Điều tra, tinh sạch và tìm hiểu tính chất đặc trưng của lectin một số giống đậu cô ve (Phaseolus Vulgaris L.)

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Tập 75A, Số 6, (2012), 111-121<br /> <br /> ĐIỀU TRA, TINH SẠCH VÀ TÌM HIỂU TÍNH CHẤT ĐẶC TRƯNG CỦA<br /> LECTIN MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU CÔ VE (PHASEOLUS VULGARIS L.)<br /> Cao Đăng Nguyên1, Nguyễn Thị Cẩm Hạnh2<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế<br /> <br /> Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng<br /> <br /> Tóm tắt. Đã điều tra lectin của 6 giống đậu cô ve thấy rằng cả 6 giống đều có hoạt tính<br /> lectin trong đó giống đậu cove hạt trắng dạng bụi (white bean core bush type white seeds)<br /> có hoạt tính lectin mạnh nhất, đặc biệt đối với hồng cầu trâu, bò, lợn. Lectin của 6 giống<br /> này đều không có biểu hiện đặc hiệu nhóm máu.<br /> Lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 300C – 400C, pH 6,8 – 7,6.<br /> Các đường α-D-glucose, α-D-galactose, D-mannose, D-fructose, D-saccharide, D-lactose,<br /> D-arabinose và D-manitose ở nồng độ 0,05 – 0,1 M có tác dụng kìm hãm hoạt tính của<br /> lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi. Lectin này cũng bị kìm hãm bởi protein của một số<br /> huyết thanh người và động vật (trâu, bò, lợn).<br /> Đã tinh sạch lectin đậu cove hạt trắng dạng bụi có độ tinh sạch gấp khoảng 52 lần so với<br /> dịch thô ban đầu. Trên gel polyacrylamide thấy xuất hiện 5 band có khối lượng phân tử<br /> trong khoảng 30 – 97 kDa.<br /> <br /> 1. Mở đầu<br /> Lectin là protein hay glucoprotein, có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu<br /> và một số loại tế bào khác một cách chọn lọc, ngoài ra lectin còn có khả năng kích thích<br /> sự tăng sinh của tế bào limphocyte [3, 4, 5, 9] ... Lectin có mặt trong các giới động vật,<br /> thực vật và vi sinh vật đã và đang được nhiều người quan tâm nghiên cứu. Hiện nay,<br /> trên thế giới đã có hàng trăm chế phẩm được bán ra trên thị trường để ứng dụng vào các<br /> mục đích khác nhau, đặc biệt trong y học. Ở nước ta cũng đã có hàng loạt công trình<br /> nghiên cứu lectin trong những năm gần đây và theo hướng điều tra, nghiên cứu cấu trúc<br /> chức năng, ứng dụng. Trên cơ sở đó chúng tôi tến hành đề tài này trên một số hạt cây họ<br /> đậu – loài được trồng phổ biến trên địa bàn Thừa Thiên Huế, nhằm góp phần khai thác<br /> nguồn tài nguyên và nghiên cứu đa dạng sinh vật ở Việt Nam.<br /> 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu<br /> 2.1. Đối tượng<br /> - Đối tượng nghiên cứu là hạt một số giống đậu cove (Phaseolus vulgaris L.) có<br /> 111<br /> <br /> Điều tra, tinh sạch và tìm hiểu tính chất đặc trưng…<br /> <br /> 112<br /> <br /> xuất xứ từ công ty TNHH sản xuất thương mại xanh thành phố Hồ Chí Minh.<br /> - Hồng cầu và huyết thanh các nhóm máu A, B, O và AB do trung tâm huyết học<br /> và truyền máu miền Trung cung cấp.<br /> 2.2. Phương pháp<br /> - Hồng cầu trước khi sử dụng rửa sạch bằng nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) và<br /> pha loãng ở nồng độ 3% - 5% bằng nước muối sinh lý.<br /> - Xử lý mẫu: mẫu hạt giống được bảo quản ở nhiệt độ thường. Hạt trước khi sử<br /> dụng đem rửa sạch và chiết rút bằng đệm PBS ở pH 7,4 với tỉ lệ 1:5. Hỗn hợp chiết rút<br /> đem ly tâm 10.000 vòng/phút thu dịch trong giữ ở -200C để nghiên cứu lectin.<br /> - Nghiên cứu các tính chất bằng cách ngưng kết hồng cầu theo phương pháp của<br /> Gebauer [5].<br /> - Xác định protein hòa tan theo phương pháp Lowry [6].<br /> - Tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion qua DEAE - Sephadex A-25 theo<br /> những điều mô tả của Nguyễn Quốc Khang [8].<br /> - Điện di trên SDS-polyacrylamide theo nguyên tắc của Laemmli [7].<br /> 3. Kết quả và thảo luận<br /> 3.1. Điều tra lectin một số giống đậu cô ve<br /> Bảng 3.1. Hàm lượng protein và hoạt tính lectin trong dịch chiết ở một số giống đậu cove<br /> (Phaseolus Vulgaris L.)<br /> <br /> Hoạt tính<br /> Tên đậu<br /> <br /> Tên đậu<br /> <br /> STT<br /> thường gọi<br /> <br /> 1<br /> <br /> White<br /> Đậu cove hạt Cora<br /> trắng dạng bụi<br /> type<br /> Seeds<br /> <br /> Đậu cove<br /> 2<br /> <br /> trên bao bì<br /> <br /> Bean<br /> Bush<br /> White<br /> <br /> Protein<br /> (mg/ml) Nhóm<br /> máu<br /> <br /> HĐR<br /> <br /> (Đv/ml)<br /> <br /> (Đv/mg<br /> protein)<br /> <br /> A<br /> <br /> 320<br /> <br /> 140,7<br /> <br /> B<br /> <br /> 640<br /> <br /> 281,3<br /> <br /> O<br /> <br /> 640<br /> <br /> 281,3<br /> <br /> AB<br /> <br /> 640<br /> <br /> 281,3<br /> <br /> A<br /> <br /> 160<br /> <br /> 5,0<br /> <br /> B<br /> <br /> 80<br /> <br /> 2,5<br /> <br /> O<br /> <br /> 80<br /> <br /> 2,5<br /> <br /> AB<br /> <br /> 160<br /> <br /> 5,0<br /> <br /> 2,28<br /> <br /> Bean Pole<br /> <br /> A - Delta dạng<br /> A - Delta<br /> leo<br /> <br /> HĐC<br /> <br /> 31,8<br /> <br /> CAO ĐĂNG NGUYÊN, NGUYỄN THỊ CẨM HẠNH<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> Bean<br /> Cora<br /> Đậu cove hạt<br /> White Seeds<br /> trắng dạng leo<br /> Pole type<br /> <br /> Đậu cove green Bean<br /> Pole<br /> lake hạt trắng<br /> Green<br /> lake<br /> White Seeds<br /> dạng leo<br /> <br /> Bean<br /> Cora<br /> Đậu cove hạt đen<br /> Geen<br /> Lake<br /> dạng leo<br /> White Seeds<br /> <br /> Bean Pole<br /> A - Hiland dạng<br /> A - Hiland<br /> leo<br /> <br /> A<br /> <br /> 20<br /> <br /> 0,3<br /> <br /> B<br /> <br /> 20<br /> <br /> 0,3<br /> <br /> O<br /> <br /> 20<br /> <br /> 0,3<br /> <br /> AB<br /> <br /> 40<br /> <br /> 0,7<br /> <br /> A<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> B<br /> <br /> 160<br /> <br /> 151,4<br /> <br /> O<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> AB<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> A<br /> <br /> 160<br /> <br /> 3,2<br /> <br /> B<br /> <br /> 320<br /> <br /> 6,5<br /> <br /> O<br /> <br /> 160<br /> <br /> 3,2<br /> <br /> AB<br /> <br /> 320<br /> <br /> 6,5<br /> <br /> A<br /> <br /> 320<br /> <br /> 11,6<br /> <br /> B<br /> <br /> 320<br /> <br /> 11,6<br /> <br /> O<br /> <br /> 40<br /> <br /> 1,5<br /> <br /> AB<br /> <br /> 160<br /> <br /> 5,8<br /> <br /> 57,5<br /> <br /> 1,06<br /> <br /> 49,6<br /> <br /> Đậu cove<br /> 6<br /> <br /> 113<br /> <br /> 27,6<br /> <br /> Ghi chú. Đv: Đơn vị hoạt độ gây ngưng kết; HĐC: Hoạt độ chung; HĐR: Hoạt độ<br /> riêng.<br /> <br /> Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, cả 6 giống đậu cove đều có khả năng gây ngưng<br /> kết mạnh với tất cả các nhóm máu của người. Trong đó giống đậu cove hạt trắng dạng<br /> bụi (White Bean Cora Bush types White seeds) có khả năng ngưng kết mạnh nhất. Tuy<br /> nhiên, cả 6 giống đã được điều tra không có giống nào đặc hiệu với một trong các nhóm<br /> máu của người.<br /> Trên cơ sở đó chúng tôi sử dụng giống cove hạt trắng dạng bụi để làm đối tượng<br /> nghiên cứu một số tính chất khác.<br /> 3.2. Tinh chế lectin đậu cô ve<br /> - Tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion<br /> Sau khi chiết rút lectin dịch thô được kết tủa (NH4)2SO4 60% bão hòa, kết tủa<br /> được hòa tan trở lại trong đệm rồi thẩm tích qua đêm. Tiếp theo dịch được thẩm tích<br /> được cho lên cột sắc ký trao đổi ion qua DEAE-Sephadex A-25 đã chuẩn bị từ trước.<br /> Kết quả sau khi qua cột sắc ký DEAE – Sephadex A-25 được trình bày ở hình<br /> 3.1 và các bước tinh sạch được trình bày tóm tắt trên bảng 3.2.<br /> <br /> Điều tra, tinh sạch và tìm hiểu tính chất đặc trưng…<br /> <br /> 114<br /> <br /> Từ kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.1 cho ta thấy: protein được rút ra từ phân đoạn<br /> 1 – 62, trong đó tập trung chủ yếu từ đoạn 4 – 13. Hoạt tính của lectin nằm ở các phân<br /> đoạn từ 2 – 13, trong đó tập trung từ đoạn 6 – 9. Đặc biệt ở phân đoạn 8 lectin có hoạt<br /> tính cao nhất (10240 Đv/ml), có độ sạch gấp 52 lần so với dịch thô ban đầu. Tuy nhiên<br /> hiệu suất thu hồi protein chỉ khoảng 2% .<br /> HĐR x 103<br /> <br /> 12<br /> <br /> Protein<br /> (mg/ml)8<br /> <br /> Protein<br /> HĐR<br /> <br /> 10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 6<br /> <br /> 6<br /> <br /> 5<br /> <br /> 4<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3<br /> <br /> 3<br /> <br /> 2<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62<br /> <br /> Phân đoạn<br /> Hình 3.1. Đường biểu diễn kết quả tính sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion trên sephadex A-25<br /> Bảng 3.2. Tóm tắt các bước tinh sạch lectin đậu cove (Phaseolus vulgaris L.) qua cột DEAE –<br /> Sephadex A-25<br /> <br /> Các bước tinh<br /> sạch<br /> Loại mẫu<br /> <br /> Protein<br /> <br /> HĐC<br /> <br /> HĐR<br /> <br /> mg/l<br /> <br /> %<br /> <br /> Đv/ml<br /> <br /> %<br /> <br /> Đv/mgprotein<br /> <br /> Độ sạch<br /> <br /> 74,5<br /> <br /> 100<br /> <br /> 10240<br /> <br /> 100<br /> <br /> 137,42<br /> <br /> 1,00<br /> <br /> 28,3<br /> <br /> 37,99<br /> <br /> 20480<br /> <br /> 200<br /> <br /> 724,17<br /> <br /> 5,27<br /> <br /> Thẩm tích<br /> <br /> 22,7<br /> <br /> 30,47<br /> <br /> 20480<br /> <br /> 200<br /> <br /> 900,49<br /> <br /> 6,55<br /> <br /> DEAE-Cenlulose<br /> <br /> 1,42<br /> <br /> 1,91<br /> <br /> 10240<br /> <br /> 100<br /> <br /> 7207,00<br /> <br /> 52,44<br /> <br /> Dịch thô<br /> Kết<br /> (NH4)2SO4<br /> bão hòa<br /> <br /> tủa<br /> 60%<br /> <br /> - Điện di trên gel polyacrylamide<br /> Để kiểm tra độ tinh sạch và ban đầu tìm hiểu khối lượng phân tử lectin đậu cove<br /> hạt trắng dạng bụi, chúng tôi tiến hành điện di protein ở phân đoạn 8 trên gel<br /> polyacrylamide 12% trong điều kiện có SDS thu được kết quả trên hình 3.2.<br /> <br /> CAO ĐĂNG NGUYÊN, NGUYỄN THỊ CẨM HẠNH<br /> <br /> 115<br /> <br /> 97 kDa Phosphorylase<br /> 66 kDa Albumin<br /> 45 kDa Ovalbumin<br /> 30 kDa Cacbonic anhydrase<br /> 20,1kDa chất ức chế tripsin<br /> 14,4 kDa α-lactalbumin<br /> 3<br /> 6<br /> 5<br /> 4<br /> 2<br /> 1<br /> 1. Protein chuẩn<br /> 2, 3. Mẫu dịch thô<br /> 4. Mẫu sau kết tủa<br /> 5. Mẫu sau thẩm tích<br /> 6. Sau sắc ký qua cột DEAE- Sephadex A-25<br /> <br /> Hình 3.2. Ảnh kết quả điện di trên gel polyacrylamide -SDS<br /> <br /> Mẫu sau khi qua cột, trên hình ảnh điện di cho thấy các băng có khối lượng phân<br /> tử nằm trong khoảng 30 – 97 kDa. Đặc biệt trong đó có một băng đậm khoảng 35 kDa.<br /> Rất có thể đây là lecin đậu mà chúng tôi đang nghiên cứu.<br /> 3.3. Một số tính chất lý - hóa của lectin đậu cô ve<br /> - Đặc hiệu nhóm máu<br /> Tính chất đặc hiệu nhóm máu của lectin có ý nghĩa quan trọng, có thể sử dụng<br /> tính chất này để xác định và phân loại nhóm máu trong huyết học mà không cần có<br /> kháng nguyên gốc.<br /> Để tìm hiểu tính chất này đối với lectin đang nghiên cứu, chúng tôi tiến hành<br /> trên các nhóm máu A, B, O, AB, trâu, bò lợn và thu được kết quả ở bảng 3. 3.<br /> Bảng 3.3. Đặc hiệu nhóm máu của lectin đậu cô ve hạt trắng dạng bụi<br /> <br /> Nhóm<br /> máu<br /> <br /> HĐC<br /> <br /> HĐR<br /> <br /> (Đv/ml)<br /> <br /> (Đv/mg protein)<br /> <br /> A<br /> <br /> 320<br /> <br /> 140,7<br /> <br /> B<br /> <br /> 640<br /> <br /> 281,3<br /> <br /> O<br /> <br /> 640<br /> <br /> 281,3<br /> <br /> AB<br /> <br /> 640<br /> <br /> 281,3<br /> <br /> Bò<br /> <br /> 80<br /> <br /> 35,2<br /> <br />