Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn từ rong biển có khả năng sinh enzyme chuyển hóa Alginate từ rong nâu Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:104

Thêm vào BST

Báo xấu

34
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học "Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn từ rong biển có khả năng sinh enzyme chuyển hóa Alginate từ rong nâu Việt Nam" trình bày các nội dung chính sau: Tìm và định danh được chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ rong biển, có khả năng sinh alginate lyase; Xác định khả năng bẻ ngắn mạch alginate của enzyme thu nhận được trên cơ chất alginate chiết xuất từ rong nâu Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn từ rong biển có khả năng sinh enzyme chuyển hóa Alginate từ rong nâu Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Xuân Viễn NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN TỪ RONG BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME CHUYỂN HÓA ALGINATE TỪ RONG NÂU VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Xuân Viễn NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN TỪ RONG BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME CHUYỂN HÓA ALGINATE TỪ RONG NÂU VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: TS. Cao Thị Thúy Hằng Hướng dẫn 2: PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân Hà Nội - 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Cao Thị Thúy Hằng và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân. Các số liệu nêu trong luận văn là kết quả làm việc của tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. Nha Trang, ngày 14 tháng 12 năm 2021 Tác giả luận văn Nguyễn Xuân Viễn
LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Cao Thị Thúy Hằng và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân, những người đã tận tình hướng dẫn khoa học, giúp đỡ tôi và định hướng nghiên cứu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Và tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh, chị phòng Hóa phân tích và Triển khai công nghệ, phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã giúp tôi hoàn thành tốt phần thực nghiệm của mình và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Phòng Đào tạo, Khoa Công nghệ sinh học và Quý Thầy Cô giáo đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn cũng như hoàn thành các thủ tục cần thiết. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang tạo nhiều điều kiện thuận lợi, hỗ trợ hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Nha Trang, ngày 14 tháng 12 năm 2021 Tác giả luận văn Nguyễn Xuân Viễn
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Thông tin đầy đủ Å Angstrom AOS Alginate oligosaccharide CPC Cetyl pyridinium clorua DNS Dinitrosalicylic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Endolytic Enzyme nội bào Exolytic Enzyme ngoại bào G Acid α-L-guluronic KI Kali iodide KLPT Khối lượng phân tử M Acid β-D-mannuronic MB Marine broth MBA Marine broth alginate mM mmol Olygo oligosaccharide Poly M β-D-mannuronate Poly G α-L-guluronate G Poly MG heteropolymer S. mcc A Alginate chiết xuất từ rong Sargassum mcclurei T. o A Alginate chiết xất từ rong Turbinaria ornata
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Hàm lượng acid alginic (% Rong khô tuyệt đối) ở vùng biển Khánh Hòa ...................................................................................... 11 Bảng 1.2. Nguồn phân lập một số vi khuẩn biển sinh alginate lyase ............. 22 Bảng 1.3. Đặc tính xúc tác của một số alginate lyase từ vi khuẩn biển.......... 24 Bảng 3.1. Kết quả thí nghiệm phân lập các chủng vi khuẩn biển................... 43 Bảng 3.2. Hoạt tính alginate lyase của chủng vi khuẩn biển phân lập từ các mẫu rong nâu thu thập tại vùng biển Khánh Hòa ................... 52 Bảng 3.3. Trình tự tương đồng của các chủng vi khuẩn biển ......................... 56 Bảng 3.4. Kết quả sơ bộ thu nhận alginate lyase ............................................ 61
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Nguồn gốc alginate ........................................................................... 8 Hình 1.2. Cấu trúc của β-D-mannuronic acid (M), α-L-guluronic acid (G) của phân tử alginate .......................................................................... 9 Hình 1.3. Cấu trúc của các block và liên kết (1- 4) glycoside giữa các uronic của phân tử alginate.. ........................................................... 10 Hình 2.1. Các mẫu rong thu được ở vùng biển Khánh Hòa............................ 30 Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát của đề tài ............................................ 33 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn biển từ rong biển...................... 35 Hình 2.4. Đường chuẩn albumin ..................................................................... 38 Hình 3.1. Hình ảnh các khuẩn lạc phân lập từ mẫu rong S. oligocystum mọc trên đĩa môi trường MBA ....................................................... 41 Hình 3.2. Đĩa môi trường MBA sau khi nhuộm bởi thuốc nhuộm Gram’s iodine ................................................................................. 41 Hình 3.3. Số lượng chủng vi khuẩn biển phân lập được từ các nguồn rong nâu........................................................................................... 42 Hình 3.4. Thống kê các nhóm kích thước khuẩn lạc của chủng vi khuẩn biển được phân lập từ các mẫu rong nâu thu tại vùng biển Khánh Hòa ..................................................................................... 48 Hình 3.5. Thống kê các nhóm màu sắc khuẩn lạc của chủng vi khuẩn được phân lập theo tỷ lệ %............................................................. 49 Hình 3.6. Thống kê về tỷ lệ độ đục, độ cao khuẩn lạc của chủng vi khuẩn biển được phân lập ......................................................................... 50 Hình 3.7. Thống kê về tỷ lệ các dạng bề mặt khuẩn lạc chủng vi khuẩn biển được phân lập .......................................................................... 50 Hình 3.8. Hoạt tính alginate lyase của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên đĩa thạch MBA trong quá trình nhuộm (A) và sau khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Gram’s iodine (B). ............................... 52 Hình 3.9. Số lượng và tỷ lệ các chủng vi khuẩn sinh hoạt tính alginate lyase phân lập được từ các mẫu rong ở vùng biển Khánh Hòa. ..... 54
Hình 3.10. Cây phát sinh loài dựa vào trình tự đoạn gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn biển. ................................................................ 58 Hình 3.11. Hoạt tính dịch chiết nội bào và ngoại bào của chủng vi khuẩn B. velezensis R8BF10 trên môi trường đĩa thạch alginate chiết từ rong S. mcclurei, đối chứng âm là môi trường MB không chứa vi khuẩn, đối chứng dương là alginate lyase ngoại bào của chủng B. velezensis AlgSm1 và alginate lyase của Sigma ....... 60 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của BalyA ........................ 62 Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của BalyA .............................. 63 Hình 3.14. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của BalyA .................. 64 Hình 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính của BalyA ............... 64 Hình 3.16. Kết quả điện di C-PAGE của alginate chiết từ rong S. mcclurei, T. ornata và phản ứng giữa alginate và alginate lyase sau 24h phản ứng. ......................................................................................... 65
1 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỤC LỤC ......................................................................................................................1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................................5 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................8 1.1. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE ..........................................................................8 1.1.1. Giới thiệu chung alginate ................................................................... 8 1.1.1.1. Nguồn gốc và cấu trúc của alginate ............................................... 8 1.1.1.2. Đặc điểm về alginate của rong nâu Việt Nam .............................. 11 1.1.1.3. Hoạt tính sinh học của alginate và alginate KLPT thấp .............. 12 1.1.1.4. Các ứng dụng của alginate và alginate KLPT thấp ..................... 13 1.1.2. Các phương pháp điều chế alginate KLPT thấp .............................. 15 1.1.2.1. Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp hóa học .......... 15 1.1.2.2. Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp vật lý .............. 15 1.1.2.3. Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp enzyme ........... 16 1.2. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE .........................................................17 1.2.1. Định nghĩa về alginate lyase ............................................................ 17 1.2.2. Phân loại alginate lyase ................................................................... 17 1.2.3. Nguồn thu nhận alginate lyase ......................................................... 18 1.2.4. Các phương pháp xác định hoạt tính alginate lyase ........................ 19
2 1.2.4.1. Phương pháp đĩa thạch................................................................. 19 1.2.4.2. Phương pháp đo độ đục ................................................................ 20 1.2.4.3. phương pháp đo độ nhớt ............................................................... 20 1.2.3.4. Phương pháp đường khử .............................................................. 21 1.2.3.5. Phương pháp đo độ hấp thụ bước sóng ........................................ 21 1.3. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE TỪ VI KHUẨN BIỂN ................22 1.3.1. Nguồn phân lập vi khuẩn biển sinh alginate lyase .......................... 22 1.3.2. Đặc tính xúc tác của một số alginate lyase từ vi khuẩn biển ........... 23 1.3.3. Tình hình nghiên cứu alginate lyase từ vi khuẩn biển ở Việt Nam . 28 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...30 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ................................................30 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU .........................................................................................30 2.2.1 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................... 30 2.2.1.1. Nguồn cơ chất ............................................................................... 30 2.2.1.2 Nguồn phân lập vi khuẩn biển ....................................................... 30 2.2.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm ............................................................ 31 2.2.3. Môi trường nuôi cấy ........................................................................ 31 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................................33 2.3.1. Xử lý mẫu ........................................................................................ 33 2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn biển từ rong biển .......................... 34 2.3.3. Phương pháp sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh alginate lyase. ............................................................................................. 35 2.3.4. Phương pháp định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn....................... 36 2.3.5. Phương pháp xác định khả năng bẻ mạch alginate của enzyme thu được từ chủng vi khuẩn tuyển chọn trên cơ chất alginate ................... 36
3 2.3.5.1. Phương pháp lên men vi khuẩn biển để thu nhận alginate lyase . 36 2.3.5.2. Phương pháp thu nhận alginate lyase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn ............................................................................................................ 37 2.3.5.3. Phương pháp xác định đặc tính xúc tác của enzyme .................... 38 2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................... 40 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................41 3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN .....................................41 3.2. KẾT QUẢ SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN THEO ĐỊNH HƯỚNG SINH ALGINATE LYASE ................51 3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN TUYỂN CHỌN.....55 3.3.1. So sánh trình tự 16S rDNA của chủng vi khuẩn biển với các chủng trên ngân hàng gen (NCBI) ............................................................. 55 3.3.2. Xây dựng cây phát sinh loài. ........................................................... 58 3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA ALGINATE LYASE TỪ CHỦNG VI KHUẨN BIỂN TUYỂN CHỌN ................................................................................................................60 3.4.1. Kết quả chiết xuất sơ bộ alginate lyase từ chủng vi khuẩn biển B. velezensis R8BF10................................................................................. 60 3.4.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của BalyA ......................................................................................................... 61 3.4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của BalyA ........ 62 3.4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của BalyA. ........................................................................................................ 63 3.4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl đến hoạt tính của enzyme. ...................................................................................................... 64 3.4.6. Kết quả xác định khả năng phân cắt alginate của enzyme thu nhận được ................................................................................................... 65
4 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..........................................................66 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................ 66 4.2. KIẾN NGHỊ....................................................................................... 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................68 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Sắc ký đồ, bảng số liệu và các hinh ảnh thực nghiệm nghiên cứu Phụ lục 2. Trình tự 16S rDNA của các chủng vi khuẩn biển tuyển chọn. Phụ lục 3. Các dãy trình tự gen so sánh độ tương đồng 16S rDNA của 03 chủng vi khuẩn biển phân lập được bằng công cụ Blast tương ứng với các chủng vi khuẩn trên ngân hàng Genbank NCBI.
5 MỞ ĐẦU Alginate là một anion polysaccharide, phân bố rộng rãi trong thành tế bào của rong nâu và một số loài vi khuẩn, bao gồm cả Pseudomonas aeruginosa và Azotobacter vinelandii [1]. Đây là polysaccharide dị trùng hợp bao gồm hai axit uronic: α-L-guluronic (G) và β-D-mannuronic (M) sắp xếp với nhau thành các khối β-D-mannuronate (poly M), α-L-guluronate G (poly G) và heteropolymer (polyMG), các uronic acid này được liên kết với nhau thông qua liên kết 1,4-glycosidic [1], [2]. Alginate đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm do các đặc tính vật lý độc đáo của nó là tạo thành gel. Trong khi đó, rong nâu được xem là nguồn nguyên liệu chính để điều chế và chiết xuất alginate. Ở rong nâu hàm lượng alginate chiếm tỷ lệ lên đến 40 % và có khối lượng phân tử (KLPT) lớn. Ở dạng muối alginate bán trên thị trường có KLPT từ 30.000 - 400.000 Da, độ nhớt cao nên nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu điều chế alginate KLPT thấp với mục đích tăng khả năng ứng dụng trong lĩnh vực y dược cũng như trong việc nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng[2], [3]. Alginate KLPT thấp (alginate oligosaccharide) được điều chế bằng các phương pháp hóa học, vật lý hoặc phương pháp sinh học. Trong đó, việc sử dụng các enzyme cắt mạch alginate được xem là “phương pháp xanh” do hạn chế sử dụng hóa chất, sản phẩm alginate KLPT thấp không có độc tính sản phẩm tạo ra được kiểm soát bởi đặc tính xúc tác của enzyme. Alginate lyase là enzyme có khả năng xúc tác cắt mạch alginate bằng sự khử liên kết glucoside để tạo ra các oligo alginate. Vi khuẩn biển là nguồn chính để thu nhận enzyme vì có nhiều ưu điểm vượt trội về chất lượng cũng như khả năng sản xuất alginate lyase [4]. Một số chủng vi khuẩn có thể kể đến: gram dương là Bacillus circulans và gram âm là Azotobacter vinelandii, Klebsiella aerogens, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa đã được nghiên cứu cho sản xuất alginate lyase [5]. Vi khuẩn là sinh vật có khả năng sinh sản nhanh, phát triển mạnh, thích ứng tốt với điều kiện công nghiệp. Môi trường dinh dưỡng
6 để nuôi vi khuẩn đơn giản, dễ kiếm. Do đó, enzyme thu được từ việc nuôi vi khuẩn sẽ nhanh hơn, giá thành rẻ hơn. Các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh alginate lyase chủ yếu được phân lập từ bộ phận tiêu hóa của động vật biển như cầu gai, san hô mềm, những loài động vật hai mảnh vỏ, nước biển và hải miên [6]. Sở dĩ được tìm kiếm ở những vật chủ như vậy vì đây là những loài sử dụng rong tảo làm thức ăn, hệ vi sinh vật đường ruột những loài này luôn có một hoặc một hệ vi khuẩn sinh alginate lyase để hỗ trợ chuyển hóa thức ăn. Một nguồn phân lập vi khuẩn biển sinh alginate lyase khác chính là vi khuẩn cộng sinh với rong nâu bởi vì alginate là thành phần chủ yếu trong cấu tạo thành tế bào rong nâu. Đã có những công bố về các chủng vi khuẩn biển cộng sinh với rong nâu có khả năng sinh alginate lyase như Pseudoalteromonas elyakoii IAM 14594 phân lập từ rong Laminaria japonica [7], Pseudoalteromonas sp. SM0524 phân lập tảo bẹ trong giai đoạn phân hủy [8]. Do đó, nguồn rong nâu là nguồn tiềm năng để tìm kiếm vi khuẩn biển sinh alginate lyase. Ở Việt Nam, rong nâu với khả năng có thể tự tái tạo trong tự nhiên và sản lượng có thể khai thác lên tới 10.000 tấn khô/năm nên rong nâu là nguồn lợi rong biển tự nhiên lớn nhất [9]. Các nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy trong các loài rong nâu ở vùng biển Việt Nam, hàm lượng alginate lên đến 35% và có cấu trúc phức tạp theo 3 dạng cấu trúc block gồm: block M, block G và block MG sắp xếp khác nhau tùy vào từng loài rong [9]. Trong khi đó, alginate lyase thương mại giá thành cao và xúc tác không hiệu quả lên alginate của rong nâu Việt Nam. Vì vậy, khả năng ứng dụng enzyme thương mại vào việc điều chế alginate KLPT thấp ở Việt Nam là khó khăn nên việc nghiên cứu enzyme chuyển hóa alginate từ rong nâu Việt Nam vẫn là cần thiết. Do vậy, đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn từ rong biển có khả năng sinh enzyme chuyển hóa alginate từ rong nâu Việt Nam” được tiến hành nhằm tìm ra được chủng vi khuẩn biển tiềm năng có khả năng sinh alginate lyase có hoạt tính trên cơ chất alginate chiết xuất từ rong nâu vùng biển Việt Nam.
7 Mục tiêu của đề tài: Tìm và định danh được chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ rong biển, có khả năng sinh alginate lyase. Xác định khả năng bẻ ngắn mạch alginate của enzyme thu nhận được trên cơ chất alginate chiết xuất từ rong nâu Việt Nam. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: - Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh alginate lyase được phân lập từ rong nâu thu nhận ở vùng biển Khánh Hòa - Phạm vi nghiên cứu: Khả năng sinh alginate lyase trên cơ chất alginate chiết xuất từ rong nâu Việt Nam như các loài rong thuộc chi Sargassum và Turbinaria. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài: Tìm kiếm các chủng vi khuẩn biển sinh alginate lyase có hoạt tính cao nhằm điều chế alginate KLPT thấp là cách tiếp cận mới có ý nghĩa khoa học cao bên cạnh các phương pháp hóa lý điều chế alginate KLPT thấp. Alginate lyase từ vi khuẩn biển cắt mạch alginate theo đặc hiệu cơ chất, từ đó định hướng tạo ra các sản phẩm alginate KLPT thấp có hoạt tính sinh học ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, y tế. Các nội dung nghiên cứu chính: Để thực hiện được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: - Phân lập các chủng vi khuẩn từ các loài rong nâu thu thập được ở vùng biển Khánh Hòa. - Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ các loài rong nâu thu thập được ở vùng biển Khánh Hòa theo định hướng sinh alginate lyase. - Định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn. - Xác định khả năng bẻ ngắn mạch alginate của enzyme thu nhận từ chủng vi khuẩn tuyển chọn.
8 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE 1.1.1. Giới thiệu chung alginate 1.1.1.1. Nguồn gốc và cấu trúc của alginate Alginate là thuật ngữ chung để nói đến alginic acid, muối và dẫn xuất của nó. Trong tự nhiên alginate tồn tại chủ yếu ở rong nâu, là thành phần cấu trúc của thành tế bào rong nâu (phaeophyceae), ngoài ra còn có ở vi khuẩn như Pseodomonas, Azotobacter,… (Hình 1.1). Ở vi khuẩn, alginate là polyme duy trì sự ổn định của màng sinh học và thành tế bào nhằm chống lại sự bất lợi của môi trường như độc tính của kim loại nặng. Sản xuất và sử dụng alginate trên thị trường chủ yếu được chiết xuất từ rong nâu vì sinh khối alginate chiếm tỷ lệ cao lên đến 40% trọng lượng khô của rong nâu và thường tồn tại dạng muối natri alginate, KLPT alginate từ 30.000 Da đến 400.000 Da. Năm 1883, Stanford đã khám phá ra alginate từ tảo bẹ, ông đã phát triển quy trình chiết xuất kiềm từ vật liệu có độ nhớt gọi là “Algin” [10]. Alginate Rong nâu Vi khuẩn Macrocystis Sagassum Laminaria Azotobacter Pseodomonas Hình 1.1. Nguồn gốc alginate Alginate được tạo thành bởi các monosaccharide β-D-mannuronic acid (M) và α-L-guluronic acid (G) thông qua liên kết thành từ liên kết (1→4)
9 glycoside (hình 1.2). Trong phân tử alginate tỷ lệ, trình tự và sự phân bố của hai monomer thay đổi rất rộng tùy theo nguồn gốc của alginate. Sự sắp xếp ngẫu nhiên của 2 monomer M và G trong mạch alginate theo 3 dạng cấu trúc block: Block homopolymeric guluronic (Poly-G) gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau; Block homopolymeric mannuronic (Poly-M) gồm các gốc acid mannuronic nối tiếp nhau; Block heteropolymeric ngẫu nhiên (Poly-MG) hai gốc acid guluronic và acid mannuronic luân phiên nối tiếp nhau (hình 1.3) [11, [12], [13], [14], [15]. Độ dài trung bình của các khối, trình tự của chúng trong mạch phân tử cũng thay đổi tùy theo nguồn gốc của alginate. Do cấu trúc của các gốc monomer G và M khác nhau nên hình dạng của các khối cũng khác nhau: Poly M có cấu tạo ít gấp khúc và tạo nên sự mềm mại của mạch phân tử, trong khi poly G gấp khúc mạnh hơn và có độ bền chặt hơn. Chính sự khác nhau của mạch cấu trúc này nên hai loại uronic thể hiện các tính chất hóa học, sinh học khác nhau [16]. Hình 1.2. Cấu trúc các β-D-mannuronic acid (M), α-L-guluronic acid (G) của phân tử alginate [16]
10 Hình 1.3. Cấu trúc của các block và liên kết (1→4) glycoside giữa các uronic của phân tử alginate [16] Hiện tại alginate được sử dụng trên thị trường có độ đồng nhất về mặt lý hóa thấp, điều này làm ảnh hưởng đến chất lượng và hạn chế khả năng ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực của sự sống. Tùy vào cấu trúc, thành phần của alginate mà chúng có những đặc tính lý hóa khác nhau như KLPT, độ nhớt, độ hòa tan. Alginate có nguồn gốc khác nhau thì tỷ lệ block G và M khác nhau. Khi alginate có chứa nhiều block G hơn, KLPT cao hơn thì khả năng tạo gel mạnh hơn và giòn hơn [19].
11 Acid alginic không tan trong nước và dung môi hữu cơ, trong khi muối đơn chất của alginate và ester alginate tan trong nước tạo thành các dung dịch nhớt, ổn định [20]. Độ tan của alginate còn phụ thuộc vào pH (pH giảm thì alginate sẽ kết tủa), cường độ ion và hàm lượng của ion tạo gel [20], [21]. Alginate có cấu trúc khối MG hòa tan ở pH thấp hơn so với các poly M hoặc poly G. Ngoài KLPT, khả năng tạo dung dịch nhớt của alginate có thể thay đổi tùy theo nồng độ, pH dung môi, nhiệt độ và sự hiện diện của các ion hóa trị II. Chính vì vậy mà mỗi loại alginate được lựa chọn để ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. 1.1.1.2. Đặc điểm về alginate của rong nâu Việt Nam Ở Việt Nam, rong nâu là nhóm rong có kích thước lớn (macroalgae), chủ yếu gồm 4 chi Sargassum, Turbinaria, Dictyota, Padina sản lượng tự nhiên cao nhất so với các nhóm rong biển khác. Alginate chiết xuất từ rong nâu ở nước ta chủ yếu tập trung vào chi Sargassum, Turbinaria do hàm lượng alginate và độ nhớt cao đạt yêu cầu về chất lượng alginate thương mại. Bảng 1.1. Hàm lượng acid alginic (% Rong khô tuyệt đối) ở vùng biển Khánh Hòa [22] Địa điểm Hàm lượng acid TT Loài rong alginic 1 Sargassum mcclurei Hòn Chồng 35,9 2 Sargassum kjellmanianum Hòn Chồng 33,9 3 Sargassum polycystum Hòn Chồng 33,8 4 Sargassum congkinhii Hòn Chồng 26,6 5 Turbinaria ornata Hòn Chồng 39,4 Ở một số loài rong thuộc chi Sargassum và Turbinaria, hàm lượng alginate cao nhất ở loài T. ornata (39,4%), tiếp theo là S. mcclurei (35,9%) và
12 thấp nhất ở loài S. congkinhii (26,6%) [22]. Chính vì vậy hai loài rong T. ornata và S. mcclurei là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất alginate (bảng 1.1). Như vậy, alginate chiếm tỷ lệ cao trong rong nâu, là nguồn nguyên liệu dồi dào có thể khai thác, sản xuất ở quy mô công nghiệp. 1.1.1.3. Hoạt tính sinh học của alginate và alginate KLPT thấp Alginate còn là đối tượng được các nhà khoa học quan tâm chú ý do hoạt tính sinh học đa dạng, tiềm năng lớn ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm. Các nghiên cứu về alginate hoặc dạng acid của nó cho thấy alginate có tính kháng khuẩn [23]. Các nhà nghiên cứu đang tìm kiếm các loại kháng sinh mới để chống lại tình trạng kháng đa thuốc ở vi khuẩn đang gia tăng trên toàn thế giới. Sử dụng alginate oligosaccharide G (oligo G) khối lượng 2.600 Da được điều chế từ loài Laminaria hyperborea alginate làm tăng hiệu quả của kháng sinh thông thường (lên đến 512 lần) đối với 21 chủng vi khuẩn đa kháng thuốc khác nhau bao gồm Pseudomonas, Burkholderia sp. và Acinetobacter spp. [24]. Khi có 10% Oligo G thì màng tế bào vi khuẩn bị tổn thương, sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc bị suy yếu. Như vậy oligo G đã liên kết với bề mặt vi khuẩn điều chỉnh điện tích, gây ra sự kết tụ của vi khuẩn và ức chế khả năng vận động. Alginate còn có khả năng kháng u [25], alginate ức chế sự vận chuyển và hấp thụ glucose qua thành ruột vào máu nên là chất tiềm năng để ứng dụng làm thuốc trị tiểu đường [26]. Nhờ vào muối natri alginate tăng cường khả năng bài tiết cholesterol vào phân và ngăn chặn sự gia tăng nồng độ glucose hoặc insulin gây ra bởi khả năng dung nạp glucose [27]. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu về alginate và alginate KLPT thấp đều có hoạt tính chống oxy hóa. Các tính chất này tăng khi alginate bị cắt ngắn thành oligomer [28], [29]. Alginate còn có khả năng tẩy xạ. Khi cơ thể bị nhiễm chất phóng xạ strontium bằng con đường tiêu hóa, có thể dùng natri alginate để đưa chất phóng xạ này ra ngoài cơ thể. Alginate tạo kết tủa bền với strontium do đó nó ngăn được sự hấp thụ strontium vào trong máu và phức hợp này sẽ được đào thải ra ngoài [30].