Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:67

Thêm vào BST

Báo xấu

46
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học "Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis)" trình bày các nội dung chính sau: Sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh cao; Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chủng vi nấm tuyển chọn; Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis)

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Bùi Thị Liên LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: SINH HỌC NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG SINH VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ (Taxus chinensis) Hà Nội – 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Bùi Thị Liên NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG SINH VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ (Taxus chinensis) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 842 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: SINH HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Phí Quyết Tiến Hà Nội – 2021
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis)” là do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Phí Quyết Tiến. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn chính xác, trung thực. Mọi thông tin nội dung tham khảo trong báo cáo đều được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm và nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Bùi Thị Liên
ii LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, trước tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Phí Quyết Tiến – Phó Viện Trưởng Viện Công nghệ sinh học; Giám đốc Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, lên ý tưởng, định hướng nghiên cứu, tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Vũ Thị Hạnh Nguyên, TS. Quách Ngọc Tùng và các cán bộ Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em thực hiện các thí nghiệm trong phạm vi luận án và đồng thời truyền đạt nhiều kinh nghiệm thực tiễn quý giá trong hoạt động nghiên cứu khoa học ở lĩnh vực vi sinh vật học. Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc, các thầy, cô giáo thuộc Khoa Công nghệ sinh học và Phòng Đào tạo, Quản lý Khoa học và Hợp tác quốc tế của Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện, hướng dẫn, truyền đạt cho em nhiều kiến thức trong quá trình học tập tại Học viện. Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã động viên, là hậu phương vững chắc giúp em có động lực học tập. Luận văn được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài: “Nghiên cứu khai thác nấm nội sinh trên cây dược liệu bản địa nhằm thu nhận một số hợp chất (paclitaxel hoặc một số hợp chất khác) có hoạt tính sinh học" cấp bởi Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số TĐCNSH.05/20- 22.
iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ A-549 Ung thư phổi ở người (human lung carcinoma) bapt baccatin III:3-amino-3 phenylpropanoyltransferase BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair CMV Virus cytomegalo dbat taxane 10b-hydroxylase DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic Acid FDA Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Phẩm Mỹ HGT Horizontal gene transfer – Chuyển gen ngang IC50 Nồng độ ức chế 50% ITS Internal transcribed spacer kDa kiloDalton MCF7 Ung thư vú ở người (human breast carcinoma) MIC Minimun inhibitory concentrations – Nồng độ ức chế tối thiểu NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical Density – Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction SRB Sulforhodamine B TCA Trichloracetic acid TLTK Tài liệu tham khảo ts taxadiene synthase VSV Vi sinh vật
iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng vi nấm nội sinh trên thực vật ......................................................................................... 7 Bảng 2.1. Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu........................ 20 Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại các gen dbat, bapt và ts ............................................................................. 24 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại các gen dbat, bapt và ts ............................................................................. 24 Bảng 3.1. Khả năng gây độc tế bào ung thư của 5 chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ Bắc .............................................................................. 30 Bảng 3.2. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF6 với các chủng tham chiếu ...................................................................................... 41 Bảng 3.3. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF25 với các chủng tham chiếu ...................................................................................... 42 Bảng 3.4. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF6 với các chủng tham chiếu ...................................................................................... 43 Bảng 3.5. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF7 với các chủng tham chiếu ...................................................................................... 44
v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Mối quan hệ giữa vi vật nội sinh và cây chủ .................................... 4 Hình 1.2. Một số các chất kháng ung thư từ vi nấm nội sinh ........................... 8 Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất kháng virus từ vi nấm nội sinh .............. 10 Hình 1.4. Cây thông đỏ bắc (Taxus chinensis) ............................................... 12 Hình 1.5. Con đường sinh tổng hợp paclitaxel ............................................... 16 Hình 3.1. Hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC 11778 (A) và MRSE ATCC 35984 (B) của một số chủng vi nấm nội sinh ..................................... 27 Hình 3.2. Tỉ lệ ức chế của các chủng vi nấm nội sinh trên từng cùng VSV kiểm định................................................................................................ 28 Hình 3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ. Ghi chú: 1. E. coli ATCC 11105; 2. C. albicans ATCC 10231; 3. B. cereus ATCC 11778; 4. MRSE ATCC 35984; 5. P. aeruginosa ATCC 9027; 6. MRSA ATCC 33591; 7. E. faecalis ATCC 29212. .................................................................................... 29 Hình 3.4. Hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn ............................................................................................... 32 Hình 3.5. Điên di DNA tổng số của các chủng vi nấm tuyển chọn trên gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn 1 kb (Thermo scientific, Mỹ). ................................................................................................................. 34 Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại các gen tham gia sinh tổng hợp paclitaxel của 4 chủng tuyển chọn trên gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: là đối chứng âm. .................................................................................................. 35 Hình 3.7. Khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox sau 5 ngày và bào tử dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần của chủng TQF6 (a, b, c) và TQF25 (d, e, f) .............................................................................. 38 Hình 3.8. Khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox sau 5 ngày và bào tử dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần của chủng TDF6 (a, b, c) và TDF7 (d, e, f) ................................................................................ 38
vi Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen ITS trên gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: là đối chứng âm ....................................................................................... 39 Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại của các chủng TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 với giá trị Boostrap 1000, sử dụng thuật toán Kimuar 2 với nhóm ngoài là Murco bainieri (NR 103628)............................................ 45
vii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .....................................................................iii DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH......................................................................................... v MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY DƯỢC LIỆU .............................. 3 1.1.1. Giới thiệu về vi nấm nội sinh ...................................................... 3 1.1.2. Sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh 5 1.1.2.1. Hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm ................................... 5 1.1.2.2. Hoạt chất gây độc tế bào ung thư ............................................ 8 1.1.2.3. Hoạt chất kháng virus .............................................................. 9 1.2.1. Cây thông đỏ (Taxus spp.) ......................................................... 11 1.2.3. Các chất kháng sinh và gây độc tế bào ung thư từ vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ ............................................................................ 15 1.2.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong sàng lọc vi nấm nội sinh sinh paclitaxel và dẫn xuất của paclitaxel .................................................... 16 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM VỀ VI NẤM NỘI SINH ............................................................................................................ 17 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 19 2.1. ĐỐI TƯỢNG ....................................................................................... 19 2.1.1. Chủng giống .................................................................................. 19 2.1.2. Hóa chất, thiết bị........................................................................... 19 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 20 2.2.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ....................... 20 2.2.2. Tách chiết các hoạt chất sinh học thô từ vi nấm nội sinh ......... 21
viii 2.2.3. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư ................................ 21 2.2.4. Khảo sát khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng tuyển chọn ............................................................................................... 23 2.2.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp paclitaxel thông qua sàng các gen chỉ thị ................................................................................................ 23 2.2.6. Xác định đặc điểm hình thái và bào tử của các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn ................................................................................. 24 2.2.7. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn bằng giải và phân tích trình tự vùng ITS .............................................................. 25 2.2.8. Xử lý thống kê số liệu ................................................................... 26 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 27 3.1. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ............................................ 27 3.2. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH ......................................................... 29 3.3. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ DỊCH CHIẾT THÔ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ........................................... 31 3.4. SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH PACLITAXEL CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ............................. 33 3.5. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 ....................................... 37 3.5.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và cuống sinh bào tử của các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn ............. 37 3.5.2. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn bằng giải và phân tích trình tự ITS ............................................................................ 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 47 KẾT LUẬN.................................................................................................. 47 KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 48 PHỤ LỤC ....................................................................................................... 56
1 MỞ ĐẦU Trong những thập kỷ qua, cây dược liệu luôn đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ và nâng cao sức khoẻ con người. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vai trò của các hợp chất tách chiết từ cây dược liệu trong phòng và điều trị bệnh truyền nhiễm do vi sinh vật, kích thích hệ thống miễn dịch và ngăn ngừa ung thư. Tuy nhiên, vấn đề kháng thuốc kháng sinh và nạn chặt phá rừng bừa bãi đang là vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khoẻ con người và đa dạng sinh học của quốc gia. Do đó, việc tìm kiếm các hoạt chất mới mà không cần khai thác cây dược liệu đang là hướng đi mới được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm. Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật cư trú bên trong các mô tế bào thực vật mà không cạnh tranh dinh dưỡng hay gây hại tới cây chủ. Trong các nhóm vi sinh vật nội sinh, nấm nội sinh được chú ý hơn cả và đang được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực y-dược học. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học của vi nấm nội sinh như: kháng khuẩn, kháng virus, ức chế tế bào ung thư, trị tiểu đường, chống viêm,.... Nhờ khả năng chuyển gen ngang, nấm nội sinh có thể sinh tổng hợp các hoạt chất như cây chủ. Nhiều chất kháng sinh và kháng tế bào ung thư mới đã được phát hiện gần đây từ nấm nội sinh bao gồm pestacin, paclitaxel, camptothecin, ergoflavin, podophyllotoxin, benzopyran, isopestacin, phloroglucinol, tetrahydroxy-1-methylxanthone, salidroside, borneol, dibenzofurane, methyl peniphenone, lipopeptide, peniphenone,… Gần đây, nấm nội sinh được đánh giá là nguồn nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp dược phẩm. Hiện nay, chỉ có khoảng 0,75–1,5% các loài thực vật được nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh. Vì vậy, tiềm năng khai thác nấm nội sinh nhằm tìm kiếm các hoạt chất mới là rất triển vọng Cây thông đỏ (Taxus chinensis), thuộc họ Thủy tùng (Taxaceae), là cây dược liệu quý được liệt vào sách đỏ của Việt Nam và thế giới. Trong y học dân gian, cây thông đỏ được sử dụng trong điều trị bệnh truyền nhiễm và hiểm nghèo. Đặc biệt, lá và vỏ cây là nguồn nguyên liệu để tách chiết paclitaxel (paclitaxel), loại thuốc điều trị ung thư buồng trứng, vú và phổi được thông qua bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Phẩm Mỹ (FDA) vào năm 1992. Tuy nhiên, sản xuất chất này vẫn là một thách thức trong ngành dược phẩm vì 1 kg vỏ cây chỉ sản xuất được 10 g paclitaxel. Xuất phát từ thực
2 tiễn, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ là nguồn nguyên liệu thay thế để sản xuất paclitaxel và chất kháng sinh mới. Đã có khoảng 60 chủng vi nấm nội sinh được công bố là có khả năng sinh paclitaxel cao. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nhiều báo cáo đề cập đến nấm nội sinh trên cây dược liệu nói chung và cây thông đỏ nói riêng tại Việt Nam, cũng như mối tương quan giữa các nấm này với các sản phẩm chuyển hóa của cây dược liệu. Với tiềm năng và thách thức trên, đề tài “Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis)” được thực hiện nhằm tìm kiếm chủng vi nấm nội sinh có tiềm năng sinh tổng hợp các hoạt chất kháng sinh và kháng tế bào ung thư mới nhằm tạo nguyên liệu mới với giá thành thấp cho ngành dược, ứng dụng trong điều trị lâm sàng và đồng thời bảo tồn loài thông đỏ Taxus chinensis quý hiếm. Mục tiêu của đề tài : Tuyển chọn và đánh giá được tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh và gây độc tế bào ung thư của các chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (T. chinensis). Nội dung nghiên cứu: - Sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh cao. - Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chủng vi nấm tuyển chọn. - Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa từ cao chiết tổng của các chủng vi nấm tuyển chọn - Đánh giá khả năng sinh tổng hợp paclitaxel của các chủng nấm bằng chỉ thị phân tử. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn.
3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY DƯỢC LIỆU 1.1.1. Giới thiệu về vi nấm nội sinh Vi nấm nội sinh là nhóm vi sinh vật sinh trưởng và phát triển trong các mô tế bào thực vật mà không cạnh tranh dinh dưỡng hay gây hại tới cây chủ. Vi nấm nội sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học để bảo vệ và giúp cây chủ chống lại tác nhân gây bệnh đồng thời thúc đẩy sự phát triển của thực vật [1]. Trong 10 năm qua, các nhà khoa học đã công bố khoảng 770 loại vi nấm nội sinh trên thực vật. Trong đó, các chi nấm phổ biến có thể được kể đến như Altenaria, Aspergillus, Colletrotrichum, Guignardia, Nigrospora, Penicillium, Phomopsis, Rhizoctonia và Xylaria [2]. Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về cơ chế nội sinh của vi nấm trên thực vật. Giả thuyết về sự xâm chiếm không triệu chứng khẳng định cơ chế nội sinh là sự cân bằng đối kháng giữa vật chủ và nội sinh vật (Hình 1.1) [3]. Vi sinh vật nội sinh và gây bệnh đều mang các gen độc tính, giúp vi sinh vật xâm nhiễm cây chủ. Nếu độc tính lây nhiễm của vi nấm và khả năng bảo vệ của cây chủ cân bằng, thì quá trình nội sinh sẽ diễn ra theo và không gây tác động xấu tới cây chủ. Ở trạng thái cân bằng này, các yếu tố môi trường đóng vai trò chính. Nếu quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra quá mạnh mẽ ở cây chủ thì nấm sẽ bị tiêu diệt bởi các chất và protein bảo vệ. Ngược lại, hiện tượng cây nhiễm bệnh nấm xảy ra khi cơ chế miễn dịch bảo vệ của cây không đủ để cân bằng hay tiêu diệt độc tính từ vi nấm (Hình 1.1). Hiện tượng này thường bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố chủ quan và khách quan như bản thân cây chủ và môi trường [4]. Tương tác giữa vi nấm và cây chủ có thể không chỉ là trạng thái cân bằng giữa các yếu tố độc tính lây nhiễm và khả năng phòng vệ, mà là tương tác cộng sinh. Vi nấm nội sinh có thể bảo vệ các cây chủ khỏi các tác nhân gây bệnh bằng việc sản sinh các bằng cách bài tiết các chất đặc thù theo thuyết “hiệu ứng khảm”. Theo một giả thuyết khác, vi nấm có thể hỗ trợ và tăng cường khả năng miễn dịch của cây chủ [4]. Howitz và Sinclair đề xuất giả thuyết “xenohormesis” cho rằng ở trạng thái phòng vệ, cây chủ sản sinh các chất có khối lượng phân tử thấp truyền tín hiệu tới cộng đồng vi sinh vật dị dưỡng nội sinh. Nhờ đó, các vi sinh vật nội dinh có thể cảm nhận sự thay
4 đổi trong quá trình trao đổi chất của cây chủ và sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp hữu ích cho cây chủ. Dưới áp lực tiến hoá chọn lọc, nhiều vi sinh vật đã mất các gen mã hoá protein tham gia sinh tổng hợp các chất này. Một số cụm gen không bị ảnh hưởng bởi quá trình thích nghi và tiến hoá vì cần thiết cho tương tác giữa cây chủ và vi sinh vật nội sinh hoặc giữa các vi sinh vật nội sinh với nhau. Ở giả thiết khác, các chất truyền tín hiệu từ thực vật cũng có thể là sản phẩm trao đổi chất của các vi sinh vật nội sinh được kích thích sinh tổng hợp bằng nhiều cơ chế điều hoà khác nhau của cây chủ [5]. Hình 1.1. Mối quan hệ giữa vi vật nội sinh và cây chủ [4] Ước tính đã có khoảng 7% trong số 1,5 triệu loài nấm đã được công bố. Việc ứng dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới trong nghiên cứu về vi sinh vật góp phần củng cố lập luận mới cho rằng: hiện có khoảng 3,5 - 5,1 triệu loài nấm tồn tại trên trái đất [6]. Nhận định này trái ngược với báo cáo trước đó vào năm 2017 của Hawksworth và Lücking cho rằng có khoảng 2,2 đến 3,1 triệu loài nấm [7]. Trong đó, vi nấm nội sinh trên cây dược liệu chiếu 1 phần khá khiêm tốn. Chính vì vậy, vi nấm nội sinh có nhiều tiềm năng khai thác và không chỉ đa dạng loài mà còn đa dạng về khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học.
5 1.1.2. Sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh Vi nấm nội sinh khá đa dạng ở thực vật, đại diện cho nguồn tài nguyên sinh học dồi dào về hợp chất tự nhiên có tiềm năng khai thác trong lĩnh vực dược phẩm và nông nghiệp [8]. Tuy nhiên, vi nấm nội sinh vẫn chưa được khai thác nhiều [9]. Nhiều hợp chất được sản xuất bởi các loại vi nấm này có hoạt tính sinh học cao, thuộc các nhóm như alcaloid, flavonoid, steroid, terpenoid, peptide, polyketone, quinol và phenol. Cho đến năm 2003, khoảng 4.000 chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đã được thu nhận từ vi nấm [10]. Rất nhiều thông tin về đa dạng di truyền, cơ chế tương tác và các chất có hoạt tính sinh học khác nhau từ vi nấm nội sinh đã được nghiên cứu trong ba thập kỷ qua. 1.1.2.1. Hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm Các chất có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh được sinh tổng hợp từ vi nấm nội sinh, hoặc là sản phẩm kết hợp giữa mối quan hệ tương tác giữa nấm và thực vật, giúp cho vi nấm nội sinh thích ứng tốt hơn và bảo vệ cây chủ khỏi những tác nhân gây bệnh. Đối với con người, các hợp chất kháng vi sinh vật không chỉ có thể được sử dụng làm trong lĩnh vực y-dược mà còn được sử dụng trong lĩnh vực nông nghiệp và thực phẩm. Trong những năm gần đây, số lượng các chất có hoạt tính kháng vi sinh vật đã từ vi nấm nội sinh ngày càng nhiều (Bảng 1.1). Chủng vi nấm nội sinh Penicillium cataractum phân lập từ cây bạch quả (Ginkgo biloba) sản xuất penicimenolidyu AB, pasfonin có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trong khoảng 23–361 μM [6]. Nhiều chất kháng khuẩn từ chủng vi nấm nội sinh Armillaria mellea từ cây thiên ma (Gastrodia elata) đã được phân lập, thuộc một số lớp cấu trúc như alkaloid, peptit, steroid, terpenoit, phenol, quinin và flavonoid cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Gram (+), nấm men và nấm sợi. Ba hoạt chất mới gồm phomoenamide, phomonitroester và peacetylphomoxanthone B tách chiết từ dịch lên men nấm nội sinh Phomopsis sp. PSU-D15 có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh mạnh [11]. Đặc biệt, phomoenamide đã thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
6 Hợp chất fusaripeptide A được phát hiện từ chủng Fusarium sp. phân lập từ rễ cây ngựa bạc hà (Mentha longifolia) có khả năng sinh kháng nấm men gây bệnh ngoài da (Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei) và nấm sợi (Aspergillus fumigates) [12]. Nấm nội sinh Phomopsis sp. YM 311483 từ cây Neem Ấn Độ (Azadirachta indica) sinh tổng hợp bốn loại lactone mới, có hoạt tính kháng nấm Aspergillus niger, Botrytis cinere và Fusarium sp. [9]. Chủng Fusarium nội sinh trên cây dương xỉ (Selaginella pollescens) được thu thập trong khu bảo tồn Guanacaste của Costa Rica được chứng minh có khả năng ức chế mạnh C. albicans [13]. Jesterone là hợp chất kháng nấm mới ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp được phân lập từ nấm Pestalotiopsis jester nội sinh trên cây gỗ trai (Fagraea bordenii Wernham) [14]. Chi Epichloë nội sinh trong các loài cỏ khác nhau có khả năng sản sinh nhiều alkaloid gây độc cho một số loài côn trùng gây hại và thậm chí cả động vật có xương sống [15]. Acid nodulisporic được sản xuất bởi nấm nội sinh Nodulisporium sp. cũng được báo cáo tác dụng kiểm soát côn trùng ăn cỏ vì với cơ chế kích hoạt glutamate trong các kênh clo của cơ và tế bào thần kinh côn trùng dẫn đến dòng chảy của các ion clo qua các kênh, dẫn đến tê liệt cơ thể [16]. Epicoccum nigrum cũng được biết đến với khả năng chống lại vi khuẩn và nấm gây bệnh trên thực vật [15]. E. nigrum đã cho thấy hoạt tính ức chế Pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi (Psv) trên nốt sần cây ô liu lên đến 96% [17]. Các E. nigrum phân lập từ mía đã cho thấy khả năng chống lại nấm bệnh Sclerotinia sclerotiorum trên cây hướng dương và chống lại nấm Pythium sp. trên cây bông; kháng lại Phytoplasma và Monilinia sp. trên quả đào và quả xuân đào.
7 Bảng 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng vi nấm nội sinh trên thực vật Chủng vi nấm Hoạt tính kháng VSV Cây chủ Chất kháng sinh TLTK nội sinh gây bệnh S. aureus 1-tetradecene, 8-octadecanone, S. epidermidis Thông đỏ 8-pentadecanone, B. subtilis Fusarium solani [18] (Taxus baccata) Octylcyclohexane, 10- Klebsiella pneumonia nonadecanone E. coli Shigella flexneri E. coli Phomopsis Dây càng cua Oblongolide Y B. subtilis [19] liquidambaris (Cryptolepis buchanani) P. aeruginosa Cây dưa muối p-hydroxybenzaldehyde, Uracil, E. coli Chaetomium sp. [20] (Senecio stapeliiformis) 5 effectively S. aureus S. aureus B. subtilis Penicillium Cây bạch quả Penicimenolidyu A , P. aeruginosa [6] cataractum (Ginkgo biloba) Penicimenolidyu B, Rasfonin K. pneumonia E. coli C. albicans Ngựa bạc hà C. glabrata Fusarium sp. Fusaripeptide A [12] (Mentha longifolia) C. krusei A. fumigates Trúc đào thơm 3-O-methylviridicatin, Penicillium sp. F. graminearum [21] (Nerium indicum) Viridicatol Rhizopycnis Thuốc lá Rhizopycnin D, TMC-264 Magnaporthe oryzae [22] vagum (Nicotiana tabacum) Thạch hộc tía LL-P880γ, LL-P880α, Ergosta- Pestalotiopsis sp. A. fumigatus [23] (Dendrobium officinale) 5,7,22-trien-3β-ol
8 1.1.2.2. Hoạt chất gây độc tế bào ung thư Các sản phẩm trao đổi chất bậc hai thu được từ vi nấm nội sinh đã được chứng minh là nguồn cung cấp các chất gây độc tế bào ung thư mới. Năm 2000, Demain và Vaishnav, ước tính rằng khoảng 57% các hợp chất trong thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư là các sản phẩm tự nhiên và các dẫn xuất từ vi nấm [16]. Theo các nghiên cứu đánh giá, vi nấm nội sinh cung cấp hàng loạt các chất chuyển hóa thứ cấp hoạt tính sinh học có cấu trúc độc đáo, bao gồm: alkaloid, benzopyranones, chinones, flavonoid, acid phenolic, quinon, steroid, terpenoid, tetralon. Các báo cáo cho thấy rằng các hợp chất hoạt tính sinh học tự nhiên được phân lập từ vi nấm nội sinh có thể đóng vai trò là nguồn thay thế cho việc khám phá ra các loại thuốc chống ung thư mới [24]. Ergoflavin Camptothecin P Phaeosphoramide A (R=αC6H11) và B (R=βC6H11) Chaetominine Hình 1.2. Một số các chất kháng ung thư từ vi nấm nội sinh [24, 25] Chất ergoflavin (Hình 1.2) được minh chứng là hoạt chất ức chế tế bào ung thư mới, được phân lập từ nấm nội sinh Claviceps purpurea phát triển trên lá của cây thuốc sến xanh (một loài thuộc họ hồng xiêm). Chủng nấm nội
9 sinh Penicillium brasilianum được tìm thấy ở vỏ rễ cây xoan, thúc đẩy sự sinh tổng hợp các amit phenylpropanoid (nhóm chất phenylpropanoid) hiệu quả trong điều trị ung thư. Chủng nấm Entrophospora infrequens SW116 được phân lập từ cây họ thụ đào (Nothapodytes foetida) - một cây thuốc có nguồn gốc từ Ghats, Ấn Độ, được phát hiện với khả năng sinh camptothecin (Hình 1.2) [25]. Camptothecin là một chất ức chế topoisomerase được biết đến với khả năng điều trị một loạt các ung thư: ung thư dạ dày, ung thư trực tràng, ung thư ruột kết, ung thư bàng quang,… Hoạt tính gây độc tế bào liên quan đến bệnh bạch cầu ở người K562 và dòng tế bào SW1116 ung thư ruột kết được ghi nhận bởi một alkaloid chaetominine (Hình 2) thu được từ chủng vi nấm nội sinh Chaetomium sp. IFB-E015, phân lập trên cây sa sâm (Adenophora axiliflora) [26]. Nấm nội sinh Phaeosphaeri avenari sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học gồm: phaeosphoramides A và B, hiệu quả trong ức chế chất dẫn truyền tín hiệu và chất kích hoạt phiên mã (STAT) -3 của tế ung thư [27]. Chủng vi nấm nội sinh mới Trametes hirsuta đã được phát hiện với khả năng sản xuất podophyllotoxin và các lignans aryl tetralin liên quan khác có đặc tính chống ung thư mạnh [25]. Do như cầu sử dụng paclitaxel trong điều trị ung thư cao nên từ năm 1995, các nghiên cứu ngoài nước đã phân lập được hàng trăm loài nấm nội sinh từ các cây thông đỏ quý hiếm ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Những chủng nấm phổ biến được phân lập từ cây thuộc các chi: Taxomyces sp., Pestolotiopsis sp., Penicillium sp. và Truncatella sp.. Các loại nấm này có khả năng sinh paclitaxel hoặc các dẫn xuất từ paclitaxel thấp nhưng việc áp dụng công nghệ giải trình tự gen và chỉnh sửa hứa hẹn triển vọng khai thác paclitaxel từ vi nấm ở quy mô công nghiệp trong tương lai. Các nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học khác từ vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ vẫn còn bỏ ngỏ. 1.1.2.3. Hoạt chất kháng virus Các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh còn là ứng cử viên tiềm năng trong nghiên cứu và tạo các thuốc kháng virus. Việc khảo sát sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp các chất kháng virus cũng là hướng đi có nhiều hứa hẹn, mặc dù có rất ít nghiên cứu được ghi nhận. Hai
10 hợp chất mới, acid cytonic A và B được phân lập từ Cytonaema spp. có khả năng ức chế virus cytomegalovirus (CMV) ở người [28]. Hợp chất kháng virus hinnuliquinone được sinh tổng hợp bởi vi nấm Nodulisporium hinnuleum cư trú ở lá cây sồi (Quercus coccifera) thể hiện hoạt tính ức chế HIV-1 [29]. Các hoạt chất pullularins AD (cyclo hexadepsi-peptides) được sản xuất bởi Pullularia spp. BCC 8613 được phát hiện có hoạt tính kháng virus herpes simplex (HSV) [29]. Nấm nội sinh Alternaria tenuissima QUE1Se sản sinh ra altertoxins, một hợp chất hiệu quả chống lại virus HIV-1. Một số hợp chất được sản xuất từ Emericella spp. (HK-ZJ), bao gồm emerimidine, dehydroaustin, austinol, bao gồm aspernidine, austin, emeriphenolicins và acetoxy dehydroaustin đã được báo cáo là có hoạt tính kháng virus cúm A (H1N1) [30]. pullularins AD cytonic A Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất kháng virus từ vi nấm nội sinh [29] 1.1.2.4. Các chất có hoạt tính sinh học khác Chất chống oxi hóa (antioxidant) là những chất có thể ngăn ngừa hoặc làm giảm tổn thương cho các tế bào gây ra bởi sự mất cân bằng phản ứng oxy hóa khử (reactive oxygen species). Nếu tế bào không thể trung hòa và loại bỏ