Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng, phát triển của lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight in vitro

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:158

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát ảnh hưởng của đường đơn (glucose, fructose), đường đôi (lactose) và đường đa (manitol, sorbitol) lên sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) trong nhân giống in vitro. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng, phát triển của lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA CNSH – TP – MT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON LÊN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA LAN VŨ NỮ ONCIDIUM KOZUMIT DELIGHT IN VITRO Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học GVHD : Th.S. Trịnh Thị Lan Anh SVTH : Phan Hồng Nhung Lớp : 15HSH01 TP. HCM, 08/2016
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Trịnh Thị Lan Anh – giảng viên Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Đề tài được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, thuộc Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Các số liệu và bảng trong bài là hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu phát hiện có bất kì gian lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP.HCM, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực hiện Phan Hồng Nhung i
LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đồ án mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin. Đặc biệt cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Trịnh Thị Lan Anh – người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và cung cấp những tư liệu quý giá cho em thực hiện tốt bài đồ án tốt nghiệp này. Cảm ơn cô đã tiếp thêm cho em niềm tin và nghị lực để định hướng cho tương lai. Qua bài đồ án này, em cũng xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em tiếp cận và học hỏi nhiều kinh nghiệm trong quá trình làm đồ án. giúp em nắm vững những kiến thức đã học. Bên cạnh đó, em cũng xin cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm đồ án. Cảm ơn các bạn phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đã giúp đỡ, hỗ trợ mình trong suốt quá trình làm đồ án. Cuối cùng em kính chúc Quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp trồng người. TP.Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực hiện đồ án Phan Hồng Nhung ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN………………………………………………………………...i LỜI CÁM ƠN……………………………………………………………………ii MỤC LỤC……………………………………………………………………….iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………...vi DANH MỤC BẢNG……………………………………………………………vii DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………......ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ………………………………………………………...xi MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………1 1. Đặt vấn đề……………………………………………………………………..1 2. Mục đích nghiên cứu………………………………………………………….3 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu………………………………………..…...3 4. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………...3 5. Kết quả đạt được……………………………………………………………....3 6. Kết cấu của đề tài……………………………………………………………...4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………..5 1.1. Khái niệm nhân giống in vitro………………………………………………..5 1.2. Nguồn carbon…………………………………………………………….......5 1.3. Giới thiệu một vài nguồn carbon…………………………………………….6 1.3.1. Glucose…………………………………………………………………….6 1.3.2. Fructose……………………………………………………………………8 1.3.3. Lactose……………………………………………………………………9 1.3.4. Manitol…………………………………………………………………...11 1.3.5. Sorbitol…………………………………………………………………...12 1.4. Vai trò của nguồn carbon cho sự tăng trưởng và phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro…………………………………………………………...14 iii
1.4.1. Giới thiệu vai trò của nguồn carbon trong nuôi cấy in vitro………………13 1.4.2. Vai trò của nguồn carbon cho sự tăng trưởng và phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro……………………………………………………..16 1.5. Ảnh hưởng của nguồn carbon trong nuôi cấy in vitro………………………18 1.6. Tình hình sản xuất, giá trị kinh tế hoa lan trên thế giới và Việt Nam………20 1.6.1. Tình hình sản xuất lan trên thế giới……………………………………….20 1. 6.2. Tình hình sản xuất lan ở Việt Nam………………………………………21 1.6.3. Tình hình sản xuất lan Vũ nữ……………………………………………..23 1.7. Giới thiệu về lan Vũ nữ……………………………………………………..23 1.7.1. Phân loại khoa học………………………………………………………..23 1.7.2. Nguồn gốc và sự phân bố…………………………………………………24 1.7.3. Đặc điểm hình thái sinh học………………………………………………25 1.7.4. Điều kiện sinh thái của lan Vũ nữ………………………………………...27 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP……………………………..30 2.1. Địa điểm tiến hành đề tài……………………………………………………30 2.2. Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………………30 2.2.1. Vật liệu……………………………………………………………………30 2.2.2. Môi trường nuôi cấy………………………………………………………30 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm……………………………………………………...30 2.3. Phương pháp………………………………………………………………...31 2.3.1. Cách pha môi trường……………………………………………………...31 2.3.2. Hấp khử trùng……………………………………………………………..31 2.4. Bố trí thí nghiệm…………………………………………………………….32 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)….32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight…..33 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của lactose lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)….33 iv
2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)…34 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)….35 2.5. Chỉ tiêu theo dõi…………………………………………………………….36 2.6. Thống kê và xử lý số liệu…………………………………………………...36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………….37 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)………….37 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)………….44 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)…………..51 3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)………….58 3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)………….64 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………….73 4.1. Kết luận……………………………………………………………………..73 4.2. Kiến nghị……………………………………………………………………73 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................75 v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EU European Union Tp. HCM Thành phố Hồ Chí Minh DNA Deoxyribonucleic acid P Phường Q Quận MS Murashige và Skoog (1962) NAA Naphthyl acetic acid BA 6-benzylaminopurine 2,4-D 2,4-dichlopophenoxyacetic acid vi
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)……..32 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)……..33 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)…….34 Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)……..35 Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)…….35 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy…………………………………………………..38 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi………………………………………………………45 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy…………………………………………………53 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy…………………………………………………59 vii
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy…………………………………………………..66 viii
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Lan Vũ nữ……………………………………………………………..24 Hình 1.2. Rễ của lan Vũ nữ……………………………………………………...25 Hình 1.3. Thân của lan Vũ nữ…………………………………………………...26 Hình 1.4. Hoa lan Vũ nữ………………………………………………………...27 Hình 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)……………………40 Hình 3.2. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………..41 Hình 3.3. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………47 Hình 3.4. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………48 Hình 3.5. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với ix
nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)……………………55 Hình 3.6. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)……………………..56 Hình 3.7. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)……………………61 Hình 3.8. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)……………………62 Hình 3.9. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (E0; E1; E2; E3; E4; E5 tương ứng với nồng độ đường sorbitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)……………………68 Hình 3.10. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (E0; E1; E2; E3; E4; E5 tương ứng với nồng độ đường sorbitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………...69 x
DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………39 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)………………..46 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)………………..54 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………60 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (E0; E1; E2; E3; E4; E5 tương ứng với nồng độ đường sorbitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)…………………67 xi
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Tình hình kinh tế trên thế giới trong những năm gần đây biến động khá phức tạp. Nền kinh tế của Việt Nam cũng chịu nhiều ảnh hưởng. Đến năm 2015, nền kinh tế nước ta mới có sự chuyển biến. Trong đó, ngành nông nghiệp là ngành phát triển mạnh mẽ. Trong đầu năm 2015, ngành nông nghiệp đã tăng đáng kể và chiếm tỷ trọng lớn nhất (71%) trong nền kinh tế Việt Nam. Cùng với những thành tựu đạt được trong nền sản xuất nông nghiệp, ngành sản xuất hoa lan cũng có những bước tiến đáng kể. Hiện nay lan Vũ nữ nói chung và các loại lan khác nói riêng đang được xem là cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao. Hoa lan là loại cây mang lại nhiều lợi nhuận cho các trung tâm, doanh nghiệp cũng như nhiều hộ gia đình nhờ việc cung cấp trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài. Nhiều nước trên thế giới kinh doanh xuất khẩu hoa lan như: Đài Loan, Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ, Singapore, Thái Lan, Malaysia, Philippin, Indonesia,… Trong đó, Thái Lan là nước điển hình về trồng và xuất khẩu hoa lan. Diện tích trồng Lan lên đến 3,718 ha, đứng đầu bảng là 2 loại Derobium và Mokara; kế đến là Oncidium, Aranda, Arachinis, Vanda, Ascodenda, Catteya,... Trong đó, Thái Lan là nước điển hình về trồng và xuất khẩu hoa lan. Diện tích trồng Lan lên đến 3,718 ha, đứng đầu bảng là 2 loại Derobium và Mokara; kế đến là Oncidium, Aranda, Arachinis, Vanda, Ascodenda, Catteya,... Ở Việt Nam, các vùng trồng hoa lan phổ biến như Tây Nguyên, Đà Lạt, Yên Bái, Sa Đéc, Tp. Hồ Chí Minh,… nhưng tập trung chủ yếu ở Đà Lạt (Địa Lan), Tp. Hồ Chí Minh (Denrobium, Mokara, Vanda, Oncidium,…) với diện tích khá khiêm tốn khoảng 200 ha chỉ bằng 5,4% so với Thái Lan. Thái Lan xuất khẩu đến 38 nước trên thế giới trong đó có Việt Nam, đạt giá trị 104 triệu USD (2009). Trong khi đó Tp. Hồ Chí Minh với 168 ha Lan, sản lượng hàng năm mới chỉ giải quyết được khoảng 30% nhu cầu tại chỗ. Một vài công ty cũng xuất khẩu đến Mỹ, Nhật với Mokara cắt cành, tuy chất lượng đạt yêu cầu nhưng giá thành khá cao nên khó có thể cạnh tranh với Thái Lan. Nếu phải xuất một lượng lớn trong thời gian dài theo hợp đồng thì nước ta không thể đáp ứng được. 1
Nhân giống in vitro đã được chứng minh là một công nghệ tiềm năng cho sản xuất quy mô lớn các loài thực vật (Wawrosch et al., 2001; Martin, 2003; Azad et al., 2005; Hassan và Roy, 2005; Hassan et al., 2009). Lan Vũ nữ là loại lan có hoa nhỏ mọc thành từng chùm, đẹp, bền với nhiều màu sắc và hoa văn phong phú, nhưng lại là loài sinh trưởng chậm và là loài rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân giống thấp trong vườn ươm và rất dễ nhiễm bệnh. Để có số lượng lớn cây giống đồng đều, chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu thị trường còn gặp nhiều khó khăn. Trong những năm gần đây, công nghệ lai giống kết hợp gieo hạt trong ống nghiệm nhằm đem đến sự đa dạng về màu sắc, cấu trúc, kích thước hoa sau mỗi thế hệ lai. Tuy nhiên, việc nhân giống bằng phương pháp gieo hạt này mang tính ngẫu nhiên, thu được cây có tính trạng không yêu thích và gần như không thể có được cây con cho hoa đẹp như cây mẹ. Vì vậy, hiện nay các nhà nuôi cấy mô trong nước cũng như trên thế giới sử dụng phương pháp nuôi cấy mô in vitro cho tỷ lệ thành công cao mà vẫn tạo được dòng cây ổn định về mặt di truyền. Trong nuôi cấy in vitro, đường là nguồn carbon quan trọng đối với quá trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Mô và tế bào thực vật sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài và kích thước mô cấy nhỏ vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc cho các hoạt động biến dưỡng của tế bào, để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Nó đã được chứng minh rằng nồng độ đường ban đầu có thể ảnh hưởng đến các thông số khác nhau trong quá trình nuôi cấy tế bào thực vật, như tỷ số tăng trưởng, năng suất của sự trao đổi chất thứ cấp. Mô thực vật có khả năng hấp thụ một số đường khác nhau như đường sucrose, glucose, fructose, malnose, galatose, lactose, manitol, sorbitol, thậm chí tinh bột cũng được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy mô. Vì vậy tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng, phát triển của lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight in vitro” nhằm tìm ra nguồn carbon và nồng độ thích hợp cho việc nhân chồi, tạo cây hoàn chỉnh và gia tăng chất lượng cây giống. 2
2. Mục đích nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của đường đơn (glucose, fructose), đường đôi (lactose) và đường đa (manitol, sorbitol) lên sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) trong nhân giống in vitro. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight). Phạm vi nghiên cứu: bố trí thí nghiệm với các nồng độ khác nhau của các nguồn carbon (glucose, fructose, lactose, manitol và sorbitol) nhằm tìm ra nồng độ thích hợp nhất cho sự tăng trưởng của lan Vũ nữ. 4. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Các nghiệm thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần, ghi nhận kết quả trung bình. Các số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.0 và chương trình Microsoft Excel 2010®. 5. Kết quả đạt được - Xác định được nồng độ đường glucose thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. - Xác định được nồng độ đường fructose thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. - Xác định được nồng độ đường lactose thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. - Xác định được nồng độ đường manitol thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. - Xác định được nồng độ đường sorbitol thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. 3
6. Kết cấu của đề tài Đề tài bao gồm các chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái niệm nhân giống in vitro Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ khoa học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng duy truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quý hiếm để phục hồi giống cây trồng. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật vô trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. 1.2. Nguồn carbon Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật thường được cung cấp dưới dạng carbonhydrate, với những loại đường phổ biến như saccharose và glucose. Chất nền carbon vừa tham gia tổng hợp các thành phần của tế bào vừa cung cấp năng lượng đòi hỏi cho quá trình sinh trưởng và tồn tại của tế bào. Nó cũng cung cấp carbon cần thiết cho sự hình thành sản phẩm thông qua trao đổi trung gian Sự chuyển hóa của carbonhydrate bởi tế bào thực vật bao gồm con đường pentose phosphate, glycolysis và chu trình acid citric, mà cuối cùng sản xuất các tiền thân của các hợp chất thứ cấp. Nguồn carbon thông dụng nhất là saccharose, nồng độ thích hợp 2 – 3%. Gautheret (1959) cho rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường 5
saccharose và glucose là nguồn carbon tốt nhất, ở một số trường hợp đặc biệt cũng có thể dùng fructose, galactose và maltose để thay thế. Trong nuôi cấy dịch treo tế bào dừa cạn (C. roseus), khi thay đổi hàm lượng đường sucrose cho thấy có hiệu quả kích thích tích lũy alkaloid ở các nồng độ khác nhau Nguồn carbon được xem là yếu tố quan trọng trong sự trao đổi chất của tế bào thực vật, ảnh hưởng đến sự tích lũy alkaloid ở nuôi cấy tế bào huyền phù cây mộc hoa trắng (Holarrhena antidysenterica), anthocyanin từ tế bào huyền phù cây nho (V. vinifera), và shikonin khi nuôi cấy tế bào L. erythrorhizon. Khi nuôi cấy tế bào huyền phù nhân sâm (Panax spp) để sản xuất đồng thời ginseng saponin và ginseng polysaccharide, cả hai chất này đều có khả năng chống ung thư và có hoạt tính miễn dịch, sự thay đổi saccharose trong môi trường nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng lớn đến việc cải thiện hiệu suất của quá trình nuôi cấy. 1.3. Giới thiệu một vài nguồn carbon 1.3.1. Glucose Glucose là một monosaccharide có nhiều trong các loại trái cây chín. Glucose được Andreas Marggraf trích ly đầu tiên từ trái nho khô vào năm 1747. Tên glucose được Jean Dumas đặt vào năm 1838, tên glucose xuất phát từ tiếng Hy Lạp Glycos có nghĩa là đường hay ngọt. Cấu tạo của glucose được Emil Fisher khám phá vào khoảng thời gian cuối thế kỉ 19 đầu thế kỉ 20. Được tạo ra nhờ quá trình quang hợp của cây xanh dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời. Là thành phần quan trọng cố định trong máu (0,1 g/l), cung cấp năng lượng. Cơ thể dự trữ ở gan dưới dạng glycogen, nếu dư còn có thể tích trữ ở da dưới dạng mỡ nhờ chuyển hóa của insulin. Khi cơ thể hoạt động, dạng dự trữ sẽ chuyển hóa ngược lại thành glucose đồng thời phóng năng lượng. ➢ Tính chất vật lý - Khả năng kết tinh khó hơn saccharose - Tỉ trọng 1,54 g/cm3 6
- Dạng nóng chảy 146 – 150 độ C - Tinh thể không màu - Cấu trúc tinh thể - Hút ẩm mạnh hất thu 15% nước - Tồn tại chủ yếu ở dạng vòng pyran do sự nối vòng xảy ra giữa nhóm CHO (C1) và OH (C6). Do sự nối vòng này làm xuất hiện 1 trung tâm chiral nên tạo thêm 2 đồng phân quang học mới. 2 đồng phân này có thể chuyển đổi qua lại với nhau và thực tế trong không gian chúng không phẳng nên Haworth đã đề nghị không gian dang ghế và dạng thuyền cho glucose, trong đó thường gặp nhất là dạng ghê. - Trong dung dịch nước, glucose có thể tồn tại và chuyển hóa qua lại giữa 3 dạng (một dạng thẳng và 2 dạng vòng). Trong đó dạng vòng chiếm nhiều hơn. ➢ Tính chất hóa học a. Phản ứng oxi hóa khử Các tác nhân oxi hóa thường gặp: HIO4 dung dịch thuốc thử fehling, dung dịch brom, acid nitric b. Tham gia phản ứng khử Glucose có khả năng tham gia phản ứng khử tạo sorbitol hay acid glucose c. Phản ứng thế Glucose có thể tác dụng với 3 phân tử phenyl hydrazine tạo osazone Dựa vào hình dạng tinh thể oaone có thể xác định có mặt của glucose d. Phản ứng tạo liên kết glycoside Nhóm OH của glucose dễ dàng tham gia tạo liên kết với nhóm OH của các rượu khác nên được gọi là nhóm OH glycoside và liên kết tạo thành được gọi là liên kết glycoside. Ngoài ra các phân tử đường đơn còn có thể tạo ra liên kết dạng S-glycoside, O-glycoside, N-glycoside. Điều này giúp tạo các chất có hoạt tính hóa học khác nhau như protein, cellulose… 7
e. Phản ứng lên men f. Phản ứng caramel g. Phản ứng với nito ➢ Nguồn gốc Có trong hoa quả chín và đặc biệt là nho chính nên đặc biệt được gọi là đường nho Phổ biến ở cả động vật lẫn thực vật. 1.3.2. Fructose ➢ Giới thiệu về fructose - Có cùng công thức phân tử với glucose nhưng khác về công thức cấu tạo - Là loại đường có nhiều trong trái cây - Khi ăn nhiều fructose và không có mặt glucose, fructose sẽ gây hiện tượng thẩm thấu (hút nước qua thành ruột non), vì thế fructose có tác dụng như một loại thuốc xổ. - Fructose có thể hấp thu trực tiếp qua cơ thể mà không cần đến insulin như glucose ➢ Tính chất vật lý fructose - Kết tinh trong H2O thì fructose có hình kim, tinh thể 2C6H12O6.H2O - Dễ tan trong nước - Quay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang trái, D-Fructose = -92 và beta D- - Fructose = -133.5 - Tỉ trọng 1.047 g/cm3 - Tnc = 102 – 104oC - Là gluxit có độ ngọt cao nhất - Hút ẩm rất mạnh hấp thu 30% nước. ➢ Tính chất hóa học - Cũng là đường khử như glucose nên tính chất hóa học giống nhau - Fructose dễ bị caramel hóa hơn glucose 8