Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của Hạ khô thảo nam (Blumea lacera (Burn.f.) Dc)

t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018<br /> <br /> NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ<br /> TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA HẠ KHÔ THẢO NAM<br /> (Blumea lacera (Burn.F.) DC)<br /> Trịnh Khánh Linh1; Trần Văn Cường1; Nguyễn Văn Thư2<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: định tính thành phần hóa học, định lượng flavonoid toàn phần và đánh giá tác dụng<br /> chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết cây Hạ khô thảo nam (Blumea lacera). Đối tượng và<br /> phương pháp: định tính phân đoạn dịch chiết từ phần trên mặt đất của Hạ khô thảo nam qua một số<br /> nhóm hợp chất hóa học bằng các phản ứng hóa học đặc trưng, định lượng flavonoid toàn phần<br /> bằng phương pháp tạo màu với AlCl3 trong môi trường kiềm-trắc quang, đánh giá tác dụng<br /> chống oxy hóa thông qua khả năng dọn gốc tự do DPPH (2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Kết quả và<br /> kết luận: Hạ khô thảo nam có chứa một số nhóm hợp chất như alcaloid, flavonoid, tanin,<br /> saponin, sterol, terpenoid, polysaccharid, carotenoid. Hàm lượng flavonoid toàn phần đạt 13,08<br /> mg/g. Các phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, trong đó<br /> phân đoạn BLE có tác dụng tốt nhất.<br /> * Từ khóa: Hạ khô thảo nam; Dọn gốc tự do; Hóa thực vật; Chống oxy hóa.<br /> <br /> Phytochemical Investigation and Antioxidant Activity of Blumea<br /> lacera (Burn.F.) DC<br /> Summary<br /> Objectives: To evaluate the phytochemical constituents and to investigate the antioxidant<br /> activity of extracts from aerial part of Blumea lacera. Materials and methods: Crude ethanol<br /> extract from aerial part of B. lacera and its derived fractions were assessed for phytochemical<br /> classes. Total flavonoid content was determined by aluminium chloride colorimetric method.<br /> Antioxidant activity was determined using 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical<br /> scavenger methods. Results and conclusion: B. lacera is a source of various<br /> phytoconstituents such as alkaloids, flavonoids, tannins, saponin, sterol, carotenoid, polysaccharide<br /> and terpenoids. Total flavonoids in the methanol extract were 13.08 ± 1.23 mg/g quercetin<br /> equivalents. With regards to DPPH experiments, all of the fractions from ethanol extract showed<br /> DPPH free radical scavenging capacity. The highest activity was obtained from the fraction ethyl<br /> acetate with the SC50 value of 18.56 mg/mL.<br /> * Keywords: Blumea lacera; Free radical scavenging; Phytochemical; Antioxidant.<br /> 1. Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội<br /> 2. Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Thư (thu_vmmu@hotmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 10/08/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/09/2018<br /> Ngày bài báo được đăng: 26/09/2018<br /> <br /> 5<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hạ khô thảo nam có tên khoa học là<br /> Blumea lacera (Burn.f.) DC., thuộc họ Cúc<br /> (Asteraceae). Theo Đông y, Hạ khô thảo<br /> nam được dùng làm thuốc trị tràng nhạc,<br /> nhọt lở, cầm máu vết thương, băng huyết,<br /> chảy máu cam, tức ngực, ho có đờm,<br /> táo bón, mất ngủ, đái vàng và nóng [1].<br /> Hạ khô thảo nam có nhiều tác dụng sinh<br /> học như gây độc đối với một số dòng tế<br /> bào ung thư (dạ dày, ruột kết, ung thư vú),<br /> kháng bệnh bạch cầu in vitro, ức chế<br /> Herpes virut týp 1 và 2 (HSV1 và HSV2),<br /> kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa,<br /> tiểu đường [3, 4, 5, 6, 7]. Nhiều nghiên<br /> cứu trước đây cho thấy Hạ khô thảo nam<br /> có chứa các nhóm hoạt chất flavonoid,<br /> terpen glycosid, polyphenol, tinh dầu,<br /> terpenoid keton, sterol [8]. Ở Việt Nam,<br /> nguồn nguyên liệu Hạ khô thảo nam rất<br /> dồi dào nhưng nghiên cứu về thành phần<br /> hóa học và hoạt tính sinh học của dược<br /> liệu này vẫn còn hạn chế. Bài báo này<br /> trình bày kết quả nghiên cứu về thành<br /> phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa<br /> của một số phân đoạn dịch chiết cây Hạ<br /> khô thảo nam.<br /> ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG<br /> PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu.<br /> * Đối tượng nghiên cứu:<br /> Phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo<br /> nam được thu hái năm 2018 tại Sa Pa<br /> (Lào Cai). Mẫu được Viện Sinh thái Tài<br /> nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học<br /> và Công nghệ Việt Nam thẩm định tên<br /> khoa học.<br /> 6<br /> <br /> * Hóa chất và dung môi:<br /> Chất chuẩn axít gallic (hàm lượng ≥ 98%)<br /> và thuốc thử folin - ciocalteu (Hãng Sigma<br /> Aldrich). Chất chuẩn quercetin hàm lượng<br /> 90,87% (Viện Kiểm nghiệm Thuốc<br /> Trung ương). Các dung môi, hóa chất<br /> trong phòng thí nghiệm: ethanol (EtOH),<br /> methanol (MeOH), ethyl acetat (EtOAc),<br /> dicloromethan (DCM), n-hexan, natri<br /> carbonat, nhôm clorid, axít acetic, natri<br /> acetat (Hãng Merck); axít ascorbic, DPPH<br /> (Hãng Sigma)… đạt tiêu chuẩn tinh khiết<br /> phân tích.<br /> * Thiết bị:<br /> Máy đo hàm ẩm tự động ShimadzuMoc 63U (Nhật Bản); máy đo quang<br /> UV-Vis Biochrom Libra S70 PC (Anh);<br /> cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác<br /> 0,1 mg (Trung Quốc); máy chiết siêu âm<br /> gia nhiệt Sineo Uwave - 1000 (Trung<br /> Quốc); pipet chính xác, bình định mức<br /> (loại A); cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm<br /> các loại và những dụng cụ, thiết bị khác<br /> đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết:<br /> Cân 1,1 kg bột thô phần trên mặt đất<br /> của cây Hạ khô thảo nam, chiết hồi lưu<br /> 3 lần với EtOH 96%, để nguội, lọc, tập<br /> trung dịch lọc, bốc hơi dung môi dưới áp<br /> suất giảm thu được cắn EtOH. Sau đó,<br /> phân tán cắn EtOH trong nước nóng (70oC),<br /> lần lượt lắc với các dung môi có độ phân<br /> cực tăng dần: n-hexan, dicloromethan,<br /> ethyl acetat thu được các phân đoạn dịch<br /> chiết. Các phân đoạn được cất thu hồi<br /> dung môi dưới áp suất giảm, thu được cắn<br /> n-hexan (BLH; 5,2 g), cắn dicloromethan<br /> (BLD; 10,7 g), cắn ethyl acetat (BLE; 8,6 g).<br /> <br /> t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018<br /> Phần dịch nước còn lại cô dưới áp suất<br /> giảm, sấy khô đến cắn (BLW; 17,9 g).<br /> * Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ<br /> bằng phản ứng hóa học đặc trưng:<br /> Tiến hành phản ứng hóa học đặc trưng<br /> theo quy trình về phương pháp nghiên cứu<br /> cây thuốc [2].<br /> * Định lượng flavonoid toàn phần:<br /> <br /> Hàm lượng flavonoid toàn phần được<br /> tính theo công thức sau:<br /> X (mg/g) =<br /> <br /> At - b<br /> m.a.(100 - h)<br /> <br /> × 125<br /> <br /> Trong đó:<br /> X (mg/g): hàm lượng flavonoid toàn<br /> phần ở phần trên mặt đất của Hạ khô<br /> thảo nam.<br /> <br /> Định lượng flavonoid toàn phần theo<br /> phương pháp có biến đổi của Meda và<br /> CS [9].<br /> <br /> At: độ hấp thu ở bước sóng 425 nm<br /> của mẫu thử.<br /> <br /> Dung dịch quercetin chuẩn: pha quercetin<br /> chuẩn trong MeOH:H2O (1:1) có nồng độ<br /> 1 mg/ml. Từ chuẩn gốc pha ra thành các<br /> dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ<br /> 175, 150, 125, 100 và 75 µg/ml.<br /> <br /> a, b: các hệ số trong phương trình<br /> tuyến tính của chất chuẩn y = ax + b.<br /> <br /> Dung dịch thử: cân chính xác 10,0 g<br /> bột dược liệu cho vào bình nón 250 ml,<br /> thêm 150 ml dung dịch MeOH:H2O (1:1),<br /> chiết siêu âm ở 50oC trong 60 phút<br /> (150 ml/lần × 3 lần), lọc thu được dịch chiết.<br /> Dịch chiết được cô thu hồi dung môi còn<br /> 1/5 thể tích, sau đó thủy phân bằng dung<br /> dịch HCl 20% ở 85oC trong 3 giờ. Dịch đã<br /> thủy phân để nguội, lắc với 15 ml ethylacetat<br /> (15 ml/lần × 3 lần), gộp các dịch chiết cho<br /> vào bình định mức 50 ml và bổ sung dung<br /> môi đến vạch.<br /> Phản ứng tạo màu: hút chính xác 1 ml<br /> dung dịch phân tích (dung dịch chuẩn<br /> hoặc dung dịch thử) cho vào bình định<br /> mức 25 ml, thêm 0,5 ml dung dịch natri<br /> citrat 1%. Thêm tiếp 2,0 ml dung dịch<br /> AlCl3 0,5%. Sau đó, bổ sung dung dịch<br /> axít acetic 5% pha trong methanol đến<br /> vạch. Lắc đều, để yên 45 phút, tiến hành<br /> đo quang ở bước sóng 425 nm.<br /> <br /> m: khối lượng dược liệu (g).<br /> <br /> h: độ ẩm của dược liệu.<br /> * Đánh giá tác dụng chống oxy hóa<br /> của một số phân đoạn dịch chiết Hạ khô<br /> thảo nam thông qua khả năng loại gốc tự<br /> do (GTD) DPPH:<br /> Tiến hành thực nghiệm theo phương<br /> pháp của Yuvaraj và CS (2013) [10] có<br /> cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng<br /> thí nghiệm. Mẫu thử là cắn của phân<br /> đoạn dịch chiết được pha trong DMSO<br /> thành dải nồng độ: 90, 45, 9, 1 mg/ml.<br /> DPPH pha trong methanol (100%) ở nồng<br /> độ 0,25 µM. Hút 1 ml mẫu nghiên cứu<br /> đã pha ở các nồng độ vào ống thủy tinh.<br /> Mỗi nồng độ thử chất lặp lại 2 lần. Thêm<br /> 1 ml dung dịch DPPH đã chuẩn bị ở trên<br /> vào các ống đã có sẵn mẫu nghiên cứu.<br /> Ống không có mẫu thử, chỉ có 1 ml nước<br /> và 1 ml DPPH làm đối chứng âm. Ủ ở<br /> 37oC trong 30 phút. Xác định độ hấp thụ<br /> của dung dịch sau phản ứng tại bước sóng<br /> 517 nm trên máy đọc ELISA. Khả năng<br /> trung hòa GTD (Scavenging Activities - SA)<br /> sinh ra từ DPPH của mẫu thử được tính<br /> theo công thức sau:<br /> 7<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018<br /> (ODđối chứng - ODmẫu thử)<br /> % SA =<br /> <br /> ODđối chứng<br /> <br /> × 100<br /> <br /> Trong đó:<br /> ODđối chứng: độ hấp thụ tại giếng không<br /> chứa chất thử.<br /> ODmẫu<br /> chất thử.<br /> <br /> thử:<br /> <br /> độ hấp thụ tại giếng chứa<br /> <br /> Lập phương trình biểu thị mối tương<br /> quan giữa khả năng chống oxy hóa và<br /> nồng độ chất thử, xác định nồng độ có<br /> khả năng chống oxy hóa bằng 50%. Điểm<br /> nồng độ đó là SC50, giá trị SC50 được xác<br /> định dựa vào phương trình y = ax + b,<br /> trong đó y là khả năng loại bỏ GTD, a và b<br /> là các hệ số trong phương trình y = ax + b.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học.<br /> Bảng 1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Hạ khô<br /> thảo nam.<br /> Thứ tự<br /> <br /> Nhóm chất<br /> <br /> 1<br /> Alcaloid<br /> <br /> 2<br /> Glycosid tim<br /> <br /> 3<br /> <br /> Anthranoid<br /> <br /> 4<br /> Flavonoid<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> Coumarin<br /> Saponin<br /> <br /> 7<br /> Tanin<br /> <br /> 8<br /> <br /> Phản ứng định tính<br /> <br /> Kết quả<br /> <br /> Phản ứng với thuốc thử Mayer<br /> <br /> +<br /> <br /> Phản ứng với thuốc thử Bouchardat<br /> <br /> +<br /> <br /> Phản ứng với thuốc thử Dragendorff<br /> <br /> +<br /> <br /> Phản ứng Liebermann - Burchard<br /> <br /> -<br /> <br /> Phản ứng Legal<br /> <br /> -<br /> <br /> Phản ứng Baljet<br /> <br /> -<br /> <br /> Phản ứng Keller - Kiliani<br /> <br /> -<br /> <br /> Phản ứng Borntrager<br /> <br /> -<br /> <br /> Phản ứng Cyanidin<br /> <br /> ++<br /> <br /> Phản ứng với kiềm<br /> <br /> ++<br /> <br /> Phản ứng với FeCl3 5%<br /> <br /> +++<br /> <br /> Phản ứng đóng mở vòng lacton<br /> <br /> -<br /> <br /> Phản ứng diazo hóa<br /> <br /> -<br /> <br /> Phản ứng tạo bọt<br /> <br /> ++<br /> <br /> Phản ứng với FeCl3 5%<br /> <br /> +++<br /> <br /> Phản ứng với gelatin 1%<br /> <br /> ++<br /> <br /> Phản ứng với chì acetat 10%<br /> <br /> ++<br /> <br /> Kết luận<br /> <br /> Có<br /> <br /> Không<br /> <br /> Không<br /> <br /> Có<br /> <br /> Không<br /> Có<br /> <br /> Có<br /> <br /> 8<br /> <br /> Axit hữu cơ<br /> <br /> Phản ứng với Na2CO3<br /> <br /> ++<br /> <br /> Có<br /> <br /> 9<br /> <br /> Đường khử<br /> <br /> Phản ứng với thuốc thử Fehling<br /> <br /> ++<br /> <br /> Có<br /> <br /> 10<br /> <br /> Polysaccharid<br /> <br /> Phản ứng với thuốc thử Lugol<br /> <br /> ++<br /> <br /> Có<br /> <br /> 11<br /> <br /> Chất béo<br /> <br /> Tọa vết mờ trên giấy<br /> <br /> -<br /> <br /> Không<br /> <br /> 12<br /> <br /> Sterol<br /> <br /> Phản ứng Liebermann - Burchard<br /> <br /> +<br /> <br /> Có<br /> <br /> 13<br /> <br /> Carotenoid<br /> <br /> Phản ứng với H2SO4 đặc<br /> <br /> +<br /> <br /> Có<br /> <br /> t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018<br /> Phần trên mặt đất cây Hạ khô thảo nam có chứa các hợp chất thuộc nhóm alcaloid,<br /> flavonoid, tanin, saponin, sterol, axít hữu cơ, carotenoid, polysaccharid và đường khử.<br /> Kết quả nghiên cứu phù hợp với các tác giả khác về định tính nhóm hợp chất hữu cơ<br /> trong cây Hạ khô thảo nam. Ahmed và CS (2014) nghiên cứu định tính các nhóm hoạt<br /> chất cho thấy Hạ khô thảo nam có chứa nhóm hợp chất carbohydrat, flavonoid,<br /> alcaloid, terpenoid và steroids ở phân đoạn dịch chiết phân cực [11]. Nghiên cứu của<br /> Pattewar và CS (2012) cũng chứng minh sự có mặt của tanin, alcaloid, saponin,<br /> anthraquinone glycosid, steroid, flavonoid, phenolic và terpenoid từ dịch chiết nước<br /> của Hạ khô thảo nam [12]. Ngoài ra, Tiwari và CS (2012) cũng báo cáo sự có mặt của<br /> các hợp chất steroid, terpenoid, alcaloid, saponin, nhưng không có mặt của nhóm hợp<br /> chất tanin và phenolic [13].<br /> 2. Định lượng flavonoid toàn phần.<br /> * Kết quả xây dựng đường chuẩn:<br /> Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn quercetin (75 - 150 µg/ml). Thực hiện phản ứng tạo<br /> màu với các thuốc thử. Sau khi ổn định màu, đo quang phổ UV-VIS ở bước sóng 425 nm,<br /> đánh giá sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang với nồng độ dung dịch.<br /> Bảng 2: Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ dung dịch quercetin chuẩn.<br /> Thứ tự<br /> <br /> Nồng độ<br /> (µg/ml)<br /> <br /> Độ hấp<br /> thụ<br /> <br /> 1<br /> <br /> 75<br /> <br /> 0,223<br /> <br /> 2<br /> <br /> 100<br /> <br /> 0,328<br /> <br /> 3<br /> <br /> 125<br /> <br /> 0,393<br /> <br /> 4<br /> <br /> 150<br /> <br /> 0,464<br /> <br /> 5<br /> <br /> 175<br /> <br /> 0,563<br /> <br /> Đường chuẩn<br /> 2<br /> <br /> R<br /> <br /> Y = 0,0033X - 0,0138<br /> 0,9929<br /> <br /> Hình 1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ dung dịch quercetin chuẩn.<br /> 9<br /> <br />