Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tách chiết Enzyme Alginate lyase từ vi sinh vật có trong rong biển và bước đầu ứng dụng nó để thủy phân alginate

Chia sẻ: Trang Lê | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:79

Thêm vào BST

Báo xấu

213
lượt xem 38
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mời các bạn cùng tham khảo luận văn thạc sĩ Sinh học với đề tài "Nghiên cứu tách chiết Enzyme Alginate lyase từ vi sinh vật có trong rong biển và bước đầu ứng dụng nó để thủy phân alginate" để nắm nội dung kiến thức cần thiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tách chiết Enzyme Alginate lyase từ vi sinh vật có trong rong biển và bước đầu ứng dụng nó để thủy phân alginate

1 DANH MUÏC CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT .................................................................4 DANH MUÏC CAÙC BAÛNG BIEÅU, HÌNH VAØ ÑOÀ THÒ ......................................5 MÔÛ ÑAÀU ............................................................................................................5 1. Tính caáp thieát cuûa ñeà taøi.................................................................................7 2. Muïc ñích, nhieäm vuï vaø noäi dung nghieân cöùu cuûa ñeà taøi ................................8 3. Ñieåm môùi vaø yù nghóa khoa hoïc, thöïc tieãn cuûa ñeà taøi .....................................8 Chương 1. TOÅNG QUAN ...................................................................................9 1.1. Toång quan veà rong Naâu [1] .........................................................................9 1.2. Toång quan veà Alginate ..............................................................................11 1.2.1. Alginate[1][11] ....................................................................................... 11 1.2.2. Coâng thöùc caáu taïo cuûa axit alginic vaø muoái alginate [1],[11] ................ 12 1.2.2.1. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa Alginic ............................................................12 1.2.2.2. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa caùc keo Alginate.............................................14 1.2.3. Tính chaát cuûa moät soá loaïi keo Alginate ................................................. 15 1.3 Moät soá nghieân cöùu veà alginate lyase .........................................................18 1.4. Nhöõng nghieân cöùu veà Oligo alginate (OA) ...............................................19 1.4.1. Nhöõng nghieân cöùu trong nöôùc ................................................................ 19 1.4.2. Nhöõng nghieân cöùu ngoaøi nöôùc................................................................ 21 1.5. Toång quan sô löôïc veà caùc phöông phaùp nghieân cöùu .................................23 1.5.1. Phöông phaùp phaân laäp vi sinh vaät[6],[8] ................................................ 23 1.5.2. Phöông phaùp baûo quaûn gioáng vi sinh vaät ............................................... 23 1.5.3. Phöông phaùp nghieân cöùu hình thaùi vi sinh vaät.[6] .................................. 24 1.5.4. Phöông phaùp nuoâi caáy vi sinh vaät sinh enzyme vaø thu nhaän cheá phaåm enzyme[3][4][5][7] ........................................................................................... 25 1.5.4.1. Phöông phaùp nuoâi caáy .........................................................................25 1.5.4.2. Thu hoài cheá phaåm enzyme ..................................................................26 Chöông 2. NOÄI DUNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU .........................28 2.1. Noäi dung nghieân cöùu. ................................................................................28
2 2.2. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu[3][6][7][8].................................................29 2.3. Phöông phaùp boá trí thí nghieäm ..................................................................29 2.3.1. Boá trí nghieäm phaân laäp chuûng vi khuaån trong töï nhieân coù khaû naêng sinh toång hôïp algL ................................................................................................... 29 2.3.2. Sô ñoà boá trí thí nghieäm löïa choïn chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång hôïp algL cao ..................................................................................................... 30 2.3.3. Sô ñoà boá trí thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa chuûng vi sinh vaät ñöôïc löïa choïn ................................................................................................... 32 2.3.4. Sô ñoà boá trí thí nghieäm thu dòch enzyme algL töø moâi tröôøng sinh khoái . 33 2.3.5. Sơ ñồ bố trí thí nghiệm thử nghiệm phaân caét caùc loại Natri alginate khaùc nhau bằng dung dịch enzyme thu ñược............................................................. 34 2.3.6. Sô ñoà boá trí thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme ................................ 35 2.3.7. Sô ñoà boá trí thí nghieäm phaân aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät vaø khaû naêng phaân caét cuûa algL ............................... 36 2.3.8. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL ...................................................................... 38 Sô ñoà 2.3.8: AÛnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL... 38 2.3.9. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL ....................................................................................39 2.3.10. Sô ñoà boá trí thí nghieäm choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå thu hoài algL töø dòch enzyme ................................................................................................. 40 Chöông 3. KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU VAØ THAÛO LUAÄN ...............................41 3.1. Keát quaû nghieân cöùu phaân laäp chuûng vi sinh vaät trong töï nhieân coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme algL ..............................................................................41 3.2. Kết quả thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật coù khả năng sinh algL cao 42 3.3. Keát quaû thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa vi sinh vaät ñaõ choïn .....44 3.4. Keát quaû thí nghieäm phaân caét caùc loaïi natri alginate baèng dung dòch enzyme thu ñöôïc...............................................................................................45
3 3.5 Keát quaû ñònh danh vi sinh vaät .....................................................................47 3.5.2. Keát quaû nhuoäm Gram vaø sinh hoùa ñònh danh baèng heä thoáng IDS14GNR .... 48 3.5.3. Keát quaû giaûi trình töï gene 16S treân maùy CEQ 8000 vaø tra cöùu treân BLAST SEARCH ............................................................................................. 49 3.6. Keát quaû thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme ..........................................51 3.7. Keát quaû thí nghieäm aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät vaø khaû naêng phaân caét cuûa algL do vi sinh vaät sinh ra ..............53 3.8. Keát quaû thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc ion kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL ....................................................................................54 3.9. Keát quaû nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL...................................................................................................................56 3.10. Keát quaû thí nghieäm choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå taùch chieát algL töø dòch enzyme......................................................................................................58 3.11. Ñeà xuaát quy trình thu hoài cheá phaåm enzyme algL töø vi khuaån Klebsiella sp ......................................................................................................................60 Chöông 4. KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ XUAÁT YÙ KIEÁN .............................................63 4.1. Keát luaän .....................................................................................................63 4.2. Ñeà xuaát yù kieán ...........................................................................................64 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO ............................................................................................. 66 PHUÏ LUÏC 1. CAÙC KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ............................................................ 70 PHUÏ LUÏC 2. HOÙA CHAÁT VAØ THIEÁT BÒ SÖÛ DUÏNG TRONG LUAÄN VAÊN............ 75
4 DANH MUÏC CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT E: Enzyme S: Cô chaát Na-alginate dd: dung dòch OA: Oligo Alginate vsv: vi sinh vaät algL: Alginate lyase Na-alg: Natri alginate EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid
5 DANH MUÏC CAÙC BAÛNG BIEÅU, HÌNH VAØ ÑOÀ THÒ STT TEÂN BAÛNG Trang 1 Baûng 1.2.3. Nhieät ñoä phaân huûy cuûa caùc loaïi Alginte khaùc nhau 16 2 Bảng 1.4.1. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä oligo alginate ñeán khaû 19 naêng naûy maàm cuûa haït thoùc gioáng 3 Baûng 3.4. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dung dòch Na- 44 alginate khaùc nhau 4 Baûng 3.5.2. Keát quaû thöû nghieäm sinh hoùa ñònh danh 47 5 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt ñộng của alginate 55 lyase TEÂN HÌNH Hình 1.2.2.1a :Coâng thöùc coå ñieån cuûa hai ñôn vò monomeric 1 trong axit Alginic 12 2 Hình 1.2.2.1b: Hình theå daïng gheá cuûa axit Uronic 13 3 Hình 1.2.2.1c: Caáu taïo cuûa axit Alginic 13 4 Hình 1.2.2.1d: Caáu taïo axit alginic theo moâ hình caùc coâng thöùc 13 coå ñieån (coâng thöùc phoái caûnh) 5 Hình 1.2.2.2a: Coâng thöùc caáu taïo Na-alginate 14 6 Hình 1.2.2.2b: Coâng thöùc caáu taïo Ca-alginate 15 7 Hình 1.4.2a: Aûnh höôûng cuûa hoãn hôïp Oligomanuronate (Oligo- 20 M) chöa baûo hoaø vaø hoãn hôïp Oligoguluronate (Oligo-G) chöa baûo hoaø leân söï daøi ra cuûa reå caây caø roát vaø caây luùa 8 Hình 1.4.2b: AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä hoån hôïp oligo-G ñeán söï daøi ra cuûa reå caây caøroát vaø luùa . Hình 1.4.2c: AÛnh höôûng cuûa möùc ñoä ñoàng truøng hôïp oligo-G 21 ñeán söï daøi ra cuûa reå caây caøroát aø luùa . Ñoä daøi cuûa reå xaùc ñònh sau 8 vaø 15 ngaøy. (noàng ñoä 0,75mg/ml) 9 Hình 3.1a: VSV coù khuaån laïc maøu traéng söõa (C1) 40 10 Hình 3.1b: VSV coù khuaån laïc maøu môõ gaø (C2) 40
6 11 Hình 3.3a. Khuaån laïc vi sinh vaät maøu traéng söõa treân moâi tröôøng 43 thaïch I 12 Hình 3.3b. Khuaån laïc vi sinh vaät maøu traéng söõa treân moâi tröôøng 43 thaïch chæ coù Na-alginate 1,5% vaø soi döôùi kính hieån vi vaät kính 100x 13 Hình 3.5.1. Khuaån laïc vi sinh vaät phaân laäp treân caùc moâi tröôøng 46 khaùc nhau 14 Hình 3.5.2. Hình aûnh teá baøo vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc 47 15 Hình 3.5.3. Sô ñoà giaûi trình töï gene 16S cuûa chuûng vi sinh vaät 49 phaân laäp TEÂN ÑOÀ THÒ Ñoà thò 3.2. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 41 1 1% theo thôøi gian phaân caét Ñoà thò 3.4. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dd Na-alginate 1% 44 2 khaùc nhau theo thôøi gian phaân caét Ñoà thò 3.6a. Möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 3 1% theo noàng ñoä Enzyme 50 4 Ñoà thò 3.6b. Möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na- 51 alginate 1% theo noàng ñoä Enzyme Ñoà thò 3.7. AÛnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån 52 5 cuûa Klebsiella sp vaø hoaït ñoä enzyme algL 6 Ñoà thò 3.8. AÛnh höôûng caùc ion kim loaïi ñeán hoaït löïc cuûa 53 enzyme algL 7 Ñoà thò 3.9. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa 55 enzyme algL
7 MÔÛ ÑAÀU 1. Tính caáp thieát cuûa ñeà taøi Rong bieån laø nguoàn lôïi bieån cung caáp caùc chaát keo quan troïng nhö Agar, Alginate, Carrageenan duøng trong coâng ngheä thöïc phaåm vaø caùc ngaønh coâng nghieäp khaùc. Treân theá giôùi töø nhöõng naêm 1980 rong bieån ñaõ ñöôïc quan taâm nghieân cöùu. Naêm 1930 coâng ngheä cheá bieán caùc chaát Alginate, Manitol, Agar phaùt trieån maïnh vaø ngaøy caøng öùng duïng nhieàu trong thöïc teá, ñaëc bieät laø ôû caùc nöôùc Nhaät Baûn, Myõ vaø Trung Quoác. Theo Luning (1990) toång saûn löôïng cuûa Alginate laø 35.000 taán.[1] Treân theá giôùi coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu öùng duïng cuûa Alginate trong caùc ngaønh coâng nghieäp nhö: Thöïc phaåm, döôïc phaåm, myõ phaåm, coâng ngheä deät, noâng nghieäp, coâng ngheä sinh hoïc, nghieân cöùu khoa hoïc… Keát quaû cuûa caùc coâng trình nghieân cöùu öùng duïng alginate trong noâng nghieäp cho thaáy raèng, maïch alginate sau khi caét maïch coù taùc duïng kích thích söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån ñoái vôùi caây troàng [9][10][12][13][14]. Vôùi öùng duïng naøy, thieát nghó vieäc nghieân cöùu caùc phöông phaùp caét maïch alginate ñeå saûn xuaát cheá phaåm kích thích taêng tröôûng thöïc vaät laø raát caàn thieát nhaèm taêng naêng suaát caây troàng vaø taïo ra caùc saûn phaåm coù giaù trò toát töø ñoù naâng cao giaù trò kinh teá laø moät höôùng quan troïng ñang ñöôïc caùc nhaø khoa hoc Vieät Nam quan taâm. Chính vì leõ ñoù, ñeà taøi “ Nghieân cöùu taùch chieát Enzyme Alginate lyase töø vi sinh vaät coù trong rong bieån vaø böôùc ñaàu öùng duïng noù ñeå thuyû phaân alginate” laø raát caàn thieát, goùp phaàn öùng duïng coâng ngheä sinh hoïc vaøo noâng nghieäp vaø ñôøi soáng saûn xuaát ôû nöôùc ta.
8 2. Muïc ñích, nhieäm vuï vaø noäi dung nghieân cöùu cuûa ñeà taøi Muïc ñích, nhieäm vuï Ñeà taøi nhaèm phaân laäp, tuyeån choïn chuûng vi sinh vaät trong tự nhieân coù khaû naêng sinh toång hôïp alginate lyase cao. Tieán haønh nuoâi caáy chuûng vi sinh vaät ñaõ tuyeån choïn trong moâi tröôøng thích hôïp sau ñoù löïa choïn phöông phaùp thích hôïp ñeå thu nhaän cheá phaåm alginate lyase töø moâi tröôøng nuoâi caáy vaø böôùc ñaàu nghieân cöùu öùng duïng caét maïch alginate. Xaùc ñònh hoaït ñoä cuûa enzyme alginate lyase theo phương phaùp ño ñộ nhớt dung dịch alginate 1% trước vaø sau khi phaân caét. 3. Ñieåm môùi vaø yù nghóa khoa hoïc, thöïc tieãn cuûa ñeà taøi Ñieåm môùi cuûa ñeà taøi Ñaây laø moät trong nhöõng nghieân cöùu ñaàu tieân veà phaân caét alginate baèng phöông phaùp sinh hoïc. Enzyme alginate lyase coù theå öùng duïng ñöôïc vaøo noâng nghieäp ñeå saûn xuaát ra cheá phaåm taêng tröôûng thöïc vaät ít ñoäc haïi cho con ngöôøi vaø goùp phaàn giaûm laøm giaûm oâ nhieãm moâi tröôøng. YÙ nghóa khoa hoïc vaø thöïc tieãn Keát quaû cuûa ñeà taøi goùp phaàn laøm phong phuù theâm nhöõng hieåu bieát veà coâng ngheä sinh hoïc vaø öùng duïng cuûa noù vaøo caùc lónh vöïc cuûa ñôøi soáng xaõ hoäi ñaëc bieät laø trong coâng ngheä saûn xuaát enzyme, noâng nghieäp vaø moät soá ngaønh coâng nghieäp khaùc. Keát quaû cuûa ñeà taøi cuõng môû roäng ñaàu ra cho ngaønh coâng nghieäp alginate cuûa Vieät Nam. Beân caïnh ñoù caùc coâng ty saûn xuaát thuoác taêng tröôûng thöïc vaät cuõng coù theå öùng duïng ñeå saûn xuaát ra moät cheá phaåm taêng tröôûng thöïc vaät ít gaây ñoäc haïi cho con ngöôøi vaø moâi tröôøng.
9 Chöông 1 TOÅNG QUAN 1.1. Toång quan veà rong Naâu [1] Ngaønh rong Naâu laø moät trong nhöõng ngaønh coù giaù trò kinh teá cao. Rong Naâu coù treân 190 chi, hôn 900 loaøi, phaàn lôùn soáng ôû bieån, soá loaøi vaø soá chi tìm thaáy trong nöôùc ngoït khoâng nhieàu laém. Rong coù caáu taïo nhieàu teá baøo daïng maøng giaû, daïng phieán, daïng sôïi ñôn giaûn, moät haøng teá baøo chia nhaùnh, daïng oáng hoaëc phaân nhaùnh phöùc taïp hôn daïng caây coù goác, reã, thaân, laù. Rong sinh tröôûng ôû ñænh, ôû giöõa, ôû goác caùc loùng. Ngoaøi ra, do caùc teá baøo rong daïng phieán chia caét sinh tröôûng khueách taùn goïi laø sinh tröôûng beà maët. Thaønh phaàn hoaù hoïc cuûa rong Naâu + Saéc toá Saéc toá rong Naâu laø dieäp luïc toá (Chlorophyl), dieäp hoaøng toá (Xanthophyl), saéc toá maøu naâu (Fucoxanthin), saéc toá ñoû (Caroten). Tuyø theo tyû leä caùc loaïi saéc toá maø rong coù maøu töø naâu – vaøng naâu – naâu ñaäm – vaøng luïc. Nhìn chung saéc toá cuûa rong Naâu khaù beàn. + Gluxit − Monosachride Monosacharide quan troïng trong rong Naâu laø ñöôøng Manitol ñöôïc Stenhouds phaùt hieän naêm 1884 vaø ñöôïc Kylin (1913) chöùng minh theâm. Manitol coù coâng thöùc toång quaùt laø : HOCH2 – (CHOH)4 – CH2OH Manitol tan ñöôïc trong ancol, deã tan trong nöôùc coù vò ngoït. Haøm löôïng töø 14 ÷ 25% troïng löôïng khoâ tuyø thuoäc vaøo ñieàu kieän soáng. − Polysacharide
10 Alginic: laø moät polysacharide taäp trung giöõa ôû vaùch teá baøo, laø thaønh phaàn chuû yeáu taïo thaønh taàng beân ngoaøi cuûa maøng teá baøo rong Naâu Alginic vaø muoái cuûa noù coù nhieàu coâng duïng trong ngaønh coâng nghieäp, noâng hoïc, y hoïc vaø thöïc phaåm. Haøm löôïng Alginic trong caùc loaïi rong Naâu khoaûng 2 ÷ 4% so vôùi rong töôi vaø 13 ÷ 15% so vôùi rong khoâ. Haøm löôïng phuï thuoäc vaøo loaïi rong, ñieàu kieän ñòa lyù moâi tröôøng maø rong sinh soáng. Theo taøi lieäu toång keát cuûa Miyake (1995) cho thaáy haøm löôïng Alginic trong caùc loaïi rong Naâu ôû caùc vuøng bieån Lieân Xoâ cuõ laø 13 ÷ 40% Theo taøi lieäu phaân tích cuûa caùc chuyeân gia Boä Thuyû saûn cho thaáy haøm löôïng Alginic trong caùc loaïi rong Naâu ôû Haûi Phoøng laø 22 ÷ 40%, trong khi ñoù, rong Naâu ôû vuøng bieån Phuù Yeân vaø Khaùnh Hoaø cao hôn haún. Haøm löôïng Alginic coù trong caùc loaøi rong ôû Mieàn Trung Vieät Nam laø khaù cao, dao ñoäng töø 12,3 ÷ 39,4% so vôùi troïng löôïng khoâ tuyeät ñoái, tuyø thuoäc vaøo loaøi vaø vuøng ñòa lyù. Trong ñoù, loaøi rong S. mcclurei vaø Turbinaria ornata coù haøm löôïng Alginic cao nhaát khoaûng 35,9 ÷ 39,4% rong khoâ tuyeät ñoái. Neáu so saùnh taát caùc vuøng bieån thì rong ôû vuøng bieån Khaùnh Hoaø coù haøm löôïng Alginic cao hôn caû (töø 26,2 ÷ 39,4% rong khoâ tuyeät ñoái). − Axit Fucxinic: coù tính chaát gioáng vôùi axit Alginic. Axit Fucxinic taùc duïng vôùi axit Sunfuric taïo thaønh hôïp chaát coù maøu tuyø thuoäc vaøo noàng ñoä axit Sunfuric. − Fuccoidin: laø loaïi muoái giöõa axit Fuccoidin vôùi caùc kim loaïi hoaù trò khaùc nhau nhö Ca, Cu, Zn. Fuccoidin coù tính chaát gaàn gioáng vôùi axit Alginic, nhöng haøm löôïng thaáp hôn Alginic. − Laminarin: Laminarin laø tinh boät cuûa rong Naâu, thöôøng gaëp ôû daïng boät khoâng maøu, khoâng muøi vaø coù hai loaïi hoaø tan vaø khoâng hoaø tan trong nöôùc.
11 Laminarin coù haøm löôïng töø 10 ÷ 15% troïng löôïng rong khoâ tuyø thuoäc vaøo loaïi rong, vò trí ñòa lyù vaø moâi tröôøng sinh soáng cuûa rong Naâu. − Cellulose: laø thaønh phaàn caáu taïo neân voû caây rong. Haøm löôïng Cellulose trong rong Naâu nhieàu hôn rong Ñoû. + Proâteâin: Proâteâin trong rong Naâu khoâng cao laém nhöng khaù hoaøn haûo. Do vaäy rong Naâu coù theå laøm thöïc phaåm. Proâteâin trong rong Naâu thöôøng ôû daïng lieân keát vôùi Iod taïo Iod höõu cô coù giaù trò cao nhö: MonoIodInzodizin, DiIodInzodizin. Haøm löôïng proâteâin rong Naâu ôû vuøng bieån Nha Trang dao ñoäng 8,05 ÷ 21,11% so vôùi troïng löôïng khoâ. Haøm löôïng axit amin cuõng ñaùng keå vaø coù giaù trò cao trong proâteâin cuûa rong bieån. + Chaát khoaùng Haøm löôïng caùc nguyeân toá khoaùng trong rong Naâu thöôøng lôùn hôn nöôùc bieån. Chaúng haïn: Iod cuûa rong bieån lôùn hôn trong nöôùc bieån töø 80 ÷90 laàn. Haøm löôïng Ba lôùn hôn trong nöôùc bieån laø 1.800 laàn. Haøm löôïng khoaùng ôû vuøng bieån Nha Trang dao ñoäng trong töø 15,51 ÷ 46,30% phuï thuoäc vaøo muøa vuï vaø thôøi kyø sinh tröôûng 1.2. Toång quan veà Alginate 1.2.1. Alginate[1][11] Alginate laø thuaät ngöõ thöôøng duøng cho caùc loaïi muoái cuûa axit alginic, nhöng cuõng coù theå xem laø taát caû caùc daãn xuaát cuûa axit alginic hay chính baûn thaân axit alginic. ÔÛ moät soá nôi thì thuaät ngöõ “algin” ñöôïc duøng thay cho alginate. Alginate toàn taïi trong caùc thaønh teá baøo cuûa rong Naâu döôùi daïng muoái canxi, Magieâ, natri cuûa axit alginic. Alginate ñöôïc hình thaønh nhôø phaûn öùng ñoàng truøng hôïp khoâng phaân nhaùnh cuûa axit α – L – guluronic vaø axit β – D – manuronic. Söï khaùc nhau giöõa caùc block laø veà kích thöôùc vaø söï thay ñoåi caùc
12 ñoaïn manuronic (M) vaø guluronic (G) cuõng nhö söï toàn taïi cuûa caùc block ngaãu nhieân. Caáu truùc cuûa alginate chòu aûnh höôûng cuûa nguoàn rong bieån cuõng nhö ñieàu kieän phaùt trieån cuûa rong. Ngöôøi ta raát quan taâm ñeán tyû leä M/G vì noù quyeát ñònh ñeán tính chaát cuûa gel ñöôïc taïo thaønh. Neáu tyû leä naøy caøng nhoû thì khaû naêng taïo gel cuûa alginate caøng cao vaø ngöôïc laïi. Alginate cuõng coù theå ñöôïc sinh toång hôïp töø moät loaïi vi sinh vaät robacter vinelandii, tuy nhieân saûn phaåm alginate do vi sinh vaät saûn sinh ra coù khaû naêng taïo gel keùm, ít coù tính thöông maïi neân thöôøng chæ ñöôïc ñeà caäp ñeán trong coâng taùc giaûng daïy. 1.2.2. Coâng thöùc caáu taïo cuûa axit alginic vaø muoái alginate [1],[11] 1.2.2.1. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa Alginic Alginic thuoäc polysacharide nhöng coù chöùa nhoùm carboxyl (-COOH ) trong phaân töû neân thöôøng goïi laø axit alginic hay polysacharide coù tính axit yeáu. Theo Niwa (1940) cho raèng ñôn vò caáu truùc cuûa Alginic laø Uronic coù coâng thöùc phaân töû laø (C24H30O23)n, Chapman thì cho raèng Alginic laø daïng truøng hôïp thoaùt nöôùc cuûa D.Mamuronic coù coâng thöùc (C5H9O5COOH)n vaø coâng thöùc hoaù hoïc töông ñöông cuûa Alginic laø (C6H8O6)n. Hai thuyeát töông töï nhau, n = 80 ÷83 do vaäy coù söï truøng hôïp raát lôùn. III.1.2.2. Moät soá tính chaát cuûa caùc alginate. Hình 1.2.2.1a :Coâng thöùc coå ñieån cuûa hai ñôn vò monomeric trong axit Alginic
13 Hình 1.2.2.1b: Hình theå daïng gheá cuûa axit Uronic Theo caùc taøi lieäu hoaù sinh gaàn ñaây moâ taû caáu taïo cuûa Alginic goàm caùc axit D.Manuronic lieân keát vôùi L.Lunuronic baèng lieân keát 1 – 4 maïch thaúng khoâng phaân nhaùnh Hình Hình 3: CaáuCaá 1.2.2.1c: taïuo taï cuûoacuû Alginic axit a axit Alginic Alginic laø polymer goàm nhieàu axit Manuronic (M) keát hôïp vôùi Guluronic (G) taïo maïch thaúng khoâng phaân nhaùnh vaø coù theå lieân keát theo hình phaúng sau: Hình 1.2.2.1d: Caáu taïo axit alginic theo moâ hình caùc coâng thöùc coå ñieån (coâng thöùc phoái caûnh) Treân phaân töû Alginic, caùc phaân töû M vaø G seõ toå hôïp thaønh caùc block theo daïng hình sau ñaây:
14 Hình 1.2.2.1e: G block Hình 1.2.2.1f: M block Hình 1.2.2.1g: MG block 1.2.2.2. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa caùc keo Alginate. Natri Alginate. Coâng thöùc phaân töû: (C5H7O4COONa)n. Coâng thöùc caáu taïo: Hình 1.2.2.2a: Coâng thöùc caáu taïo Na-alginate
15 Canxi Algiante. Coâng thöùc phaân töû: [(C5H7O4COO)2 Ca)]n. Coâng thöùc caáu taïo: Hình 1.2.2.2b: Coâng thöùc caáu taïo Ca-alginate Alginate Amonium 1.2.3. Tính chaát cuûa moät soá loaïi keo Alginate Muoái alginate cuûa kim loaïi hoaù trò I ( Natri alginate ) deã hoøa tan trong nöôùc, taïo dung dòch keo nhôùt, coù ñoä dính vaø ñoä nhôùt cao, khi laøm laïnh khoâng ñoâng vaø khi khoâ trong suoát coù tính ñaøn hoài. Muoái Alginate cuûa kim loaïi hoùa trò II ( Alginate Canxi, Alginate Magieâ,…) khoâng hoaø tan trong nöôùc, tuyø theo kim loaïi maø coù maøu khaùc nhau. Khi muoái aåm thì deûo deã bieán hình, khi khoâ raát cöùng, raát khoù thaám nöôùc, nhôø coù tính chaát naøy maø Alginate coù raát nhieàu öùng duïng trong caùc lónh vöïc khaùc nhau. Boät Alginate deã bò giaûm ñoä nhôùt neáu khoâng ñöôïc baûo quaûn ôû nhieät ñoä thaáp. Khaùc vôùi Agar thì khi giaûm nhieät ñoä thì dung dòch Alginate khoâng bò ñoâng laïi, ngay caû khi laøm laïnh vaø tan giaù thì ñoä nhôùt vaø beà ngoaøi cuõng khoâng thay ñoåi.
16 Propyleneglycol Alginate ( PGA) vôùi 80 – 85% nhoùm -COOH ñöôïc ester hoaù coù taùc duïng nhoû nhaát vôùi ion Canxi, do ñoù hôïp chaát naøy ñöôïc öùng duïng trong coâng nghieäp söõa. PGA giaûm tính hoaø tan khi pH moâi tröôøng < 4. pH = 2 thì PGA bò keát tuûa. Caùc loaïi Alginate khaùc nhau thì seõ bò phaân huyû ôû caùc nhieät ñoä khaùc nhau. Theo nghieân cöùu cuûa Kenfikato – Khoa Thuyû saûn Tröôøng Ñaïi hoïc Hokaido, Nhaät Baûn cho thaáy nhieät phaân huûy cuûa caùc Alginate trong baûng sau: Alginate Nhieät ñoä phaân huûy ( oC ) Axit Alginic 186 (1) Na – Alginate 221,5 Na – Aginate(2 ) 231,5 Ca – Algiante 204,5 Al – Alginate 196 Fe – Alginate 218,5 Baûng 1.2.3. Nhieät ñoä phaân huûy cuûa caùc loaïi Alginate khaùc nhau Ñoä nhôùt vaø troïng löôïng phaân töû. Dung dòch Alginate taïo neân ñoä nhôùt cao khi hoaø tan trong nöôùc. Ñoä nhôùt cuûa noù taêng theo noàng ñoä Alginate hoaø tan vaø giaûm theo chieàu taêng cuûa nhieät ñoä. Troïng löôïng phaân töû trung bình cuûa Alginate ñöôïc ño baèng ñoä nhôùt vaø khaû naêng thaåm thaáu theo phöông trình sau ñaây: η = K.Mγ Trong ñoù: η: ñoä nhôùt M: khoái löôïng phaân töû trung bình K, γ : heä soá thöïc nghieäm.
17 Troïng löôïng phaân töû trung bình cuûa Alginate ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông phaùp ñoä nhôùt (Viscometric method).
18 1.3 Moät soá nghieân cöùu veà alginate lyase R. Scott Doubet vaø Ralph S. Quatrano (1982), thuoäc tröôøng Ñaïi hoïc Oregen State. Nghieân cöùu phaân laäp caùc vi khuaån bieån coù khaû naêng sinh Lyase ñaëc hieäu caét maïch Alginate. Cho thaáy caùc Alginate lyase ñöôïc chieát ruùt töø moâi tröôøng cuûa moät soá vi sinh vaät ñaõ ñöôïc phaân laäp. Caùc lyase naøy ñöôïc sinh ra nhôø moâi tröôøng coù alginate töï nhieân vaø coù hoaït tính vôùi caû block cuûa axit manuronic vaø axit guluronic cuûa chuoãi polymer alginate. Lyase ñaëc hieäu ñoái vôùi axit guluronic ñöôïc taùch chieát töø moâi tröôøng, trong khi ñoù lyase ñaëc hieäu vôùi axit manuronic ñöôïc taùch chieát töø teá baøo vi khuaån.[20] Naêm 1992, Manabu Kitamikado, Chao-Huang Tseng, Kuniko Yamaguchi vaø Takashi Nakamura thuoäc tröôøng Ñaïi hoïc Fukuoka, Nhaät Baûn. Nghieân cöùu hai chuûng vi sinh vaät sinh enzyme alginate lyase. Cho thaáy caùc algiante lyase ngoaïi baøo ñöôïc tinh saïch töø Vibrio harveyi Al-128 vaø V. alginolyticus ATCC 17749. Söï hình thaønh enzyme naøy ñaàu tieân caét ñöùt lieân keát α 1,4 bao goàm caùc ñôn vò L-guluronate vaø sau ñoù laø caét ñöùt caùc lieân keát beta 1,4 bao goàm caùc ñôn vò D-manuronate. Phaân töû löôïng cuûa enzyme naøy ñöôïc xaùc ñònh khoaûng töø 47.000 ñeán 57.000 Da vaø coù ñieåm ñaúng ñieän laàn löôït laø 4,3 vaø 4,6. Enzyme töø chuûng AL-128 haàu nhö hoaït ñoäng ôû moâi tröôøng coù noàng ñoä NaCl töø 0,3 ñeán 1,0 M. Coøn moâi tröôøng hoaït ñoäng toái thích cuûa enzyme töø chuûng ATCC 17749 laø söï coù maët cuûa CaCl2 coù noàng ñoä töø 5 ñeán 10 mM.[17] Naêm 2000, Wataru Hashimoto, Osamu Miyake, Keiko Momma, Shigeyuki Kawai vaø Kousaku Murata thuoäc tröôøng Ñaïi hoïc Kyoto, Nhaät Baûn. Nghieân cöùu xaùc ñònh phaân töû löôïng cuûa alginate lyase cuûa Sphingomonas sp. Chuûng A1 laø moät trong nhöõng enzyme caét maïch Alginate. Keát quaû cho thaáy alginate bò caét maïch taïo thaønh caùc oligoalginate bôûi ba loaïi enzyme ( A1-I {66
19 kDa}, A1-2 {25 kDa}, A1-3 {40 kDa}) ñöôïc sinh ra töø teá baøo chaát. Caùc enzyme naøy vaø gene cuûa chuùng ñöôïc phaân laäp töø caùc vi sinh vaät phaùt trieån ôû vuøng coù maët alginate.[19] Yuan-Hong Wang, Guang-Li Yu, Xin-Min Wang, Zhi-Hua LV, Xia Zhao, Zhi Hong Wu, Wei-Shang Ji (2006). Nghieân cöùu söï tinh saïch vaø ñaëc tính cuûa alginate lyase ñöôïc sinh ra töø Vibrio sp. Cho bieát caùc lyase naøy ñöôïc tinh saïch bôûi söï keát hôïp giöõa chaát laéng amonium sulfate vaø diethylaminoethyl trong coät saéc kyù Shephacel. Keát quaû cho thaát phaân töû löôïng cuûa caùc alginate lyase khoaûng 62,5 kDa, vôùi nhieät ñoä vaø pH hoaït ñoäng toái öu laàn löôït laø 250C vaø 7,0. Khaû naêng hoaït ñoäng cuûa lyase taêng khi coù maët EDTA vaø Zn2+, nhöng bò kìm haõm bôûi Ba2+. Lyase naøy ñaëc hieäu caét ñöùt lieân keát beta-D-1,4 manuronic cuûa chuoãi alginate. Xiao Ting Fu, Sang Moo Kim (2007), Khoa Sinh hoïc vaø Coâng ngheä Bieån Tröôøng Ñaïi hoïc Quoác Gia Kangnung, Haøn Quoác, nghieân cöùu tinh saïch vaø tính chaát cuûa alginate lyase töø vi khuaån bieån Agarivorans albus. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy raèng alginate lyase laø moät chuoãi polypeptit coù khoái löôïng phaân töû 60 Kda vaø coù ñieåm ñaúng ñieän laø 5,5 – 5,7. pH vaø nhieät ñoä toái thích cho hoaït ñoäng cuûa enzyme naøy laàn löôït laø 7,0 vaø 400C. Hoaït löïc cuûa enzyme bò maát hoaøn toaøn bôûi söï thaåm tích vaø phuïc hoài trôû laïi khi theâm 0,1 M Na+ hoaëc K+.[21] 1.4. Nhöõng nghieân cöùu veà Oligo alginate (OA) 1.4.1. Nhöõng nghieân cöùu trong nöôùc Năm 2002, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt ñã sản xuất chế phẩm tăng trưởng thực vật T&D bằng cách chiếu xạ tia gamma lên phân tử alginate ñể thu nhận OA có khối lượng phân tử thấp hơn.
20 Naêm 2002, Traàn Thaùi Hoøa vaø Nguyeãn Thò AÙi Nhung ôû Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc, Ñaïi hoïc Hueá nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa oligo alginate ñeán khaû naêng naûy maàm cuûa haït thoùc gioáng. Oligoalginate duøng ñeå thí nghieäm ñöôïc taïo ra baèng 3 phöông phaùp : chieáu xaï, phaân caét baèng kieàm vaø axit maïnh. Keát quaû nhö sau:[10] Cheânh leäch % Taêng % so Ñieåm chaát Toå hôïp noàng Söùc naûy STT so vôùi maãu ñoái vôùi ñoái löôïng caây ñoä toái öu maàm (%) chöùng chöùng maàm 1 A1 50ppm 92,4 + 10,5 111,3 9 2 A2 40ppm 91,6 + 9,7 111,8 9 3 A3 30ppm 94,7 + 12,8 115,6 9 4 Ñoái chöùng 81,9 7 Baûng 1.4.1. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä Oligo alginate ñeán khaû naêng naûy maàm cuûa haït thoùc gioáng Naêm 2005 cuõng taïi Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc Hueá, taùc giaû Voõ Thò Mai Höông cuõng ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa OA ñeán söï phaùt trieån cuûa moät soá gioáng caây ngaén ngaøy vaø coù keát luaän nhö sau: − Oligoalginate coù khaû naêng kích thích söï sinh tröôûng, taêng söï tích luõy chaát khoâ vaø naêng ñeû nhaùnh cuûa luùa. Taïi noàng ñoä OA 80 ppm haøm löôïng chaát khoâ ñaït cao nhaát (taêng 25,40% so vôùi ñoái chöùng), soá nhaùnh/caây cao nhaát (taêng 21,10%) vaø troïng löôïng haït/chaäu cao nhaát (taêng 32,41). − OA theå hieän roõ reät taùc duïng kích thích leân sinh tröôûng cuûa caây ngoø. Noàng ñoä OA toái thích laø 60 ppm. Taïi noàng ñoä naøy troïng löôïng töôi cuûa ngoø taêng 165,145%, naêng suaát taêng 60,76%. Taát caû caùc loâ coù xöû lyù OA ñeàu coù naêng suaát cao hôn so vôùi ñoái chöùng.