Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các phân đoạn chiết xuất và hợp chất phân lập từ quả cây dứa dại

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

78
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro của một số phân đoạn chiết và hợp chất phân lập từ quả cây Dứa dại (Pandanus odoratissimus L. f.). Phương pháp nghiên cứu là đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp loại gốc tự do (GTD) DPPH và ức chế quá trình peroxy hóa lipid (MDA) của 4 nhóm phân đoạn chiết, bao gồm n-hexan (PO-A), cloroform (PO-B), ethyl acetat (PO-C), nước (PO-D) và 4 hợp chất phân lập được từ phân đoạn chiết cloroform, bao gồm vanillin, (+)-pinoresinol, (+)-syringaresinol, (+)-medioresinol.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các phân đoạn chiết xuất và hợp chất phân lập từ quả cây dứa dại

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN CHIẾT XUẤT VÀ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ QUẢ CÂY DỨA DẠI (PANDANUS ODORATISSIMUS L. F.) Nguyễn Công Thùy Trâm*; Ninh Thế Sơn**; Nguyễn Mạnh Cường** Nguyễn Thị Cúc***; Đỗ Thị Thảo*** TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro của một số phân đoạn chiết và hợp chất phân lập từ quả cây Dứa dại (Pandanus odoratissimus L. f.). Phương pháp: đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp loại gốc tự do (GTD) DPPH và ức chế quá trình peroxy hóa lipid (MDA) của 4 nhóm phân đoạn chiết, bao gồm n-hexan (PO-A), cloroform (PO-B), ethyl acetat (PO-C), nước (PO-D) và 4 hợp chất phân lập được từ phân đoạn chiết cloroform, bao gồm vanillin, (+)-pinoresinol, (+)-syringaresinol, (+)-medioresinol. Kết quả: trong thử nghiệm DPPH, giá trị SC50 của các phân đoạn chiết n-hexan, cloroform, ethyl acetat, nước lần lượt là 81,24 µg/ml; 15,54 µg/ml; 19,30 µg/ml và 97,63 µg/ml, trong khi giá trị này cho các hợp chất phân lập là vanillin > 100 µg/ml, (+)-pinoresinol 7,5 µg/ml, (+)-syringaresinol 16,53 µg/ml, (+)-medioresinol 5,93 µg/ml, so với chất đối chứng dương axít ascorbic 5,93 µg/ml. Trong thử nghiệm peroxy hóa lipid (MDA), giá trị IC50 của các phân đoạn chiết lần lượt là n-hexan 66,06 µg/ml, cloroform 8,07 µg/ml, ethyl acetat 26,79 µg/ml, nước 106,43 µg/ml so với chất đối chứng dương trolox 12,01 µg/ml và các hợp chất phân lập vanillin và (+)-syringaresinol > 100 µg/ml, (+)-pinoresinol 11,04 µg/ml, (+)-medioresinol 5,82 µg/ml so với chất đối chứng dương trolox 11,06 µg/ml. Kết luận: trên mô hình thử nghiệm in vitro chống oxy hóa DPPH và peroxy hóa lipid, phân đoạn chiết cloroform và hai hợp chất lignan (+)-pinoresinol, (+)-medioresinol phân lập từ quả cây Dứa dại có tác dụng tốt nhất. * Từ khóa: Dứa dại; Peroxy hóa lipid; Hoạt tính chống oxy hóa. Antioxidant Activity of Extracts and Components from the Fruits of the Pandanus Odoratissimus L. f. in Vitro Model Summary Objectives: To evaluate in vitro antioxidant activity of extracts and components produced from the fruits of Pandanus odoratissimus. Methods: Antioxidant activity of extracts, including nhexane (PO-A), chloroform (PO-B), ethyl acetate (PO-C), aqueous (PO-D) and isolated compounds, comprising vanillin, (+)-pinoresinol, (+)-syringaresinol, (+)-medioresinol, produced from the fruits of Pandanus odoratissimus were examined by in vitro measurements of DPPH-radical scavenging and inhibition of lipid peroxydation (MDA). Results: With regards to DPPH experiments, * Đại học Đà Nẵng ** Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên *** Viện Công nghệ Sinh học Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Thị Thảo (thaodo@yahoo.com) Ngày nhận bài: 03/03/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/06/2017 Ngày bài báo được đăng: 25/07/2017 5 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 SC50 values of n-hexane, chloroform, ethyl acetate, aqueous extracts showed 81.24 µg/mL, 15.54 µg/mL, 19.30 µg/mL and 97.63 µg/mL, respectively, whereas those ones of isolated compounds was to be vanillin > 100 µg/mL, (+)-pinoresinol 7.5 µg/mL, (+)-syringaresinol 16.53 µg/mL, (+)-medioresinol 5.93 µg/mL, when compared to positive control ascorbic acid 5.93 µg/mL. Of lipid peroxidation (MDA) experiments, IC50 levels of extracts revealed the values of n-hexane 66.06 µg/mL, chloroform 8.07 µg/mL, ethyl acetate 26.79 µg/mL, aqueous 106.43 µg/mL in comparison with the positive control trolox 12.01 µg/mL, whereas purified compounds vanillin and (+)-syringaresinol > 100 µg/mL, (+)-pinoresinol 11.04 µg/mL, (+)-medioresinol 5.82 µg/mL were in comparison with positive control trolox 11.06 µg/mL. Conclusion: Based on antioxidant DPPH-radical scavenging and inhibition of lipid peroxydation for Pandanus odoratissimus fruits, the chloroform extract and two lignan compounds (+)-pinoresinol, (+)-medioresinol exhibited the significant values. * Keywords: Pandanus odoratissimus; Lipid peroxydation; Antioxidant activity. ĐẶT VẤN ĐỀ Gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc phân tử ở lớp ngoài cũng có electron không ghép đôi, dễ dàng tham gia vào phản ứng hóa học với các hợp chất như protein, lipid, carbohydrat, ADN… trong cơ thể. Điều này dẫn đến sự rối loạn, mất cân bằng quá trình sinh hóa và là nguồn gốc của sự lão hóa, là nguyên nhân chính gây ra nhiều loại bệnh về gan, tim mạch, mắt, da, hệ miễn dịch, ung thư và các bệnh thần kinh. Trong nhiều nghiên cứu khoa học, phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng việc thử nghiệm các hợp chất, hay dược liệu có khả năng ức chế DPPH (1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl) và ức chế quá trình peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) được coi là phương pháp nhanh chóng, ổn định, đơn giản và chính xác cao [9, 11]. Hiện nay, việc tìm ra các hợp chất có khả năng chống oxy hóa có nguồn gốc từ thiên nhiên thay thế hợp chất được tổng hợp hóa học nhằm hạn chế nguy cơ ung thư do các chất tổng hợp gây ra đang trở thành phương pháp hữu hiệu. Một số loại quả ăn dễ trồng, sử dụng như những vị 6 thuốc quý trong chống oxy hóa (kìm hãm sự phát triển và tiêu diệt GTD) như quả Nhàu (Morindacitrifolia), Xoài (Mangifera indica), Mướp đắng (Momordica charantia) hay Dâu tây (Vaccinium corymbosum) [7]. Cây Dứa dại (Pandanus odoratissimus L. f.) thuộc họ Pandanaceae, là loại cây tiểu mộc, một lá mầm, cao từ 3 - 5 m, thân to 15 cm, lá dài rộng và có gai, quả rộng 19 cm, dài 27 cm, phân bố nhiều ở ven biển các tỉnh miền Trung [3]. Quả của loài cây này thường được sử dụng trong các bài thuốc dân gian chữa nhiều bệnh như tiểu buốt, trĩ [4]. Về thành phần hóa học, có nhiều nghiên cứu đã cho thấy chi Pandanus có các lớp chất lignan, monoterpen và sesquiterpen, alkaloid, các dẫn xuất benzofuran và axít mạch thẳng [4]. Về hoạt tính sinh học, nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa từ cao chiết rễ và lá cây Dứa dại chỉ ra tác dụng hữu hiệu của hai bộ phận này [ 6]. Trong nghiên cứu trước, chúng tôi công bố kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học 4 hợp chất, bao gồm một hợp chất phenolic vanillin (1) và 3 hợp chất lignan: T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 (+)-pinoresinol (2), (+)-syringaresinol (3) và (+)-medioresinol (4), được tách từ quả của cây Dứa dại [2]. Các hợp chất với bộ khung lignan được coi là tác nhân chống oxy hóa - bảo vệ tế bào gan [5]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục đánh giá và sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa của phân đoạn chiết và 4 hợp chất phân lập trên từ quả Dứa dại với mục đích bổ sung nguồn dữ liệu về tác dụng của loài này trong hỗ trợ điều trị bệnh. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu. * Vật liệu nghiên cứu: - Mẫu quả cây Dứa dại (P. odoratissimus L. f.) được thu hái vào 9 - 2013 tại khu vực ven biển Lăng Cô, Thừa Thiên Huế. Mẫu nguyên liệu được nhà thực vật Ngô Văn Trại, nguyên cán bộ Viện Dược liệu, định tên khoa học. Tiêu bản số C-516 được lưu giữ tại Phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên. - Hoá chất và dụng cụ: 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH), axít thiobarbituric (TBA), chất đối chứng tham khảo: axít ascorbic và trolox, dimethylsulfoside (DMSO), đệm phosphat hoặc KCl, axít tricloacetic (TCA, Fisher), FeSO4, H2O2, đĩa Elisa, pipet, Eppendorf, máy đo OD Microplate Reader, cân phân tích và các thiết bị phụ trợ khác. - Động vật: chuột thuần chủng dòng BALB/c khoẻ mạnh, không mắc bệnh, do Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp, được nuôi trong cùng điều kiện tại Phòng Thử nghiệm Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chuột được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và nước uống tự do. * Tách chiết các hợp chất từ quả cây Dứa dại: Mẫu quả cây Dứa dại (3,5 kg) được loại bỏ phần hỏng, xay nhỏ, ngâm chiết với metanol (3 x 2,5 lít) ở nhiệt độ phòng. Cô quay cất loại dung môi thu được cao tổng methanol (320 g) (PO). Cao tổng này được thêm nước cất và chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexan, CHCl3, EtOAc, thu được phân đoạn chiết tương ứng PO-A (56,7 g, n-hexan), PO-B (24,4 g, clorofom), PO-C (12 g, EtOAc), còn lại là dịch nước PO-D. Phân đoạn chiết cloroform PO-B được tiến hành phân tách trên sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là n-hexan:etyl axetat gradient (20:1, v/v) thu được 12 nhóm phân đoạn từ PO-1B đến PO-12B. Tiếp tục phân tách các phân đoạn 5B, 9B và 11B, 12B trên bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là n-hexan:axeton, thu được bốn hợp chất 1 (20 mg), 2 (35 mg), 3 (260 mg) và 4 (15 mg) từ các phân đoạn trên tương ứng. Các hợp chất thu được đã được xác định cấu trúc hóa học bằng phổ APCI-MS, 1 H-NMR, 13C-NMR và định tên tương ứng lần lượt là vanillin (1), (+)-pinoresinol (2), (+)-syringaresinol (3) và (+)-medioresinol (4) [2]. 2. Mô hình in vitro thử tác dụng chống oxy hóa. * Xác định khả năng loại bỏ GTD DPPH: Tiến hành thực nghiệm theo phương pháp của Yuvaraj và CS (2013) [11] có 7 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Mẫu thử được pha dung dịch gốc trong DMSO ở nồng độ 2 mg/ml. Sau đó pha thành dải nồng độ: 200; 100; 50; 25; 12,5 µg/ml với nước cất khử ion. Tương tự, axít ascorbic (đối chứng dương) pha với nồng độ 100; 50; 25; 12,5; 6,25 µg/ml. DPPH pha trong methanol (100%) ở nồng độ 0,25 µM. Hút 1 ml mẫu nghiên cứu đã pha ở các nồng độ vào ống thủy tinh. Mỗi nồng độ thử chất lặp lại 2 lần. Thêm 1 ml dung dịch DPPH đã chuẩn bị ở trên vào các ống đã có sẵn mẫu nghiên cứu. Ống không có mẫu thử, chỉ có 1 ml nước và 1 ml DPPH làm đối chứng âm. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Xác định độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng tại bước sóng 517 nm trên máy đọc Elisa. Vì mẫu nghiên cứu và dung dịch DPPH đưa vào ống theo tỷ lệ 1:1, nên nồng độ mẫu nghiên cứu trong ống có DPPH sẽ giảm đi một nửa còn 100; 50; 25; 12,5; 6,25 µg/ml. Nồng độ axít ascorbic (VitC) trong ống có DPPH sẽ giảm đi một nửa còn 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 µg/ml. Giếng có dung môi hòa mẫu nghiên cứu và dung dịch DPPH được xem là giếng đối chứng. Giếng có sử dụng axít ascorbic là chất đối chứng tham khảo. Khả năng trung hòa GTD (Scavenging Activities - SA) sinh ra từ DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau: % SA = (ODđối chứng - ODmẫu thử)*100/ODđối chứng (%). Trong đó: ODđối chứng: độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử. ODmẫu chất thử. 8 thử: độ hấp thụ tại giếng chứa Kết quả báo cáo bằng giá trị SC50 (Scavenging Concentration ở 50% - nồng độ trung hòa được 50% GTD của DPPH) và xác định bằng phần mềm Table Curve 2Dv4. * Xác định khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid: Tiến hành thực nghiệm theo phương pháp của Stroev E.A và CS (1998) [9] có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat (pH = 7,4) theo tỷ lệ 1:10 ở nhiệt độ 0 - 4oC. Lấy 1 ml dịch đồng thể thêm vào 0,1 ml mẫu thử ở các nồng độ và 0,8 ml đệm phosphat thêm 0,1 ml hệ Penton (FeSO4 0,1 mM:H2O2 15 mM theo tỷ lệ 1:1). Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 15 phút. Dừng phản ứng bằng 1 ml axít tricloacetic 10%. Ly tâm 12.000 vòng trong 5 phút. Lấy dịch trong cho phản ứng với 1 ml axít thiobarbituric 0,8% (tỷ lệ 2:1). Ủ ở nhiệt độ 100oC trong 15 phút. Làm lạnh và đo ở bước sóng λ = 532 nm. Trolox được sử dụng làm chất đối chứng tham khảo. Công thức tính phần trăm hoạt tính chống oxy hoá: HTCO (%) = [(ODC - ODT)/ODC] × 100 Trong đó: ODC: mật độ quang học của giếng chứng không có mẫu thử; ODT: mật độ quang học của mẫu thử. Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 và được xác định bằng phần mềm Table Curve 2Dv4. Giá trị này càng thấp, hoạt tính khử GTD càng mạnh. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả sàng lọc các phân đoạn chiết có hoạt tính chống oxy hóa in vitro theo mô hình loại bỏ GTD DPPH. * Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa in vitro theo mô hình loại bỏ GTD DPPH của các phân đoạn chiết từ quả Dứa dại: Bảng 1: Kết quả thử hoạt tính DPPH của các nhóm cao chiết. Nồng độ (µg/ml) PO-A PO-B PO-C PO-D 100 58,62 ± 1,08 81,71 ± 0,10 83,10 ± 0,10 51,11 ± 0,30 50 34,01 ± 1,28 79,42 ± 0,00 82,13 ± 1,08 25,59 ± 0,79 25 22,25 ± 0,79 69,89 ± 1,48 58,41 ± 1,97 10,57 ± 0,98 12,5 9,25 ± 0,49 32,34 ± 1,28 34,91 ± 0,59 4,03 ± 1,18 SC50 (µg/ml) 81,24 15,54 19,30 97,63 Hoạt tính loại bỏ GTD có sự khác biệt lớn giữa các phân đoạn chiết ở nồng độ 12,5; 25; 50 và 100 µg/ml. So sánh giá trị SC50 của cao chiết ở các phân đoạn cho thấy ở quả Dứa dại, cao chiết có tác dụng chống oxy hóa theo thứ tự PO-D < PO-A < PO-C < PO-B. * Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa in vitro theo mô hình loại bỏ GTD DPPH của các hợp chất phân lập từ quả Dứa dại: Bảng 2: Kết quả thử hoạt tính DPPH của các hợp chất phân lập. Nồng độ (µg/ml) Chất 1 2 3 4 Axít ascorbic 100 36,10 ± 1,30 88,43 ± 0,72 77,50 ± 1,43 80,73 ± 1,17 50 29,00 ± 0,65 79,76 ± 1,63 74,41 ± 1,11 79,94 ± 1,50 91,05 ± 0,26 25 24,53 ± 0,07 70,03 ± 0,78 65,61 ± 0,78 79,07 ± 1,30 90,51 ± 0,39 12.5 15,17 ± 1,83 55,92 ± 1,43 42,05 ± 1,24 74,64 ± 0,26 88,27 ± 0,52 6.25 4,29 ± 0,13 47,12 ± 0,33 29,55 ± 0,65 50,58 ± 1,04 51,98 ± 0,13 SC50 (µg/ml) > 100 7,50 16,53 5,93 5,93 Giá trị SC50 của hợp chất 1 - 4 lần lượt là > 100; 7,50; 16,53; 5,93 µg/ml. Như vậy, hợp chất 1 chưa thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, hợp chất 2 - 4 đều có hoạt tính chống oxy hóa mạnh ở các nồng độ nghiên cứu. Trong đó, chất 4 có hoạt tính chống oxy hóa tương đương với chất đối chứng. 9