Định danh Ngải trắng tại An Giang bằng phương pháp giải trình tự

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

7
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ngải trắng (Curcuma aromatica) hay còn gọi là nghệ trắng là loài dược liệu thuộc chi Nghệ, họ Gừng phát triển trên địa bàn tỉnh An Giang. Bên cạnh dược tính điều trị rắn cắn, cầm máu, làm lành vết thương từ xa xưa; gần đây, Ngải trắng còn được biết đến như là một loại dược liệu tiềm năng trong hỗ trợ điều trị các loại ung thư. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích phân biệt Ngải trắng và các loài cùng họ gừng bằng phương pháp giải trình tự gen.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Định danh Ngải trắng tại An Giang bằng phương pháp giải trình tự

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học ĐỊNH DANH NGẢI TRẮNG TẠI AN GIANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ Đỗ Đức Minh*, Lê Kiều Minh*, Nguyễn Đức Hạnh**, Huỳnh Thị Ngọc Huê***, Võ Thanh Hóa****, Huỳnh Thanh Tuấn* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Ngải trắng (Curcuma aromatica) hay còn gọi là nghệ trắng là loài dược liệu thuộc chi Nghệ, họ Gừng phát triển trên địa bàn tỉnh An Giang. Bên cạnh dược tính điều trị rắn cắn, cầm máu, làm lành vết thương từ xa xưa; gần đây, Ngải trắng còn được biết đến như là một loại dược liệu tiềm năng trong hỗ trợ điều trị các loại ung thư. Tuy nhiên, việc xác định chính xác Ngải trắng trong số các loài cây cùng họ trên địa bàn An Giang còn gặp nhiều khó khăn do tính tương đồng về hình thức thực vật giữa các loài cây trong họ này. Mục tiêu: Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích phân biệt Ngải trắng và các loài cùng họ gừng bằng phương pháp giải trình tự gen. Phương pháp: 6 mẫu thực vật trên địa bàn tỉnh An Giang được cho là Ngải trắng được thu thập và khảo sát trình tự trnSfM bằng phương pháp giải trình tự Sanger. Kết quả: Trong số 6 mẫu Ngải trắng thu thập trên địa bàn tỉnh An Giang, kết quả giải trình tự gen cho thấy 3 mẫu là Curcuma aromatica, 2 mẫu là Curcuma longa (Nghệ vàng) và 1 mẫu là Curcuma zedoaria (Nghệ đen). Kết luận: Giải trình tự Sanger là phương pháp hiệu quả, đáng tin cậy trong việc phân biệt Ngải trắng và các loài cây họ gừng. Từ khóa: Ngải trắng; định danh; giải trình tự gen ABSTRACT INDENTIFICATION OF CURCUMA AROMATICA GROWING IN AN GIANG PROVINCE BY SANGER SEQUENCING Do Duc Minh, Le Kieu Minh, Nguyen Duc Hanh, Huynh Thi Ngoc Hue, Vo Thanh Hoa, Huynh Thanh Tuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 22 - No 2- 2018: 34 - 39 Background: Curcuma aromatica (also known as Wild turmeric) growing at An Giang province is an herb belongs to Zingiberaceae family with the sub family Zingiberoideae. It is known to reduce the development of tumors (Anti-tumor activity) through multiple pathways and a potential candidate for complementary medicine for cancer patients. Objectives: This study was performed to identify Curcuma aromatica growing at An Giang province by Sanger sequencing. Methods: 6 samples considered Curcuma aromatica were collected from An Giang province. All specimens were then identified based on their trnSfM sequences by Sanger sequencing. Result: Sanger sequencing results from 6 collected samples showed that 3 samples were C. aromatica, 2 were C. longa and 1 sample was C. zedoaria. Conclusion: Sanger sequence is an effective and accurate method for differentiate C. aromatica from other similar species. Keywords: Curcuma aromatica; identification; Sanger sequencing * Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược Tp. HCM ** Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp. HCM *** Đại học An Giang **** Khoa Y học cổ truyền, Đại học Y Dược Tp. HCM Tác giả liên lạc: Huỳnh Thanh Tuấn ĐT: 0938489640 Email: drtuan@ump.edu.vn 35
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 ĐẶT VẤN ĐỀ Sasaki và cs. đã dựa vào sự thay đổi trong các trình tự ITS này để thiết kế các đoạn mồi của Từ thời xa xưa dược liệu Ngải trắng một phức hợp các phản ứng PCR nhằm phân (Curcuma aromatica) được dùng nhiều ở Ấn Độ biệt các loài thực vật thuộc họ gừng(11). Sau đó, như một thuốc cổ truyền có tác dụng bổ âm, Minami và cs. đã cải tiến quy trình nghiên cứu nhuận trường, điều trị rắn cắn và cầm máu. Dịch nhằm định danh các loài ngải thu được từ Nhật chiết xuất từ Ngải trắng (NT) cũng đã được Bản, Việt Nam, Đài Loan, Indonesia, Thái Lan và dùng để chữa chứng đầy hơi, thấp khớp và kiết Trung Quốc mà trong đó chủ yếu phân biệt giữa lỵ. Lá của NT cũng được dùng để làm lành vết 3 loài có đặc điểm gần giống nhau nhất là C. thương, điều trị gãy xương. NT cũng được dùng aromatica, C. longa và C. zedoaria dựa vào kết quả trong điều trị giun sán và điều trị thai lưu trong vùng trình tự ITS trnS-trnfM (trnSfM)(8). các bộ tộc cổ Ấn Độ(1). Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Gần đây ngoài phương pháp điều trị ung phương pháp của nhóm nghiên cứu của tác giả thư kinh điển như phẫu thuật, xạ trị và hóa trị Minami để khuếch đại và giải trình tự vùng ITS thì xu hướng kết hợp giữa điều trị qui ước và các trnS-trnfM của các loài ngải vì đây là khu vực chiết xuất kháng ung thư có nguồn gốc tự nhiên gen chứa các đặc điểm di truyền giúp phân biệt (natural products) đang mở ra nhiều hứa hẹn(2,3). được 3 loài C. aromatica, C. longa và C. zedoaria(8). Sự phối hợp giữa hợp chất tự nhiên với điều trị qui ước có thể khắc phục tình trạng ung thư ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU kháng trị liệu ngày nay đang có khuynh hướng Đối tượng nghiên cứu gia tăng(9). Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng Các mẫu thực vật được cho là NT (Curcuma NT có tác dụng giảm sự phát triển của bướu aromatica) được thu thập từ tỉnh An Giang, Việt (Anti-tumour activity), glioma của ung thư Nam và lưu giữ tại Trung tâm Y sinh học Phân não(7), ức chế sự phát triển của bướu gan trên tử, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh. DNA được mô hình động vật(12). Chiết suất cao của NT phân lập từ 50-100 mg mô tươi thân rễ của các (aqueous extract of Curcuma aromatica) còn có tác mẫu thực vật này bằng cách sử dụng bộ DNeasy dụng trên ung thư đại tràng(5), cũng như ngăn Plant Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo hướng dẫn ngừa tiến triển dẫn đến ung thư viêm thực quản của nhà sản xuất. mãn tính hay loạn sản thực quản như bệnh Phương pháp nghiên cứu Barrett’s(6). Khảo sát đặc điểm thực vật NT thuộc chi Nghệ (Curcuma), họ này bao gồm hơn 50 loài phân bố ở khu vực Đông Nam Mô tả chi tiết đặc điểm hình thái về rễ, thân, Á trong đó khoảng 12 loài phân bố tại Trung lá, hoa, quả để định danh chính xác cây bằng Quốc. Thân rễ của các loài thuộc nhóm này có cách đối chiếu tài liệu, tham khảo ý kiến chuyên hình dáng đại thể và vi thể khá tương đồng, điều gia. Nhằm thuận lợi cho việc nguyên cứu và bảo này làm cho việc định danh chính xác từng loài tồn giống sau này. gặp khá nhiều khó khăn. Tuy nhiên, với sự phát Định danh cây Ngải trắng (Curcuma triển của công nghệ giải trình tự DNA, việc định aromatica) bằng phương pháp giải trình tự danh các loài thực vật hiện tại đã trở nên dễ gen Sanger dàng và chính xác hơn. Intergenic spacers (ITS) Phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự là các vùng trình tự không phiên mã nằm trong trnS-trnfM trong DNA lục lạp (Chloroplast DNA của ribosome (rDNA), các vùng trình tự DNA: cpDNA) của các mẫu NT này thường kém được bảo tồn, thay đổi nhiều Việc khuếch đại vùng trình tự trnS-trnfM của trong tiến hóa của thực vật và thường được cpDNA từ tất cả các mẫu được thực hiện bằng dùng để phân biệt các loài trong cùng một họ(4). 36
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học primer trnSfM (Bảng 1). Phản ứng PCR được Các sản phẩm PCR được tinh sạch bằng cách thực hiện trong hỗn hợp có chứa TaKaRa LA sử dụng bộ kit ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Taq DNA Polymerase (Takara, Nhật Bản), Reagent (Thermo Fisher Scientific) theo hướng primer 10 pmol và tổng lượng DNA 20-50 ng. dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR đã được Sự khuếch đại được thực hiện trong máy luân tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng cycle nhiệt (Eppendorf Mastercycler Nexus, sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Eppendorf, Đức). Các điều kiện PCR được sử Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo dụng như sau: 98oC trong 2 phút tiếp theo là 35 chiều xuôi với các mồi F trong Bảng 1. Sản phẩm chu kì trong 15 giây ở 98oC, 30 giây ở 55oC, 90 sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong giây ở 68oC, và kéo dài cuối cùng trong 7 phút ở Hi-Di formanide, biến tính ở 95oC trước khi làm 72oC. Các sản phẩm của PCR được tách bằng lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng điện di trên gel agarose 2% (w/v) trong bộ đệm máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 1X TBE và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, (UV). Các phản ứng luôn kèm theo một chứng Mỹ). Kết quả giải trình tự DNA được phân tích âm không chứa DNA để kiểm soát ngoại bằng phần mềm CLC Main Workbench. Kết quả nhiễm. trình tự thu được sẽ được so sánh với trình tự Giải trình tự sản phẩm PCR tham khảo từ công trình nghiên cứu của Minami và cs để hợp để phân biệt giữa các loài C. longa, C. aromatica, C. zedoaria, và C. Xanthorrhiza(8). Bảng 1. Mồi được dùng trong nghiên cứu này o Vị trí Primer Trình tự (5’– 3’) Chiều dài (bp) Nhiệt độ bắt cặp ( C) Tham khảo trnSfM-f GAGAGAGAGGGATTCGAACC Minami và cs. trnS-trnfM 1475 62 trnSfM-r CATAACCTTGAGGTCACGGG 2009 KẾT QUẢ Sau khi nghiên cứu về mặt thực vật học 6 Khảo sát đặc điểm thực vật: mẫu gần như không phân biệt được, rất giống nhau, chỉ có khác nhau rất ít về đặc điểm bên Hiện nay tại An Giang, có rất nhiều mẫu ngoài và mùi vị của thân rễ (hình 1). Tuy nhiên, dược liệu có tên Ngải trắng, Nghệ trắng. Theo các đặc điểm khác biệt này khi đối chiếu với các người dân và một số Lương y tại địa phương, tài liệu tham khảo về thực vật của loài Curcuma 2 loài này là khác nhau. Tuy nhiên theo các tài aromatica, thì các tài liệu không đề cập đến các liệu chuyên ngành về Thực vật học thì cùng đặc điểm này. một loài thuộc họ Gừng Zingiberaceae là Curcuma aromatica. Các chuỗi DNA trong vùng trnSfM của các loài Curcuma được khuếch đại thành công (có Nhóm nghiên cứu đã thu dược 6 loài mà chiều dài khoảng 1475 bp) (Hình 2). người dân gọi là Ngải trắng hoặc Nghệ trắng tại các vùng Long Xuyên, Tri Tôn, Tịnh Biên. Các Kết quả giải trình tự các chuỗi DNA này cho mẫu này được thu thập, lưu giữ và trồng bảo tồn thấy có hai sự thay thế base, hai lần xóa base, và mẫu giống. Đã tiến hành nghiên cứu về mặt có sự khác nhau trong số lượng của adenine - thực vật học, nghiên cứu về cấu tạo giải phẫu thymine (AT) lặp lại. Ngoài ra, các đa hình DNA của bộ phận dùng chính (thân rễ), chụp hình để ở ba vị trí (các vị trí nucleotide 176, 207, và 216- lưu lại hình ảnh làm tài liệu đối chiếu, lưu trữ. 237 từ đầu 5' của mồi xuôi) phân chia các loài Các mẫu lần lượt được kí hiệu M4, M5, M14, Curcuma thu được thành ba kiểu haplotypes M15, M17 và LY theo thứ tự và địa điểm thu khác nhau: G- (AT) 8 là C. aromatica, A- (AT) 6 là thập. C. longa, và G- (AT) 5 là C. zedoaria. 37
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Hình 1. Thân rễ của các mẫu có cùng tên gọi là Ngải trắng tại An Giang Định danh NT bằng kết quả giải trình tự Sanger Hình 2. Kết quả khuếch đại trình tự tnrSfM của 6 mẫu thực vật Số lần lặp lại AT trong các đoạn nucleotide lại trong C. aromatica là 8-AT (G- (AT) 8), trong từ base số 216 đến base số 237 có thể được dùng khi C. longa là 6-AT lặp lại (A- (AT) 6 và những để phân biệt các loài Curcuma. Số AT lặp đi lặp 38
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học mẫu C. zedoaria đã có sự lặp lại là 5-AT (A- (AT) mẫu thu mà chúng tôi thu nhận được, mẫu M5, 5). M14, M15 phù hợp với C. aromatica; mẫu M4, Kết quả phân biệt các loài curcuma được tóm M17 phù hợp với C. longa, mẫu LY phù hợp với tắt trong bảng 2. Từ kết quả trên cho thấy trong 6 C. zedoaria. Bảng 2. Các đặc điểm di truyền và kết quả định danh các mẫu thực vật Vị trí nucleotide Mẫu Haplotype Kích thước (bp) Loài 176 207 216-237 M5 8 8 M14 G-(AT) G _ (AT) 227 C. aromatica M15 M4 6 6 A-(AT) A _ (AT) 229 C. longa M17 5 5 LY G-(AT) G _ (AT) 232 C. zedoaria BÀN LUẬN KẾT LUẬN Sự phân biệt các cây thuốc cùng họ là rất Giải trình tự gen Sanger là phương pháp quan trọng để thực hiện việc xác định và chứng chính xác và hiệu quả để phân biệt Ngải trắng thực các nguyên liệu của thuốc để ngăn ngừa sự với các loài tương tự khác cùng họ. pha trộn trong ngành công nghiệp thuốc thảo TÀI LIỆU THAM KHẢO dược. 1. Amani S, Harini A, Hegde Prakash L (2015). Pharmacological Gần đây, Rafi và cs sử dụng một phương activities of wild turmeric (Curcuma aromatica Salisb): a pháp để xác định các loài Curcuma sử dụng phân review. J Pharmacogn Phytochem, 3(5):01–04 2. Bailly C (2009). Ready for a comeback of natural products in tích thin layer chromatography (TLC) fingerprint oncology. Biochem Pharmacol, 77(9):1447–1457 bằng cách nhận diện các vùng khác nhau sử 3. Basmadjian C, Zhao Q, Bentouhami E, et al (2014). Cancer wars: natural products strike back. Front Chem, 2:20 dụng ánh sáng UV (254 and 366 nm)(10). Ngoài 4. Guarro J, GenéJ null, Stchigel AM (1999). Developments in ra, nghiên cứu của Minami và cs cũng đã thành fungal taxonomy. Clin Microbiol Rev, 12(3):454–500 công trong việc sử dụng trình tự ITS trnSfM để 5. Hu B, Shen K-P, An H-M, Wu Y, Du Q (2011). Aqueous extract of Curcuma aromatica induces apoptosis and G2/M định danh bốn loài Curcuma bao gồm C. longa, C. arrest in human colon carcinoma LS-174-T cells independent aromatica, C. zedoaria, và C. xanthorrhiza(8). Mặc of p53. Cancer Biother Radiopharm, 26(1):97–104 dù phân tích số lần lặp lại AT trong vùng trnSfM 6. Li Y, Wo JM, Liu Q, Li X, Martin RCG (2009). Chemoprotective effects of Curcuma aromatica on esophageal đòi hỏi các bước phức tạp hơn, cụ thể là giải carcinogenesis. Ann Surg Oncol, 16(2):515–523 trình tự DNA, và tốn thời gian, phương pháp 7. Liu B, Gao Y-Q, Wang X-M, Wang Y-C, Fu L-Q (2014) Germacrone inhibits the proliferation of glioma cells by này có thể xác định chính xác được các loài promoting apoptosis and inducing cell cycle arrest. Mol Med Curcuma. Trong nghiên cứu của chúng tôi, các Rep, 10(2):1046–1050 chuỗi DNA trong vùng trnSfM của các loài 8. Minami M, Nishio K, Ajioka Y, Kyushima H, Shigeki K, Kinjo K, Yamada K, Nagai M, Satoh K, Sakurai Y (2009. Curcuma cho thấy có hai sự thay thế base, hai lần Identification of Curcuma plants and curcumin content level xóa base, và có sự khác nhau trong số lượng của by DNA polymorphisms in the trnS-trnfM intergenic spacer in chloroplast DNA. J Nat Med, 63(1):75–79 adenine - thymine (AT) lặp lại. Ngoài ra, các đa 9. Nabekura T (2010). Overcoming Multidrug Resistance in hình DNA ở ba vị trí (các vị trí nucleotide 176, Human Cancer Cells by Natural Compounds. Toxins, 207, và 216-237 từ đầu 5' của mồi xuôi) phân chia 2(6):1207–1224 10. Rafi M, Rohaeti E, Miftahudin A, Darusman LK (2011). các loài Curcuma thu được thành ba kiểu Differentiation of Curcuma longa, Curcuma xanthorrhiza and haplotypes khác nhau: G- (AT) 8 là C. aromatica, Zingiber cassumunar by thin layer chromatography A- (AT) 6 là C. longa, và G- (AT) 5 là C.zedoaria. fingerprint analysis. Indones J Chem, 11(1):71–74 11. Sasaki Y, Fushimi H, Cao H, Cai S-Q, Komatsu K (2002). Kết quả này khá tương đồng với kết quả định Sequence analysis of Chinese and Japanese Curcuma drugs danh các loài Curcuma đã được thực hiện trong on the 18S rRNA gene and trnK gene and the application of nghiên cứu của tác giả Minami và cs(8). 39
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 amplification-refractory mutation system analysis for their Ngày nhận bài báo: 13/11/2017 authentication. Biol Pharm Bull, 25(12):1593–1599 12. Wu W-Y, Xu Q, Shi L-C, Zhang W-B (2000). Inhibitory effects Ngày phản biện nhận xét bài báo: 14/11/2017 of Curcuma aromatica oil on proliferation of hepatoma in Ngày bài báo được đăng: 10/03/2018 mice. World J Gastroenterol, 6(2):216–219. 40