Luận văn thạc sĩ Sinh học với đề tài "Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có hoạt tính Chitinase cao tại tỉnh Đắk Lắk" trình bày nội dung thông qua các chương sau: chương 1 tổng quan tài liệu, chương 2 nội dung và phương pháp nghiên cứu, chương 3 kết quả và thảo luận.
AMBIENT/
Chủ đề:
Nội dung Text: Luận văn thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có hoạt tính Chitinase cao tại tỉnh Đắk Lắk
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
s
NGUYỄN VĂN BỐN
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT
SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH
CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
NGUYỄN VĂN BỐN
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT
SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH
CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 604230
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng
BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011
- LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào
khác.
Người cam ñoan
Nguyễn Văn Bốn
- LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn:
Thầy PGS.TS Nguyễn Anh Dũng ñã dành nhiều thời gian, tận tình hướng dẫn tôi
trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn này.
Cô TS. Võ Thị Phương Khanh, thầy TS. Ngô Đại Nghiệp ñã có nhiều ý kiến quý
báu ñóng góp, giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Quý thầy cô giáo trường Đại học Tây Nguyên, khoa KHTN và CN, Phòng Đào
tạo Sau ñại học, ban giám hiệu nhà trường ñã tận tình giảng dạy và tạo ñiều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian khoá học.
Các bạn sinh viên: Hạnh, Vui, Cương, Cường, Lữ lớp CN Sinh K07 và Được,
Thảo, Hoài, Danh, Lựu, Ana, Oánh, Luận lớp CN Sinh K08 ñã tham gia tích cực trong
quá trình tôi thực hiện ñề tài này.
Các thầy cô trong bộ môn Sinh học thực nghiệm ñã tạo mọi ñiều kiện về thời
gian, ñộng viên tinh thần cho tôi trong suốt khóa học.
Các anh chị em trong lớp Cao học Sinh học thực nghiệm K3 ñã ñoàn kết giúp ñỡ,
chia sẻ và ñộng viên tôi trong suốt 3 năm học cao học.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sâu sắc những người thân trong gia ñình: Bố, mẹ, Các
anh trai, các chị dâu, các cháu, vợ và con trai, gia ñình bố mẹ vợ ñã là chỗ dựa vững
chắc cho tôi về tình cảm cũng như vật chất cần thiết giúp tôi có nghị lực ñể công tác,
và phấn ñấu.
Nguyễn Văn Bốn
- CÁC CHỮ VIẾT TẮT
- HTch: Hoạt tính chung chitinase
- HTr: Hoạt tính riêng chitinase
- [chitin]: Nồng ñộ chitin
- ĐC: Đối chứng
- GlcNAc: N-acetyl glucosamine
- DNS: Acid 3,5 dinitrosalicylic
- UI: ñơn vị hoạt ñộ
- MỤC LỤC
Mở ñầu
1. Đặt vấn ñề 1
2. Mục tiêu của ñề tài 1
3. Ý nghĩa khoa học 2
4. Ý nghĩa thực tiễn 2
Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Tổng quan về chitin và chitinase 3
1.1.1. Chitin 3
1.1.1.1. Cấu tạo chitin 3
1.1.1.2. Phân bố và số lượng 3
1.1.1.3. Đặc ñiểm khác 4
1.1.1.4. Ứng dụng 5
1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) 6
1.2.1. Khái niệm 6
1.2.2. Phân loại chitinase 7
1.2.2.1. Dựa vào cấu trúc phân tử 7
1.2.2.2. Dựa vào trình tự amino acid 7
1.2.2.3. Dựa vào phản ứng phân cắt 9
1.2.3. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase 9
1.2.3.1. Chitinase vi khuẩn 9
1.2.3.2. Chitinase nấm 10
1.2.3.3. Chitinase thực vật 10
1.2.3.4. Chitinase ñộng vật 11
1.2.4. Các ñặc tính cơ bản của enzyme chitinase 11
1.2.4.1. Khối lượng phân tử 11
1.2.4.2. Điểm ñẳng ñiện - Phổ hấp thu - Hằng số Michaelis 11
1.2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ 12
- 1.2.4.4. Ảnh hưởng của pH 12
1.2.4.5. Chất tăng hoạt, chất ức chế 12
1.2.4.6. Sự ổn ñịnh 14
1.2.5. Các loại cơ chất của enzyme chitinase 14
1.2.5.1. Chitin 14
1.2.5.2. Các dẫn xuất của chitin 14
1.2.6. Cơ chế tác ñộng của các loại enzyme chitinase 15
1.3. Tổng quan về nấm mốc 15
1.3.1. Khái niệm 15
1.3.2. Hình dạng và kích thước 16
1.3.3. Cấu tạo tế bào sợi nấm 17
1.3.4. Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc 17
1.3.5. Vị trí và vai trò của nấm mốc 18
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 19
Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nội dung nghiên cứu 23
2.2. Vật liệu và thiết bị 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu 23
2.3.1. Địa ñiểm thu thập mẫu 23
2.3.2. Các loại môi trường 23
2.3.3. Phương pháp phân lập 24
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 24
2.3.5. Xác ñịnh hoạt ñộ chitinase theo phương pháp ñịnh lượng ñường khử
25
với thuốc thử DNS
2.3.6. Phương pháp ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 28
2.3.7. Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc
28
tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao
2.3.8. Nghiên cứu xác ñịnh tác nhân tủa phù hợp 29
2.3.9. Xác ñịnh tính chất cơ bản của chitinase 30
2.3.9. Xử lý số liệu 33
Chương 3. Kết quả và thảo luận
- 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase tại Đăk Lăk 34
3.2. Tuyển chọn và ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37
3.2.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37
3.2.2. Định danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 40
3.3. Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc
42
tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao
3.3.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin trong môi trường nuôi cấy 42
3.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy 43
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy 45
3.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 46
3.3.5. Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc 48
3.3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 49
3.4. Tác nhân tủa phù hợp cho quá tình tách chiết chitinase từ nấm mốc
50
Penicillium janthinellum
3.5. Xác ñịnh một số tính chất cơ bản của chitinase từ nấm mốc
52
Penicillium janthinell
3.5.1. Xác ñịnh nhiệt ñộ tối ưu cho hoạt tính chitinase 52
3.5.2. Xác ñịnh pH tối ưu cho hoạt tính chitinase 53
3.5.3. Xác ñịnh nồng ñộ cơ chất tối ưu cho hoạt tính chitinase 54
3.5.4. Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase 56
3.5.5. Xác ñịnh thời gian phản ứng tối ưu 57
3.5. Tinh sạch chitinase 58
Kết luận và kiến nghị 61
Tài liệu tham khảo 62
Phụ lục 67
- DANH MỤC BẢNG
Bảng 3 .1. Đặc ñiểm khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk .....34
Bảng 3.2. Hàm lượng ñường khử trong dịch nuôi cấy và hoạt tính chitinase của các
chủng nấm mốc ....................................................................................................37
Bảng 3.3. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
nồng ñộ chitin khác nhau......................................................................................43
Bảng 3.4. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy bổ sung
các nguồn nitơ khác nhau .....................................................................................44
Bảng 3.5. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
nhiệt ñộ khác nhau ...............................................................................................46
Bảng 3.6. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
pH khác nhau .......................................................................................................47
Bảng 3.7. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
tốc ñộ lắc khác nhau .............................................................................................48
Bảng 3.8. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy trong
các khoảng thời gian khác nhau ............................................................................49
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tác nhân tủa ñến hiệu suất thu hồi và hoạt tính chitinase của
nấm mốc Penicillium janthinellum .......................................................................51
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase ..............55
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ñến hoạt tính chitinase .................57
Bảng 3.12. Hàm lượng protein, HTch, HTr trước và sau khi lọc gel .....................59
- DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của chitin .................................................................................3
Hình 2.1. Phản ứng phân cắt chitin bằng chitinase ...............................................25
Hình 2.2. Phản ứng của ñường khử với thuốc thử DNS .......................................25
Hình 3.1. Hoạt tính chitinase của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk ...............39
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin ñến hoạt tính chitinase .........................43
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ ñến hoạt tính chitinase ..............................44
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase .....................46
Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase ..........47
Hình 3.6. Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến hoạt tính chitinase.................................49
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase .....................49
Hình 3.8. Ảnh hưởng của tác nhân tủa ñến hiệu suất thu hồi protein và hoạt tính
chitinase của nấm mốc Penicillium janthinellum ....................................52
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ phản ứng ñến hoạt tính chitinase ....................53
Hình 3.10 . Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính chitinase ........................................54
Hình 3.11 . Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin ñến hoạt tính chitinase .......................55
Hình 3.12 . Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase ...............56
Hình 3.13 . Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ñến hoạt tính chitinase ................57
Hình 3.14 . Kết quả ño mật ñộ quang dịch protein sau lọc gel Sephadex ..............59
Hình 3.15 . Ảnh hưởng của phương pháp lọc gel tới hàm lượng protein, HTch, HTr
của chitinase ..........................................................................................60
Hình 3.16 . Kết quả ño mật ñộ quang dịch protein sau tinh sạch bằng cột chitin ..60
Hình 3.17 . Hình 3.17. Vòng phân giải chitin .......................................................60
- DANH MỤC ẢNH
Ảnh 3.1 Khuẩn lạc của 34 chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk.........................37
Ảnh 3.2 Hình thái của 3 chủng nấm mốc D4, D9, D31 ........................................41
- MỞ ĐẦU
- 1
- 2
- 1
1. Đặt vấn ñề
Oligo N – acetyl – Glucosamine (một sản phẩm của quá trình thủy phân chitin)
ñã ñược biết ñến như một loại thuốc quý, một loại thuốc ña hiệu ñược sử dụng ñể
chữa trị nhiều bệnh như: bệnh khớp, bệnh viêm phổi, bệnh viêm dạ dày,...Ngoài ra,
Oligo N- acetyl – Glucosamine còn có khả năng chống khối u, kháng nấm và
kháng vi khuẩn [1]. Chính vì có ñặc tính quý như vậy mà việc sản xuất Oligo N –
acetyl – Glucosamine ñang ñược quan tâm.
Oligo N – acetyl – Glucosamine ñược thu nhận bằng cách thủy phân chitin dưới
sự xúc tác của enzyme chitinase. Trong tự nhiên, chitinase có thể ñược tách chiết
từ nhiều nguồn khác nhau: ñộng vật (tuyến tuỵ, và dịch dạ dày cá; dịch ruột của ốc
sên;...), thực vật (mủ cao su, thuốc lá, lúa mì, cà rốt,...), các loài chân khớp
(arthropods) [17]...Tuy nhiên, quy trình thu nhận chitinase từ các nguồn này khá
phức tạp, không thể tiến hành tự ñộng hoá [25][26], do ñó giá thành chế phẩm cao
và cũng không thể ñáp ứng ñủ nhu cầu thực tế .
Trong tự nhiên, còn có một nguồn quý giá và vô tận ñể thu nhận enzyme. Đó
chính là vi sinh vật. Trong số các ñối tượng vi sinh vật, nấm mốc là một nguồn khá
phổ biến ñể thu nhận nhiều loại enzyme, trong ñó có chitinase [25].
Trong nước cũng như trên thế giới ñã có nhiều công trình nghiên cứu về
chitinase [13]. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào về phân lập và
sàng lọc các chủng nấm mốc ñể thu nhận chitinase mang tính hệ thống ở khu vực
Tây Nguyên, cụ thể là ở Đắk Lắk ñược công bố trên các tạp chí trong và ngoài
nước. Để góp phần tham gia vào việc nghiên cứu enzyme chitinase từ vi sinh vật
tại Tây Nguyên, chúng tôi ñề xuất ñề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng
nấm mốc có hoạt tính chitinase cao tại tỉnh Đắk Lắk”.
2. Mục tiêu của ñề tài
- Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải chitin.
- Xây dựng quy trình tách chiết chitinase và xác ñịnh một số tính chất cơ bản
của chitinase tách chiết từ môi trường nuôi cấy nấm mốc.
- 2
3. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của ñề tài góp phần vào việc nghiên cứu enzyme chitinase từ vi sinh
vật cụ thể là từ nấm mốc trên ñịa bàn tỉnh Đắk Lắk.
4. Ý nghĩa thực tiễn
Sản phẩm của ñề tài là một số chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao ñược
tuyển chọn. Từ các chủng này, có thể ñưa vào sản xuất chitinase thương phẩm
dùng cho nhiều mục ñích khác nhau hoặc sử dụng trực tiếp các chủng này ñể khảo
sát khả năng ñối kháng với một số nấm bệnh hướng tới tạo chế phẩm sinh học có
hoạt tính kháng bệnh cho cây trồng.
- 3
- Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
- 2
- 3
1.1. Tổng quan về chitin và chitinase
1.1.1. Chitin [17][23]
1.1.1.1. Cấu tạo chitin
Chitin có công thức hóa học (C8H13NO5)n trong ñó C chiếm 47,29%, H
chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O chiếm 39,37%. Ở dạng tự nhiên, chitin là một
chất rắn màu trắng vô ñịnh hình, dai, có sợi, phụ thuộc vào nguồn gốc và phương
pháp thu nhận.
Về cấu trúc, chitin (còn gọi là poly-[1,4-(N-acetyl-β-D-glucosamine)])
là một polysaccharide bao gồm các gốc N-acetyl-D-glucosamine [GlcNAc],
còn gọi là (1->4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose] gắn với nhau bằng liên
kết β-1,4-O-glycoside.
Hình 1.1. Cấu trúc của chitin
Về mặt cấu trúc lập thể, chitin có 3 dạng: α, β, δ. Sự khác nhau này biểu
hiện ở sự sắp xếp các chuỗi. Ở α-chitin các chuỗi xuôi và ngược xen kẽ nhau, ở β-
chitin thì cùng hướng và ở δ-chitin có 2 chuỗi xuôi xen kẽ với 2 chuỗi ngược. Dạng
chiếm nhiều nhất là α-chitin.
1.1.1.2. Phân bố và số lượng
Chitin có mặt ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau. Ở nấm, chitin là thành phần
chính yếu và kết hợp với các hợp chất khác tạo ra thành của khuẩn ty và bào tử
nấm sợi như: Chytridiaceae, Blastodiaceae, Ascomycetes, Basidiomycetes. Ở
những loài ñộng vật không xương sống như: Crustacea (giáp xác), Onychophora
(nhóm có móng), Myriapoda (ña túc) và Arachnida (nhện), chitin ñóng vai trò là
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
