Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Kết hợp hình thái và sinh học phân tử trong nghiên cứu chẩn loại giống rắn cạp Nia Bungarus daudin, 1803 ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:77

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học "Kết hợp hình thái và sinh học phân tử trong nghiên cứu chẩn loại giống rắn cạp Nia Bungarus daudin, 1803 ở Việt Nam" trình bày các nội dung chính sau: Nghiên cứu đa dạng thành loài rắn thuộc giống cạp nia Bungarus ở Việt Nam; Đánh giá tính đa dạng và mối quan hệ di truyền giữa các quần thể và giữa các loài trong giống.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Kết hợp hình thái và sinh học phân tử trong nghiên cứu chẩn loại giống rắn cạp Nia Bungarus daudin, 1803 ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN QUỐC HUY LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC KẾT HỢP HÌNH THÁI VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU CHẨN LOẠI GIỐNG RẮN CẠP NIA BUNGARUS DAUDIN, 1803 Ở VIỆT NAM Hà Nội – 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN QUỐC HUY KẾT HỢP HÌNH THÁI VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU CHẨN LOẠI GIỐNG RẮN CẠP NIA BUNGARUS DAUDIN, 1803 Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : Hướng dẫn 1: PGS. TS. Nguyễn Thiên Tạo Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Vĩnh Thanh Hà Nội - 2021
I LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm. Hà Nôi, ngày tháng năm 2021 Nguyễn Quốc Huy
II LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn đến thầy PGS. TS. Nguyễn Thiên Tạo, TS. Nguyễn Vĩnh Thanh đã hướng dẫn tận tình, chu đáo, giúp đỡ tôi trong quá trình khảo sát thực địa, phân tích số liệu, công bố công trình khoa học và hoàn thiện luận văn. Xin trân trọng cảm ơn GS. TS. Nguyễn Quảng Trường, TS. Phạm Thế Cường, TS. Lương Mai Anh, ThS. Phan Quang Tiến (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật), NCS Ninh Thị Hòa, NCS. Ngô Ngọc Hải (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) cùng các đồng nghiệp đã hỗ trợ trong quá trình khảo sát thực địa, cung cấp hình ảnh, số liệu và hỗ trợ công tác phân tích mẫu trong phòng thí nghiệm của luận văn. Xin trân trọng cảm ơn Cán bộ thuộc phòng Bảo tồn Thiên nhiên – Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam và Ban lãnh đạo Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn phòng Động vật – Viện Sinh thái và Tài Nguyên Sinh vật đã hỗ trợ mẫu vật để tôi có nguồn tư liệu thể hoàn thành luận văn. Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và những người thân đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn Xin trân trọng cảm ơn ban Lãnh đạo, phòng Đào tạo, các phòng chức năng của Học viện Khoa học và Công nghệ để luận văn được hoàn thành. Nghiên cứu này được tài trợ bởi đề tài độc lập cấp quốc gia mã số ĐTĐLCN.38/21. Hà Nôi, ngày tháng năm 2021 Nguyễn Quốc Huy
III MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 2 4. Ý nghĩa khoa học của đề tài .................................................................... 3 5. Những đóng góp mới của đề tài .............................................................. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU.....................................4 1.1. Lịch sử nghiên cứu về bò sát ở Việt Nam ................................................. 4 1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA-barcodes).......................................... 5 1.3. Các nghiên cứu bổ sung dẫn liệu mới về phân loại học ............................ 7 1.4. Tổng quan các nghiên cứu về giống Bungarus .......................................... 8 1.4.1. Trên thế giới .................................................................................... 8 1.4.2. Ở Việt Nam ..................................................................................... 9 1.5. Khái quát về điều kiện tự nhiên ở Việt Nam ........................................... 10 1.5.1. Địa hình ......................................................................................... 10 1.5.2. Khí hậu .......................................................................................... 11 1.5.3. Thủy văn........................................................................................ 11 1.5.4. Thảm thực vật................................................................................ 12 CHƯƠNG 2: THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, PHƯƠNG PHÁP VÀ TƯ LIỆU NGHIÊN CỨU..............................................................................................13 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 13 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 13 2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 16 2.3.1. Phương pháp tiếp cận giải quyết vấn đề nghiên cứu .................... 16 2.3.2. Phương pháp kế thừa..................................................................... 16 2.3.3. Phương pháp khảo sát thực địa thu thập mẫu vật nghiên cứu ...... 16 2.3.5. Phương pháp phân tích hính thái .................................................. 17 2.3.6. Phương pháp phân tích sinh học phân tử ...................................... 19
IV 2.3.7. Xử lý số liệu .................................................................................. 20 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................22 3.1. Thành phần loài của giống Bungarus ở Việt Nam .................................. 22 3.1.1. Danh sách các loài Bungarus ghi nhận ở Việt Nam ..................... 22 3.1.2. Đặc điểm hình thái các loài Bungarus ghi nhận ở Việt Nam ....... 23 3.2. Khóa định loại các loài trong giống Bungarus ở Việt Nam. ................... 41 3.3. Đặc điểm phân tử vùng gen COI của quần thể và các loài Bungarus. .... 41 3.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt Nam .............................................................................................. 41 3.3.2. Nhân bản trình tự ADN đích vùng gen COI mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt Nam. ............................................................................ 46 3.3.3. Xác định trình tự nucleotide vùng gen COI của các loài trong giống Bungarus tại Việt Nam ................................................................. 46 a. Trình tự đoạn gen COI của loài B. candidus ....................................... 46 3.3.4 Mối quan hệ di truyền giữa các loài trong giống Bungarus tại Việt Nam ......................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................55
V DANH MỤC BẢNG Bảng 2.2. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền của giống Bungarus ......................................................................................................... 20 Bảng 3.1. Danh sách các loài Bungarus ghi nhận ở Việt Nam ..................... 233 Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái các loài Bungarus trong nghiên cứu này ...... 399 Bảng 3.3. Độ sạch và hàm lượng ADN của 09 mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt Nam ...................................................................................................... 42 Bảng 3.4. Thông tin các trình tự gen sử dụng trong nghiên cứu .................. 443
VI DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Địa điểm thu thập mẫu vật các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam ....................................................................................................................... 144 Hình 2.2. Vị trí các vảy trên toàn cơ thể của loài rắn cạp nia ...................... 199 Hình 3.1. Rắn cạp nia nam/B. candidus: IEBR/NT.2016.94 ........................ 277 Hình 3.2.Các đặc điểm hình thái của B. multicinctus và loài B. “wanghaotingi” và B. candidus ............................................................................................... 278 Hình 3.3. Bản đồ phân bố loài B. candidus ở Việt Nam............................... 288 Hình 3.4. Rắn cạp nia sông hồng/B. slowinskii: ♂IEBR/K233 .................. 3131 Hình 3.5. Bản đồ phân bố loài B. slowinskii ở Việt Nam ........................... 3232 Hình 3.6. Rắn cạp nong/B. fasciatus: ♂ VMNN. 07958 .............................. 355 Hình 3.7 Bản đồ phân bố loài B. fasciatus ở Việt Nam ................................ 366 Hình 3.8 Bản đồ phân bố loài B. flaviceps ở Việt Nam ................................ 388 Hình 3.9. Kết quả điện di DNA tổng số 09 mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt Nam trên gel agarose 1% (các giếng từ 1-9 là thứ tự các mẫu tương ứng với số thứ tự trong bảng 3.2). .......................................................................... 42 Hình 3.10. Sản phẩm PCR của 09 mẫu mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt Nam phân tích với cặp mồi COI điện di trên gel agarose 1% (M: Marker phân tử 100bp; VQN1-9: ký hiệu mẫu) ................................................................. 466 Hình 3.11. Sơ đồ các peak trong giải trình tự vùng gen COI của loài Rắn cạp nia nam B. candidus ...................................................................................... 477 Hình 3.12. Sơ đồ các peak trong giải trình tự vùng gen COI của loài Rắn cạp nia sông hồng B. slowinskii ........................................................................... 488 Hình 3.13. Cây quan hệ di truyền của các loài thuộc giống Bungarus xây dựng trên mô hình BI ............................................................................................... 52
VII DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Nội dung cs. Cộng sự NCBI National Center for Biotechnology Information OD Mật độ quang học (Optical Density) PCR Polymerase Chain Reaction bp Cặp bazơ (base pair) BLAST Basic Local Alignment Search Tool TAE Tris Acetate EDTA IEBR Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật IUCN Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế KBTTN Khu Bảo tồn thiên nhiên Max Giá trị lớn nhất Min Giá trị nhỏ nhất VQG Vườn Quốc gia VNMN Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam ♂ Con đực ♀ Con cái
1 MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Việt Nam là một trong trong 25 quốc gia có mức độ dạng sinh học cao nhất thế giới (Myers và cs. 2000) [Error! Reference source not found.] trong trong đó có khu hệ bò sát. Số lượng loài tăng nhanh trong thập kỷ gần đây: từ ghi nhận 258 vào năm 1996, Nguyễn Văn Sáng và Hồ Thu Cúc lên đến 368 loài vào năm 2009 (Nguyễn và cs. 2009) [2], và 420 loài vào năm 2013. Cho tới nay là hơn 500 loài (tính đến tháng 10-2021 theo Uetz & Hošek 2021 [3]. Nhiều loài mới được phát hiện mô tả và ghi nhận mới được phát hiện ở Việt Nam trong hai thập kỷ gần đây, trong đó giống Bungarus có loài mới Bungarus slowinskii được Kuch và cs phát hiện và mô tả năm 2005 [4]. Giống rắn cạp nia Bungarus, Daudin 1803 thuộc họ rắn hổ Elapidae, F. Boie, 1827 là nhóm rắn có nọc độc, hiện ghi nhận 16 loài trên thế giới có vùng phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á từ Pakistan, Ấn Độ và Afghanistan ở phía tây, và phía đông nhiệt đới Đông Nam Á, toàn bộ tiểu vùng Ấn Trung và phần còn lại của Châu Á (Slowinski, 1994; Kharin và cs. 2011; Uetz & Hošek, 2020) [5, 6, 3]. Ở Việt Nam đã ghi nhận 6 loài thuộc giống này bao gồm: Bungarus bungaroides, B. candidus, B. fasciatus, B. flaviceps, B. multicinctus, B. slowinskii [3]. Về mặt phân loại học, nhiều loài trong giống Bungarus có hình thái giống nhau khó định loại (Wall 1907; Slowinski 1994; Kuch 2007; Abtin và cs. 2014) [7, 5, 8,9], các khu vực phân bố của loài thì chồng chéo, và một số loài phân biệt dựa trên vùng địa lý [4, 3]. Ví dụ như: khoanh đen, khoanh trắng Rắn cạp nia đông bắc (Bungarus bungaroides), Rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) và Rắn cạp nia sông Hồng (Bungarus slowinskii). Ngoài ra, một số loài thường bị nhầm lẫn với giống rắn giả cạp nia Lygodon về hình thái [8]. Việc định loại và xác định phân bố tự nhiên các loài trong nhóm rắn độc Bungarus là cơ sở khoa học quan trọng trong việc nghiên cứu độc tố và độc điều trị rắn độc cắn (Fry và cs. 2003; Williams và cs. 2011) [10, 11]. Mã vạch ADN (DNA barcoding) sử dụng đoạn ADN ngắn để phân biệt giữa các loài [12, 13, Error! Reference source not found.] là công cụ phục
2 vụ có hiệu quả cho công tác giám định, phân loại, đánh giá quan hệ di truyền, phát hiện loài mới, quản lý chất lượng, nguồn gốc, xuất xứ, bản quyền của sản phẩm từ sinh vật [14, 16, 13, Error! Reference source not found.]. Ở động vật, một số vùng gen ty thể (Cyt b, ND4 và COI...) đang được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại (phylogeny), phân loại (taxonomy) và nhận dạng loài (identity) [17, 18 ]. Nhiều phân tích phát sinh loài phân tử đã được tiến hành ở trên giống Bungarus hay lớn hơn là trên phân họ Bungarinae trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ti thể (Cyt b, ND4 và COI) [4, 19, 20, 21]. Những nghiên cứu phát sinh loài này đã nâng cao hiểu biết của chúng ta về các mối quan hệ tiến hóa trong giống. Do đó, việc nghiên cứu về phân loại học, phân bố, quan hệ di truyền của các loài thuộc giống Bungarus là rất cần thiết để giải quyết các vấn đề về chẩn loại. Nghiên cứu này sẽ tập trung làm rõ tên khoa học và vị trí phân loại của chúng trong hệ thống phân loại dựa trên những dẫn liệu về hình thái, sinh học phân tử. Chính vì vậy, tôi đề xuất thực hiện đề tài “Kết hợp hình thái và sinh học phân tử trong nghiên cứu chẩn loại giống rắn cạp nia Bungarus Daudin, 1803 ở Việt Nam”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU  Đánh giá sự đa dạng thành phần loài, đặc điểm phân bố của các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam  Kết hợp hình thái và di truyền phân tử trong việc định loại và xác định mối quan hệ di truyền của các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Nội dung 1: Nghiên cứu đa dạng thành loài rắn thuộc giống cạp nia Bungarus ở Việt Nam.  Danh sách loài  Ghi nhận các địa điểm phân bố mới của các loài giống Bungarusi ở Việt Nam.  Mô tả, phân tích, so sánh đặc điểm hình thái.  Xây dựng khoá định loại
3  Nội dung 2: Đánh giá tính đa dạng và mối quan hệ di truyền giữa các quần thể và giữa các loài trong giống.  So sánh sự đa dạng di truyền giữa các loài và giữa các quần thể của một số loài phân bố rộng  Xây dựng cây phát sinh chủng loại. 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI  Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học mới về đa dạng thành phần loài và phân bố của các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam.  Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các quần thể và giữa các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam.  Xây dựng dữ liệu về hình thái và di truyền phân tử giống Bungarus ở Việt Nam, từ đó làm cơ sở khoa học cho việc giám định, bảo tồn và phát triển loài này ở ngoài tự nhiên. 5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI  Cập nhật về phân bố của các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam.  Đánh giá mối quan hệ di truyền của các loài trong giống Bungarus ở Việt Nam.
4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 1.1. Lịch sử nghiên cứu về bò sát ở Việt Nam Theo Nguyễn Quảng Trường năm 2009, nghiên cứu Bò sát ở Việt Nam có lịch sử khá lâu đời nhưng phát triển mạnh vào các giai đoạn cuối thế kỷ XIX, giữa và cuối thế kỷ XX và đặc biệt là những năm đầu thế kỷ XXI [22]. Có hàng loạt công trình công bố về thành phần loài được các tác giả nước ngoài công bố vào nửa đầu thế kỷ 20 nhưng đáng chú ý có hai công trình của Bourret gồm: Les Serpents de l’Indochine mô tả 189 loài và phân loài rắn xuất bản năm 1936 [23], Les Tortues l’Indochine mô tả 44 loài và phân loài rùa xuất bản năm 1941 [24]. Đây được coi là những tài liệu đầy đủ nhất về lưỡng cư bò sát của vùng Đông Dương (Việt Nam, Lào và Campuchia) ở nửa đầu thế kỷ XX; Nửa sau thế kỷ XX, có nhiều công trình nghiên cứu về khu hệ Bò sát do các tác giả trong nước thực hiện. Đào Văn Tiến đã công bố 4 bài báo: Về định loại rùa và cá sấu Việt Nam (1978) [25], Về định loại thằn lằn Việt Nam (1979) [26], Về định loại rắn Việt Nam (1981, 1982) [27, 28] trên tạp chí Sinh vật - Địa học (nay là Tạp chí Sinh học). Theo đó, tác giả đã thống kê ở Việt Nam có 77 loài thằn lằn, 165 loài rắn, 32 loài rùa và 2 loài cá sấu. Cùng thời gian (1980), Trần Kiên và Nguyễn Quốc Thắng xuất bản cuốn Các loài rắn độc Việt Nam, trong đó đã giới thiệu về đặc điểm của 31 loài rắn [29]. Số lượng loài Bò sát ghi nhận ở Việt Nam tăng lên nhanh chóng từ 258 loài vào năm 1996 [30] lên tới 296 loài vào năm 2005 [31] và 368 loài vào năm 2009 [2] và hiện nay ghi nhận khoảng hơn 500 loài (Uetz and Hošek 2021) [3]. Có 3 giống mới và khoảng 180 loài mới đã được phát hiện ở Việt Nam kể từ năm 1980 trở lại đây. Trong thời kỳ 1975-1986, chỉ có 6 loài mới cho khoa học được phát hiện ở nước ta, trong đó chỉ có 3 loài có tác giả là người Việt Nam. Trong giai đoạn 1987-2014, số loài phát hiện mới cho khoa học tăng lên khoảng 170 loài, trong đó có khoảng 40% số công trình công bố do các nhà khoa học Việt Nam là tác giả chính [2, 32, 3, 33].  Trong những năm gần đây việc áp dụng sinh học phân tử kết hợp với các phân tích hình thái trong phân loại học, số lượng loài mới được ghi nhận tăng lên đáng kể, đã có hơn 30 loài Bò sát mới được mô tả tại Việt Nam: Acanthosaura phongdienensis Nguyen và cs. 2019; Achalinus
5 emilyae Ziegler và cs. 2019; A. juliani Ziegler và cs. 2019; A. timi Ziegler và cs. 2019; Calamaria dominici Ziegler, Tran & Nguyen, 2019; C. strigiventris Poyarkov và cs. 2019; Cyrtodactylus septimontium Murdoch và cs. 2019; C. taybacensis Pham và cs. 2019; Liopeltis pallidonuchalis Poyarkov, Nguyen & Vogel 2019; Lipinia trivittata PoyarkoV và cs. 2019; L. vassilievi Poyarkov và cs. 2019; Lycodon namdongensis Luu và cs. 2019; L. pictus Janssen và cs. 2019; Opisthotropis haihaensis Ziegler 2019; Pelodiscus variegatus Farkas và cs. 2019; Scincella badenensis Nguyen và cs. 2019; Acanthosaura prasina Ananjeva và cs. 2020; Achalinus tranganensis Luu và cs. 2020; Achalinus zugorum Miller và cs. 2020; Cyrtodactylus culaochamensis Tri và cs. 2020; Cyrtodactylus phumyensis Ostrowski và cs. 2020; Hemiphyllodactylus bonkowskii Nguyen và cs. 2020; H. nahangensis Do và cs. 2020; H. ngocsonensis Nguyen và cs. 2020; Oligodon rostralis Nguyen và cs. 2020; Scincella baraensis Nguyen và cs 2020; Sinomicrurus peinani Liu và cs. 2020; Sphenomorphus phuquocensis Grismer và cs. 2020 Ahaetulla rufusoculara Lam và cs. 2021; Cyrtodactylus chungi Ostrowski và cs. 2021; C. ngati Le và cs. 2021; C. orlovi Do, và cs. 2021; C. raglai Nguyen và cs. 2021; Gekko phuyenensis Nguyen và cs. 2021; Hebius igneus David và cs. 2021; Hemiphyllodactylus dalatensis Do và cs. Nguyen 2021; Pareas temporalis Le, và cs. 2021; Subdoluseps vietnamensis LE và cs. 2021; Trimeresurus guoi Chen và cs. 2021. 1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA-barcodes) Trong quá trình nghiên cứu về giới thực vật thì phương pháp phân loại thực vật dựa trên những đặc điểm hình thái từ lâu đã chứng minh được vai trò quan trọng trong việc làm nền tảng cho các nghiên cứu về sinh thái, tiến hóa và đa dạng thực vật. Phân loại đông vật căn cứ vào đặc điểm sai khác hình thái của các cơ quan bộ phận, chủ yếu dựa vào sự khác biệt hình thái của các cơ quan đặc biệt là cơ quan sinh sản và các cơ quan có tính bảo thủ ít thay đổi qua các thế hệ, đây là cách thức phân loại truyền thống đã được xây dựng và phát triển từ rất xưa cho tới ngày nay. Tuy nhiên, thực tế đã cho thấy đó chưa phải
6 là phương pháp hiệu quả trong việc phân loại các mẫu đang trong giai đoạn phát triển, các mẫu có đặc điểm giống nhau, hay các mẫu không đủ các bộ phận [34]. Bên cạnh đó, các phương pháp phân loại hình thái thường chỉ được thực hiện bởi các chuyên gia về hình thái học, việc phân loại cần nhiều năm kinh nghiệm và khó thực hiện đối với những sinh viên ít kinh nghiệm hoặc những nhà nghiên cứu không chuyên [35, 36]. Một phương pháp định loại mới dựa trên các dữ liệu sinh học phân tử đã được ra đời từ những năm 1990, đã hỗ trợ đắc lực phương pháp phân loại học động vật truyền thống dựa trên hình thái được gọi với thuật ngữ “ADN mã vạch” lần đầu tiên được sử dụng vào những năm 1993. Đó là phương pháp dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen trong và ngoài nhân (hay ADN). Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen hoặc các vùng gen khác nhau trong hệ gen [37]. Thực tiễn đã chứng minh mã vạch ADN bắt đầu có tầm ảnh hưởng từ những nghiên cứu của Herbert và cs. (2003b) [36]. Kết quả nhóm nghiên cứu chỉ ra rằng các cá thể từ bộ sưu tập của 200 loài có quan hệ gần gũi với nhau thuộc bộ cánh vảy có thể xác định với độ chính xác 100% bằng cách này sử dụng gen ty thể Cytochrome coxidase tiểu đơn vị I (COI) (đây là enzyme cuối cùng trong chuỗi vận chuyển hô hấp của ty thể, màng). Mã vạch ADN là trình tự nucleotide của một chuỗi ADN ngắn, có cùng nguồn gốc tổ tiên, trong đó có vùng ít bị thay đổi (vùng bảo thủ) và vùng thay đổi theo quá trình tiến hóa [35, 38]. Ngoài ra việc lựa chọn một vùng làm trình tự mã vạch ADN còn cần phải mang những đặc điểm sau: có độ dài thích hợp (không quá ngắn để có độ đa hình về trình tự giữa các taxon, không quá dài để có thể giải trình tự theo cách thông thường, thậm chí cả trong khi điều kiện chưa được tối ưu); thuận lợi trong việc so sánh trình tự dựa trên vị trí khác biệt các nucleotide và không có đoạn trình tự chưa chắc chắn như một vài đoạn lặp lại microsatellite làm giảm chất lượng trình tự [39]. Việc giải mã toàn bộ hệ gen của sinh vật gặp nhiều khó khăn, tốn kém nhiều công sức và kinh phí nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có thể thực hiện được. Thay vào đó, việc xác định một đoạn ADN đã biết, đặc trưng cho loài là giải pháp hiệu quả trong phân tích, đánh giá đa dạng di truyền nguồn
7 gen, xác định nguồn gốc, xuất xứ của sinh vật, bản quyền các sản phẩm sinh học. Vì vậy, hướng nghiên cứu mã vạch ADN đang được phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau: nghiên cứu về đa dạng sinh vật, giám định loài, giám định mẫu vật, xét nghiệm bệnh, bản quyền sản phẩm (giống cây trồng, vật nuôi, sản phẩm nông - lâm - thủy sản,…) [40]. Mã vạch ADN là một công cụ mới, rất hiệu quả cho các nghiên cứu về phân loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, nấm, vi sinh vật và virus [41], [35], [36], [42], [43]. Việc xác định loài bằng mã vạch ADN có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài sinh vật khi những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài [43]. Việc sử dụng ADN mã vạch để nhận dạng các loài trên quy mô toàn cầu có ý nghĩa ngày càng lớn. Cho đến nay, đã có trên 6000 công trình khoa học được công bố với khoảng 5 triệu trình tự mã vạch ADN ở các loài sinh vật. Để chuẩn hóa ở mức độ quốc tế về việc sử dụng mã vạch ADN, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự ADN làm mã vạch có thể phân biệt đồng thời nhiều loài [44, 45, 46]. 1.3. Các nghiên cứu bổ sung dẫn liệu mới về phân loại học Nhiều nghiên cứu về phân loại học dựa trên kết quả so sánh hình thái và sinh học phân tử đã góp phần hoàn thiện hơn hệ thống phân loại, ngoài việc hỗ trợ các phương pháp phân tích hình thái để mô tả loài mới ra, sinh học phân tử còn khắc phục, chỉnh sửa các nhẫm lẫn trong hệ thống học trước đây. Ví dụ như: Các phân họ rắn Natricinae, Pareatinae và Pseudoxenodontinae đã được nâng cấp và tách ra thành 4 họ Lamprophiidae, Natricidae, Pareatidae, Pseudoxenodontidae theo tài liệu của Pyron và cs. (2013) [47] và Zaher và cs. (2009) [48]; giống Ophisaurus đổi sang Dopasia [10, 49]; Guo và cs. 2014 dựa trên kết quả phân tích phân tử đã tu chỉnh phân loại giống Amphiesma sang giống Hebius [50]; Takeuchi và cs. 2018 đã nhóm 3 giống Rhabdophis, Macropisthodon Balanophis thành một giống Rhabdophis [51]; Purkayastha đổi giống Xenochrophis về Rhabdophis [52]; Ren và cs. (2019) đổi giống Sinonatrix thành Trimerodytes [53].
8 Tuy nhiên, việc áp dụng sinh học phân tử trong giải quyết mối quan hệ di truyền của các loài thuộc giống Bungarus còn chưa nhiều. Một số công trình công bố có liên quan như: Ulrich Kuch & Dietrich Mebs (2007), Pyron và cs. (2013), Laopichienpong và cs. (2016), Ashraf MR và cs. 2019 mới chỉ phân tích mối quan hệ di truyền của một số loài trong giống Bungarus ở Java, Sri Lanka, Thái Lan, Pakistan [8, 54, 55, 56]. 1.4. Tổng quan các nghiên cứu về giống Bungarus 1.4.1. Trên thế giới Giống cạp nia Bungarus Daudin, 1803 thuộc phân họ Rắn hổ (Elapidae), họ Rắn nước (Colubridae), phân bộ Rắn (Serpentes), bộ Có vảy (Squamata), lớp Bò sát (Reptilia), ngành Có dây sống (Chordata), giới Động vật (Animalia). Giống cạp nia Bungarus có vùng phân bố rộng, chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á từ Pakistan, Ấn Độ và Afghanistan ở phía tây, và phía đông nhiệt đới Đông Nam Á, toàn bộ tiểu vùng Ấn Trung và phần còn lại của Châu Á, hiện ghi nhận 16 loài trên thế giới (Slowinski. 1994; Kharin và cs. 2011; Abtin và cs. 2014; Ahsan and Rahman 2017; Uetz and Hošek. 2021) [5, 6, 57, 56, 3]. Tuy nhiên, lịch sử nghiên cứu phân loại của giống Bungarus trên thế giới rất phức tạp do đây là nhóm có nhiều loài có hình thái tương đồng cao và sự phân bố rời rạc trên một diện tích khu vực lớn (Wall 1907; Slowinski 1994; Kuch 2007) [7, 5, 4]; Giống cạp nia Bungarus Daudin 1803 là một trong những giống rắn có ý nghĩa quan trong về mặt khoa học lớn trong họ Elapidae ở châu Á. Việc cung cấp các thông tin về phân loại học các loài trong giống Bungarus giúp cung cấp cơ sở thực tiễn trong việc nghiên cứu kháng nguyên nọc độc và điều trị rắn cắn thích hợp (Fry và cs. 2003; Williams và cs. 2011) [10, 11]. Trong số 16 loài hiện được mô tả, Bungarus với các dải chéo đen trắng là nhóm có vấn đề về phân loại nhất của giống và rất khó xác định trên thực địa do các đặc điểm trùng lặp về hình thái (Wall 1907; Slowinski 1994; Kuch 2007; Abtin và cs. 2014) [7, 5, 4, 57]. Hầu hết các loài Bungarus đen trắng này được xác định theo phương pháp truyền thống bằng cách phân biệt số lượng các dải chéo ở lưng trên thân và đuôi (Slowinski 1994; Leviton và cs. 2003; Zhao 2006) [5,
9 58, 33]. Tuy nhiên, những đặc điểm này trên các loài có sự trùng lặp và có thể dẫn đến nhận dạng sai. Slowinski 1994, Kuch và Mebs 2007 đưa ra nhận định rằng: Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) rất dễ nhầm lẫn với B. javanicus, Lycodon subcinctus chưa trưởng thành hoặc với L. stormi, chúng cũng có dải màu đen và trắng xen kẽ. [5, 8]. Leviton (2003) đã đưa ra nhận định: Rắn cạp nia bắc Bungarus multicinctus có quan hệ chặt chẽ với nhóm loài đồng hình B. wanghaotingi và cần tiếp tục nhiều các nghiên cứu về phân tích sinh học phân tử để tách biệt hai loài [58] Một số nghiên cứu gần đây của Abtin Chen và cs. (2014) và Chen và cs. 2021) đã mô tả loài Bungarus persicus tại Iran [57] và loài B. suzhenae tại Trung Quốc [19] cho khoa học. Tính đến tháng 8 năm 2021, trên thế giới ghi nhận có 16 loài rắn thuộc giống Bungarus. Trong 30 năm gần đây có 03 loài (chiếm 18,75% số loài) thuộc giống Bungarus được mô tả là loài mới, trong đó: 01 loài ở Việt Nam [3]. Các nghiên cứu liên quan đến phân loại các loài trong giống Bungarus ở các nước giáp ranh với Việt Nam, có một số công bố như: Ở Lào: ghi nhận 4 loài B. candidus (Linnaeus, 1758); B. fasciatus (Schneider, 1801), B. multicinctus Blyth, 1861, B. slowinskii Kuch, Kizirian, Nguyen, Lawson, Donnelly & Mebs, 2005 [3]. Ở Cam-pu-chia: ghi nhận 3 loài B. candidus (Linnaeus, 1758), B. fasciatus (Schneider, 1801), B.s flaviceps Reinhardt, 1843 [3]. Ở Thái Lan: ghi nhận 5 loài B. candidus (Linnaeus, 1758), B. fasciatus (Schneider, 1801), B. flaviceps Reinhardt, 1843, B. multicinctus Blyth, 1861, B. slowinskii Kuch, Kizirian, Nguyen, Lawson, Donnelly & Mebs, 2005 [3]. Ở Trung Quốc: ghi nhận 4 loài B. bungaroides (Cantor, 1839), B. fasciatus (Schneider, 1801), B. multicinctus Blyth, 1861, B. suzhenae Chen, Shi, Vogel, Ding & Shi, 2021 [3]. 1.4.2. Ở Việt Nam Việt Nam nằm trong vùng Indo-Burma, một trong trong 25 điểm nóng có mức độ đa dạng sinh học cao trên thế giới [59] với rất nhiều các loài Bò sát
10 đặc hữu [Error! Reference source not found.]. Nghiên cứu sinh thái học các loài rắn của Việt Nam đã được nhiều tác giả tiến hành và đã được tổng kết lại một cách hệ thống (Nguyễn và cs., 1996, 2007, 2009; Nguyễn và cs. 2005, 2009) [60, 30, 2, 31, 22]. Năm 2005, Kuch và các cộng sự đã mô tả loài mới Bungarus slowinskii thu tại xã Văn Yên của tỉnh Yên Bái, Việt Nam [4]. Ở Việt Nam đã ghi nhận 6 loài thuộc giống Rắn cạp nia (giống Bungarus), trong đó bốn loài có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” là dễ nhầm với nhau nhất là: Rắn cạp nia đông bắc - Bungarus bungaroides (Cantor, 1839), Rắn cạp nia bắc - Bungarus multicinctus Blyth, 1861), Rắn cạp nia nam - Bungarus candidus Linnaeus, 1758)) Rắn cạp nia sông Hồng - Bungarus slowinskii Kuch, Kizirian, Nguyễn, Lawson, Donnelly & Mebs, 2005) khác với Rắn cạp nong - Bungarus fasciatus (Schneider, 1801) có hình thái “ngoài khúc vàng, khúc đen” và Rắn cạp nong đầu đỏ - Bungarus flaviceps Reinhardt, 1843 dễ nhận biết hơn. Các nghiên cứu đều dựa trên so sánh trình tự của đoạn gen ty thể COI và Cytb đã góp phần phân biệt các quần thể có đặc điểm hình thái giống nhau từ đó mô tả thành các loài riêng biệt nhằm tránh nhầm lẫn trong việc phân loại. Cho đến thời điểm hiện tại chưa có nghiên cứu nào về mối quan hệ di truyền của giống này tại Việt Nam, đồng thời sự đa dạng và vị trí phân loại của một số loài trong giống Bungarus ở Việt Nam vẫn có nhiều vấn đề chưa rõ ràng (Nguyễn và cs. 2017; Xie và cs. 2018) [80, 21]. 1.5. Khái quát về điều kiện tự nhiên ở Việt Nam 1.5.1. Địa hình Địa hình của Việt Nam nói chung bao gồm miền núi và vùng đất thấp. Miền Bắc bao gồm vùng Đông Bắc, Tây Bắc và đồng bằng sông Hồng. Vùng Đông Bắc trải dài từ thung lũng sông Hồng đến Vịnh Bắc bộ có nhiều diện tích miền núi nằm rải rác ở độ cao từ 300-1600 m; trong đó Tây Côn Lĩnh là đỉnh cao nhất với độ cao 2341 m. Vùng Tây Bắc bao gồm các ngọn núi chạy từ phía bắc biên giới Trung Quốc về phía tây của tỉnh Thanh Hóa, trong đó Fansipan là đỉnh núi cao nhất với độ cao 3143 m. Miền Trung với dãy Trường Sơn kéo
11 dài, có thể chia làm 3 vùng (thường được sử dụng cách phân chia này để khoanh vùng phân bố của các loài động, thực vật). Bắc Trường Sơn bắt đầu từ tỉnh Nghệ An đến khu vực Khe Sanh, vùng này khá thấp, ít có đỉnh cao quá 1300 m; mặc dù về phía Tây sang đất Lào, núi có thể cao hơn 2800 m. Trung tâm dãy Trường Sơn bắt đầu từ bên dưới Khe Sanh gần đèo Hải Vân chạy về phía Nam dọc theo biên giới Việt-Lào tới sông Ba-Đà Rằng. Nam Trường Sơn bao gồm khu vực từ sông Ba-Đà Rằng, dãy Trường Sơn kéo dài xuống phía Nam và bao gồm các vùng núi còn lại của Việt Nam, là một loạt các cao nguyên bằng đá granit và bazan có các đỉnh núi nằm rải rác và cô lập. Miền Nam nổi tiếng với vùng đồng bằng sông Cửu Long, diện tích khoảng 40000 km2 với độ cao trung bình dưới 10 m [61, 62] 1.5.2. Khí hậu Khí hậu Việt Nam có thể chia làm 7 kiểu: (1) Nhiệt đới gió mùa với mùa đông lạnh và mùa hè mưa; (2) Khí hậu nhiệt đới gió mùa với mùa đông lạnh và mưa mùa thu; (3) Khí hậu nhiệt đới gió mùa với mùa đông ấm áp-mùa đông ấm áp-mùa đông mưa; (4) Khí hậu nhiệt đới gió mùa với mùa đông ấm áp-mùa thu-mùa đông mưa; (5) Khí hậu nhiệt đới gió mùa với mùa đông ấm áp và mưa mùa hè; (6) Mưa phùn gió mùa khí hậu với những cơn mưa mùa hè; (7) Khí hậu nhiệt đới gió mùa kết hợp với núi [61]. Theo Nguyễn và cs. (2000), nhiệt độ trung bình hàng năm của Việt Nam dao động từ 18oC-26,8oC; lượng mưa trung bình hàng năm thay đổi đáng kể từ 1324,4 mm (tỉnh Khánh Hòa) đến 3024,1 mm (tỉnh Kiên Giang) và độ ẩm trung bình hàng năm dao động trong khoảng 79-87% [63]. 1.5.3. Thủy văn Việt Nam có một bộ phận lớn lưu vực các sông, suối nằm ngoài lãnh thổ như sông Hồng chiếm 57,3%, sông Mã là 38%, sông Cả là 34% và sông Cửu Long chiếm đến 91%. Trong tổng lượng nước của Việt Nam là 839 tỉ m3/năm thì phần từ bên ngoài chảy vào lên tới 501 tỉ m3/năm chiếm 59,7%, riêng sông Cửu Long thì tỉ lệ này lên đến 89% (451 tỉ m3/năm trong tổng lượng nước 507 tỉ m3/năm của sông). Diện tích sông, suối lớn góp phần tạo nên những vùng địa lý sinh vật đặc thù cho Việt Nam [62].