngoài của màng tế bào. Quá trình apoptosis được kích hoạt bởi các kích thích bên trong và bên ngoài, từ đó hình thành hai con đường chính. Thứ nhất là con đường nội bào hay còn gọi là còn đường ti thể. Thứ hai là con đường ngoại bào hay còn gọi là con đường phụ thuộc vào thụ thể trên bề mặt tế bào [2][3]. Hình 1.2. Các protein và con đường tín hiệu liên quan đến quá trình apoptosis ở tế bào
9 Con đường apoptosis ngoại bào liên quan tới tương tác giữa các phân tử trên bề mặt tế bào như Fas hay yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) với các phối tử tương ứng (Fas-L hay TNFR). Sự tương tác này hình thành các tín hiệu gây chết bên ngoài tế bào khởi sự con đường apoptosis ngoại bào thông qua việc hoạt hóa các phân tử Caspase-8 và Caspase-3 thuộc con đường Casapse nội bào [3]. Khác với con đường apoptosis ngoại bào, con đường apoptosis nội bào được kích hoạt bởi các stress ảnh hưởng tới bộ gen như tia UV, hóa trị liệu. Con đường apoptosis nội bào được kiểm soát bởi các protein trong họ protein Bcl-2 [4]. Các protein kháng apoptosis thuộc họ Bcl-2, bao gồm cả Bcl-2 và Bcl-xL, ức chế quá trình apoptosis bằng cách ức chế sự giải phóng các nhân tố cảm ứng apoptosis từ ti thể vào tế bào chất. Ngược lại, các protein cảm ứng apoptosis thuộc họ Bcl-2, như Bax và Bak kích thích sự giải phóng các nhân tố cảm ứng apoptosis thông qua các hoạt động dịch chuyển trên màng của ty thể, hoạt hóa tính thấm màng ngoài ty thể (mitochondrial outer membrane permeabilization-MOMP) [4][2]. Do đó, những thay đổi biểu hiện của các protein thuộc họ Bcl-2 ảnh hưởng trực tiếp tới việc giải phóng các nhân tố cảm ứng apoptosis từ màng ti thể vào tế bào chất. Các nhân tố cảm ứng apoptosis giải phóng từ màng ti thể được chia thành 2 nhóm: nhóm các nhân tố cảm ứng apoptosis phụ thuộc vào Caspase và nhóm các nhân tố cảm ứng apoptosis độc lập với Caspase. Nhóm các nhân tố cảm ứng apoptosis phụ thuộc vào Caspase bao gồm Cytochrome c, Smac/DIABLO ảnh hưởng trực tiếp tới sự hoạt hóa phân tử Caspase-9, Casapse-3 thuộc con đường Caspase nội bào. Nhóm các nhân tố cảm ứng apoptosis độc lập Caspase bao gồm nhân tố cảm ứng apptosis AIF (Apoptosis induce factor) và EndoG [2][5]. AIF và EndoG được giải phóng khỏi màng ti thể vào tế bào chất, sau đó dịch chuyển vào nhân. AIF liên quan đến sự cô đặc phân tử chromatin, sự phân mảnh DNA, sau đó dẫn tới gây chết tế bào độc lập với Caspase. Trong khi đó, EndoG phân cắt chromatin thành các đơn vị nucleosomal trong tế bào trải qua quá trình apoptosis. Sự thoái biến DNA gây ra EndoG xảy ra độc lập với con đường Caspase theo cách tương tự như AIF [2].
10 Hình 1.3. Các protein và con đường tín hiệu liên quan quá trình autophagy ở tế bào. Bên cạnh quá trính apoptosis, một số cơ chế gây chết tế bào cũng được phát hiện gần đây như sự tự thực bào (autophagy) hay sự chết tế bào dạng necrosis theo chương trình (necroptosis). Tự thực bào là một cơ chế dị hóa liên quan đến sự thoái biến những thành phần không cần thiết hoặc các thành phần bị rối loạn chức năng trong tế bào, thông qua hoạt động của lysosome [3]. Sự tự thực bào được hoạt hóa bởi sự thiếu hụt ATP nội bào, được phát hiện thông qua sự hoạt hóa enzyme adenosine monophosphate kinase (AMPK). Sự tự thực bào được đặc trưng bởi sự hình thành màng bao xung quanh các bao quan (acidic vesicular organelles – AVO) tạo thành các túi bao và được vận chuyển đến một cơ quan tiêu hoá lysosome trong tế bào chất. Một số protein tham gia vào quá trình tự thực bào bao gồm: protein Beclin 1-Vps34/ class 3 PI3 kinase có vai trò trong việc khởi động tự thực bào, protein LC3/Atg8 và Atg7 giúp mở rộng kích thước của các thể thực bào (autophagosome) cũng như khuếch đại quá trình tự thực bào, và protein p62 đóng vai trò trung gian nhận biết các thể polyubiquitin (Hình 1.3) [6]. Necroptosis là sự chết tế bào dạng necrosis theo chương trình của tế bào viêm, hay dạng chết necrosis theo chương trình thúc đẩy bởi sự tổn thương tế bào. Sự hình thành thể “necrosome” bởi tương tác thụ
11 thể giữa protein kinase 1 (RIP1) và RIP3 là điểm đăch trưng của necroptosis [7]. Necroptosis hay autophagy đều có thể được cảm ứng bởi sự hoạt hóa thụ thể bề mặt như thụ thể yếu tố hoại tử khối u (TNFR), thụ thể tế bào T (TCR), thụ thể của interferon, thụ thể giống Toll (Toll-like receptors) hoặc tác động nội bào như stress hay các nhân tố kháng ung thư. Sự chết tế bào theo chương trình (Programmed cell death) đều liên quan tới cả 3 quá trình apoptosis, autophagy và necroptosis. Trong một số trường hợp, các tác nhân chỉ hoạt hóa một trong ba quá trình nêu trên. Tuy nhiên, có những trường hợp, hai hoặc cả ba quá trình nêu trên đều được kích hoạt trong tế bào. Các quá trình này được kích hoạt, tồn tại và tương tác qua lại trong tế bào. Tuy nhiên, trong đó sẽ có một quá trình đóng vai trò chính. Yếu tố quyết định tế bào trải qua quá trình nào trong ba quá trình nêu trên kiểm soát bởi một vài yếu tố như mức năng lượng ATP nội bào, mức độ tổn thương tế bào, và sư hiện diện các con đường phân tử chuyên biệt của các chất ức chế (ví dụ: chất ức chế caspase). Sự thiếu hụt ATP có thể hoạt hóa quá trình autophagy là chính. Tuy nhiên, nếu quá trình autophagy thất bại trong việc duy trì mức ATP nội bào, thì quá trình necroptosis sẽ xảy ra. Các tổn thương ở mức độ nhẹ hoặc tín hiệu gây chết tế bào ở mức độ thấp có thể cảm ứng quá trình apoptosis xảy ra. Ngược lại, các tổn thương ở mức độ trầm trọng hay tín hiệu gây chết tế bào ở mức độ cao có thể dẫn tới hoạt hóa quá trình necroptosis. Mặc dù quá trình apoptosis là cơ chế thường xảy ra chủ yếu ở sự chết của tế bào và quá trình necroptosis được xem như là một cơ chế phụ của apoptosis để đảm bảo sự chết của tế bào, quá trình necroptosis vẫn có thể là cơ chế chính trong sự chết của tế bào trong một vài trường hợp liên quan tới bệnh lý 1.1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của hoạt chất germacrone Germacrone (C15H22O), một hợp chất thuộc nhóm sesquiterpenoids, được tìm thấy nhiều ở các loài thuộc chi Nghê (Curcuma) như Nghệ trắng (Curcuma aromatica Salisb.), Nghệ xanh (Curcuma aeruginosa Roxb.). Các nghiên cứu gần đây cho thấy một số dung môi phù hợp cho việc phân tách hay làm giàu Germacrone từ các dược liệu thuộc chi Nghệ như dung môi dầu, dung
12 môi ít phân cực như hexan, ethyl acetate [8][9]. Germacrone sở hữu một số hoạt tính sinh học như kháng u, kháng viêm và bảo vệ thần kinh. 1.2. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC 1.2.1 Một số nghiên cứu về hỗ trợ điều trị bệnh ung thư bằng dược liệu tự nhiên Phương pháp này giúp nâng cao hiệu quả điều trị ung thư ở hai khía cạnh: tăng cường đáp ứng miễn dịch của cơ thể và ức chế sự phát triển của khối u, giúp tăng khả năng sống sót của bệnh nhân [10][11]. Sự kết hợp giữa Y học hiện đại và Y học cổ truyền trong điều trị ung thư đã phát huy được thế mạnh của các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu tự nhiên, nâng cao sức đề kháng của cơ thể, hạn chế được tối đa tình trạng tái phát và di căn khối u và các tác dụng không mong muốn của hóa - xạ trị, nên các triệu chứng lâm sàng được cải thiện. Do vậy, một trong những hướng nghiên cứu của Y học cổ truyền là tìm các chất thảo dược nguồn gốc thiên nhiên có tác dụng tăng cường miễn dịch và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Thực tế, một lượng lớn các hợp chất kháng ung thư được khai thác từ nguồn dược liệu tự nhiên. Theo nghiên cứu trước đây cho thấy khoảng 74% các loại thuốc kháng ung thư được biết đều có nguồn gốc từ dược liệu tự nhiên [10]. Việc nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất có hoạt tính kháng ung thư từ dược liệu tự nhiên góp phần không nhỏ trong việc phòng chống ung thư cũng như phát triển các phương pháp hỗ trợ điều trị ung thư. Ví dụ, EGCG có vai trò ức chế đáng kể tiến trình phát triển ung thư gan trên mô hình chuột thông qua việc điều hòa con đường Wnt [12]. Dịch chiết xuất từ nấm chương chi làm giảm sự xâm lấn của tế bào ung thư gan bằng cách ức chế con đường tín hiệu NF-κB [9]. Curcumin, chất chiết xuất từ nghệ có tác dụng tiêu diệt tế bào ung thư thông qua việc ức chế hoạt tính enzyme MAP kinase, sự biểu hiện một số nhân tố phiên mã như NF-Kβ, STAT và điểu hòa biểu hiện một số gen liên quan tới quá trình apoptosis của tế bào Bcl-2, Caspase [13]. Lycopene, hợp chất carotenoid, có chứa nhiều trong cà chua có tác dụng kháng ung thư thông qua việc ức chế con đường tín hiệu PI3K/AKT và cảm ứng apoptosis trên một số loại ung thư [14]. Việc sử dụng các thực phẩm hằng ngày như nghệ, cà chua,
13 hay trà xanh… cũng là một phương thức phòng chống ung thư khá hiệu quả. Tuy nhiên, việc điều trị ung thư chỉ bằng dược liệu tự nhiên là không hiệu quả. Thực tế, khả năng tiêu diệt hoàn toàn tế bào ung thư của dược liệu tự nhiên hay các bài thuốc Y học cổ truyền (YHCT) là không cao. Do vậy, trong điều trị ung thư thường phối hợp dược liệu hay bài thuốc với các phương pháp khác nhằm nâng cao khả năng miễn dịch, giảm phản ứng phụ của hóa chất, xạ trị lên bệnh nhân [15]. Một số báo cáo lâm sàng đã chỉ ra tác dụng của bài thuốc y học cổ truyền của Nhật Bản là Sho saiko-to (TJ-9) [16][17]. Tuy nhiên, có ít dữ liệu lâm sàng về hiệu quả của TJ-9 trong việc ngăn ngừa ung thư gan ở người được báo cáo. Do đó, cần có thử nghiệm cụ thể hơn nữa để chứng minh rõ tác dụng ức chế sự tăng sinh của tế bào UTG bởi TJ-9 hoặc các thành phần của nó. Các báo cáo lâm sàng khác cho thấy tác dụng của một số bài thuốc cổ truyền trên các bệnh nhân ung thư khác nhau. Bài thuốc “Shentao Ruangan” (Đài Loan) và hợp chất hydroxycamptothecin có thể làm tăng hiệu quả điều trị, tăng chức năng miễn dịch, giảm kích cỡ khối u, giảm tỷ lệ mắc các tác dụng phụ và kéo dài thời gian sống sót bệnh nhân ung thư gan khi kết hợp với phương pháp hóa trị [18]. Bài thuốc “Kiện tỳ hóa ứ” được sử dụng trong hỗ trợ điều trị bệnh nhân ung thư đại tràng. Nghiên cứu so sánh ngẫu nhiên nhóm bệnh nhân ung thư đại tràng đã phẫu thuật được hoá trị liệu kết hợp với bài thuốc với nhóm bệnh nhân hoá trị liệu đơn thuần trong thời gian 3 tháng. Kết quả thử nghiệm cho thấy tỷ lệ tái phát, hiệu quả điều trị ở nhóm hoá trị liệu kết hợp với thuốc này (39,5% và 72,1%) cao hơn so với nhóm hoá trị liệu đơn thuần (33,3% và 19,0%) [19]. Một nghiên cứu khác cho thấy ảnh hưởng của bài thuốc Y học cổ truyền Trung Quốc có hiệu quả đối với các bệnh nhân ung thư gan chưa qua phẫu thuật xâm lấn. Kết quả nghiên cứu cho thấy bài thuốc cải thiện đáng kể nhiều triệu chứng khác nhau của bệnh nhân, kéo dài sự sống cho bệnh nhân điều trị so với nhóm đối chứng [20]. Ngoài ra, một nghiên cứu khác cho thấy bài thuốc Y học cổ truyền cải thiện đáng kể hiệu quả điều trị cho các bênh nhân ung thư gan khi kết hợp với các phương pháp truyền thống gồm xạ trị và hóa trị [21]. Như vậy, các nghiên cứu lâm sàng cho thấy các bài thuốc YHCT, hay các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu tự nhiên có tác dụng nhất định trong việc điều hòa hệ miễn dịch, làm giảm các biến chứng của phương pháp hóa trị hay xạ trị, cải