Đồ án tốt nghiệp: Phân lập các chủng nấm Trichoderma spp. từ đất hồ tiêu ở Đồng Nai và đánh giá khả năng đối kháng của chúng với các nấm gây bệnh trong đất

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:97

Thêm vào BST

Báo xấu

47
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm tìm ra được chủng nấm Trichoderma trong đất hồ tiêu ở Đồng Nai có khả năng đối kháng với tác nhân gây bệnh trong đất; bổ sung thêm các chủng nấm Trichoderma có nguồn gốc ở vùng sinh thái mới vào bộ sưu tập của phòng thí nghiệm trường Hutech. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Phân lập các chủng nấm Trichoderma spp. từ đất hồ tiêu ở Đồng Nai và đánh giá khả năng đối kháng của chúng với các nấm gây bệnh trong đất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA SPP. TỪ ĐẤT HỒ TIÊU Ở ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CHÚNG VỚI CÁC NẤM GÂY BỆNH TRONG ĐẤT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Nguyễn Hoàng Vũ MSSV: 1151110426 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015 1
LỜI CAM ĐOAN - - - - - - - - -- - - - - - - - - Tôi tên: Nguyễn Hoàng Vũ Sinh ngày 29 tháng 07 năm 1993 Sinh viên lớp 11DSH04 - Công Nghệ Sinh Học - Trường ĐH Kỹ Công Nghệ TP Hồ Chí Minh Tôi xin cam đoan : Đề tài "Phân lập và tuyển chọn chủng nấm Trichoderma sp trên đất hồ tiêu ở Đồng Nai" do Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai hướng dẫn là đề tài của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây. Những thông tin tham khảo trong khóa luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng. Tất cả những nội dung trong đồ án đúng như nội dung đề tài và yêu cầu của giáo viên hướng dẫn. Nếu có sai sót tôi xin chịu trách nhiệm trước hội đồng. Sinh viên thực hiện Nguyễn Hoàng Vũ 2
LỜI CẢM ƠN - - - - - - - - -- - - - - - - - - Để hoàn thành đề tài này ngoại sự nổ lực, cố gắng của bản thân, em còn nhận được sự hỗ trợ rất nhiều từ nhiều người, tôi chân thành gửi lời "CẢM ƠN" tới : Con xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả những người thân trong gia đình đã nuôi con khôn lớn nên người và tận tâm lo lắng, tạo mọi điều kiện cho con được học tập cho đến ngày hôm nay. Ngôi trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó suốt bốn năm học qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh nghiệm trong cuộc sống. Ban chủ nhiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP HCM đã trang bị cho tôi những kiến thức cơ bản, làm nền móng để tôi thực hiện đề tài và làm tốt công việc sau này. Cô T.S Nguyễn Thị Hai đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện tốt đề tài này. Các bạn trong lớp đã cỗ vũ, khích lệ tinh thần cho em trong suốt thời gian thực hiện đồ án. 3
MỤC LỤC MỤC LỤC ......................................................................................................................... i DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ v DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ vi MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3 1. 1 Giới thiệu chung về nấm Trichoderma............................................................. 3 1. 1.1. Vị trí phân loại Trichoderma ......................................................................... 3 1. 1.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc Trichoderma .............................................. 4 1. 1.3. Đặc điểm một số chủng Trichoderma ở Việt Nam ...................................... 5 1. 1.4. Vai trò tiêu diệt các loài nấm gây bệnh trên thực vật ................................ 8 1.1.4.1 Nguyên tắc chung ..................................................................................... 8 1.1.4.2 Cơ chế đối kháng ...................................................................................... 9 1. 2 Hiệu quả phòng trừ nấm gây hại của nấm Trichoderma ............................. 18 1. 3 Giới thiệu về cây hồ tiêu .................................................................................. 19 1.3.1 Nguồn gốc cây tiêu.......................................................................................... 19 1.3.2 Công dụng của cây tiêu .................................................................................. 19 1.3.3 Đặc điểm hình thái của cây tiêu (Phạm Văn Biên và cộng sự, 1990. ........ 20 1. 4 Bệnh hại trên cây hồ tiêu và biện pháp phòng trừ ....................................... 22 1.4.1 Bệnh hại chính trên hồ tiêu .......................................................................... 22 1.4.1.1 Bệnh chết nhanh ..................................................................................... 23 i
1.4.1.2 Bệnh chết chậm....................................................................................... 24 1.4.1.3 Bệnh virus hại hồ tiêu ............................................................................ 25 1.4.2 Biện pháp phòng trừ ..................................................................................... 25 1.4.2.1 Biện pháp canh tác ................................................................................. 25 1.4.2.2 Biện pháp hóa học .................................................................................. 26 1.4.2.3 Biện Pháp sinh học ................................................................................. 26 1.4.2.4 Biện pháp quản lý cây trồng tổng hợp (ICM) ..................................... 26 1. 5 Một số nấm bệnh hại trong đất.................................................................... 27 1.5.1 Phytophthora .................................................................................................. 27 1.5.1.1 Vị trí và phân loại ................................................................................... 27 1.5.1.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc ............................................................. 28 1.5.1.3 Nấm Phytophthora gây bệnh cây trồng ................................................ 30 1.5.2 Fusarium sp .................................................................................................... 32 1.5.2.1 Vị trí phân loại ........................................................................................ 32 1.5.2.2 Đặc điểm hình thái , cấu trúc của Fusarium ....................................... 33 1.5.2.3 Nấm Fusarium gây bệnh cho cây trồng ở việt nam ............................ 34 1.5.3 Rhizoctonia solani .......................................................................................... 35 1.5.3.1 Vị trí và phân loại ................................................................................... 35 1.5.3.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc ............................................................. 36 1.5.3.3 Nấm Rhizoctonia gây hại cho cây trồng ............................................... 36 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 39 ii
2.1 Thời gian và địa điểm ................................................................................... 39 2.2 Thiết bị dụng cụ vật liệu ............................................................................... 39 2.3 Vật liệu............................................................................................................ 40 2.3.1 Vi sinh vật nghiên cứu .................................................................................. 40 2.3.2 Môi trường ..................................................................................................... 41 2.4 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 42 2.4.1 Phân lập nấm Trichoderma trên đất hồ tiêu .............................................. 43 2.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2000). ............ 43 2.4.1.2 Phương pháp pha loãng mẫu .................................................................. 43 2.4.2 Phương pháp quan sát hình thái nấm......................................................... 43 2.4.2.1 Quan sát đại thể nấm ............................................................................. 43 2.4.2.2 Quan sát vi thể nấm ............................................................................... 44 2.4.3 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase). (Tô Duy Khương, 2007) ............................................................. 45 2.4.4 Đánh giá tính đối kháng của chủng nấm Trichoderma với chủng nấm bệnh (Fokkema, 1976)................................................................................... 46 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu thống kê. ........................................................... 47 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 48 3.1 Kết quả phân lập nấm Trichoderma từ đất hồ tiêu. ...................................... 48 3.2 Đặc điểm của các chủng nấm Trichoderma phân lập được trên đất hồ tiêu ......................................................................................................................... 48 3.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase và chitinase) của 8 iii
chủng nấm Trichoderma phân lập được trên đất hồ tiêu bị bệnh. ............. 53 3.4 Đánh giá khả năng đối kháng với các chủng nấm bệnh trong đất và đất hồ tiêu của các chủng Trichoderma phân lập được. ................................................. 56 3.4.1 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp1. ........................................ 57 3.4.2 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp2 ........................................ 61 3.4.3 Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia solani....................................... 65 3.4.4 Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp. ............................................... 69 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 74 4.1 Kết luận .............................................................................................................. 74 4.2 Kiến Nghị: .......................................................................................................... 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................. 75 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1 iv
DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đường kính vòng phân giải Chitin của 8 chủng nấm Trichoderma sau hai ngày nuôi cấy. (đơn vị: cm) .................................................................................... 53 Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải Cellulose chủa 8 chủng nấm Trichoderma sau hai ngày nuôi cấy. (đơn vị: cm) ............................................................................. 55 Bảng 3.3 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp1 của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. ............................................................ 57 Bảng 3.4 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp2 của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. ............................................................ 61 Bảng 3.5 Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia solani của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. ............................................................ 65 Bảng 3.6 Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 69 v
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cuống bào tử trần ở nấm T.hazrianum (trái) và T.aggresivum (phải). .. 5 Hình 1.2: Trichoderma atroviride. ................................................................................. 5 Hình 1.3: Trichoderma hazianum. ................................................................................. 6 Hình 1.4: Trichoderma koningii. .................................................................................... 7 Hình 1.5: Trichoderma hamatum................................................................................... 7 Hình 1.6: Trichoderma viride . ....................................................................................... 8 Hình 1.7: Nấm Trichoderma atroviride đối kháng với nấm gỗ Polyporus ............. 11 Hình 1.8: Trichoderma tiết enzyme chitinase phá hủy vách tế bào .......................... 12 Hình 1.9: Nấm Trichoderma sinh trưởng trong nấm bệnh. ...................................... 13 Hình 1.10: Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma hazianum ....................................................................... 15 Hình 1.11: Nấm Trichoderma cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống với các nấm bệnh khác. .............................................................................................................. 17 Hình 1.12: Cây hồ tiêu với trái chưa chín (https://vi.wikipedia.org/wiki/Hồ_tiêu) 19 Hình 1.13: Hình ảnh chu kỳ sống của Phytophthora ................................................. 29 Hình 1.14: Bệnh Héo Fusarium trên cây chuối do Fusarium oxysporum f.cubensesp...................................................................................................................... 34 Hình 1.15: Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra ...................................................... 38 Hình 3.1: Hình thái mặt trước và mặt sau theo thứ tự của nấm TT1, TT2, TT5, TT6, TT7, TT8 sau 3 và 5 ngày. ................................................................................... 49 vi
Hình 3.2: Hình ảnh sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT1, TT2, TT5, TT6, TT7, T2. ....................................................................................................... 51 Hình 3.3: Hình thái mặt trước và mặt sau theo thứ tự của nấm TT3, TT4 sau 3 và 5 ngày. ............................................................................................................................. 52 Hình 3.4: Sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT3 ........................... 52 Hình 3.5: Sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT4 ........................... 53 Hình 3.6: Hình ảnh vòng phân giải Chitin của các chủng nấm Trichoderma sp phân lập được.. .............................................................................................................. 55 Hình 3.7: Hình ảnh vòng phân giải CMC của các chủng nấm Trichoderma sp phân lập được .......................................................................................................................... 56 Hình 3.8: Hình ảnh đối kháng với Phytophthora sp của 8 chủng nấm Trichoderma spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. ............ 61 Hình 3.9: Hình ảnh đối kháng với Phytophthora sp2 của 8 chủng nấm Trichoderma spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. ............ 65 Hình 3.10: Hình ảnh đối kháng với Rhizoctonia solani của 8 chủng nấm Trichoderma spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. .............................................................................................................................. 69 Hình 3.11: Hình ảnh đối kháng với Rhizoctonia sp của 8 chủng nấm Trichoderma sp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. .............. 73 vii
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Việt Nam hiện nay là một trong những nước đứng đầu về xuất khẩu hồ tiêu trên thế giới . Các vùng trồng hồ tiêu chủ yếu ở nước ta tập trung từ Quảng Trị đến các vùng đất đỏ cao nguyên Trung bộ, Đông Nam bộ và Đảo Phú Quốc. Từ năm 1995 trở lại đây, cây hồ tiêu được phát triển với qui mô và tốc độ khá lớn, điển hình là các tỉnh Đắc Lắc, Đắc Nông, Gia Lai, Bình Dương, Bình Phước, Quảng Trị, Phú Quốc và Đồng Nai. Chỉ tính riêng hai tỉnh Đắc Lắc và Đắc Nông thì từ năm 1995 cho đến nay, diện tích hồ tiêu mới phát triển lên tới gần 10000 ha. Định hướng của ngành sản xuất hồ tiêu đến năm 2010 - 2020 giữ diện tích khoảng 50 000 ha, giá trị xuất khẩu đạt trên 240 triệu USD/ năm. Tuy nhiên nhiều năm trở lại đây, dịch hại trên hồ tiêu phát sinh sinh và gây hại đáng kể cho nhiều vùng sản xuất hồ tiêu tập trung (Báo nông nghiệp Việt Nam số ra ngày 9/2 và 10/4/2007). Thống kê của Cục BVTV cho thấy, tính tới cuối năm 2014, tổng diện tích hồ tiêu nhiễm bệnh chết nhanh đã lên tới trên 2.000 ha, chiếm 2,5% tổng diện tích gieo trồng; diện tích nhiễm bệnh chết chậm gần 3.300 ha, chiếm 4% tổng diện tích gieo trồng. Bệnh chết nhanh đã xảy ra ở hầu hết các tỉnh trồng hồ tiêu, trong khi bệnh chết chậm chủ yếu ở các tỉnh Tây Nguyên và Đông Nam bộ (Cục Bảo vệ Thực vật, 2007). Một trong những vi sinh vật quan trọng sống trong đất gây hại cho cây tiêu đó là nấm Phytophthora sp. Nấm gây hiện tượng chết nhanh và phân bố rộng rãi trên thế giới, đặc biệt là vùng Đông Nam Á, Châu Á, Úc. Ngoài ra còn có các loài nấm khác gây chết cây như Fusarium sp , Rhizoctonia solani (Barbara, 2001). Theo Kularatne (2002), các bệnh quan trọng nhất trên cây tiêu gồm bệnh chết nhanh do Phytophthora sp, bệnh chết chậm do Fusarium sp. Đối với bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora sp. là tác nhân gây bệnh chính (Kularatne, 2002). 1
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Để kiểm soát được dịch bệnh này thì phương pháp hóa học không còn là một biện pháp được tin dùng. Thay vào đó việc nghiên cứu để tìm ra những tác nhân sinh học mang lại hiệu quả cao và thân thiện với môi trường đang là giải pháp được hướng đến. Một trong số các tác nhân được đánh giá là có nhiều hứa hẹn đó là nấm Trichoderma. Nhiều kết quả nghiên cứu về Trichoderma đã được thực hiện và đã đc thương mại hóa. Tuy nhiên, hiệu quả của chế phẩm Trichoderma vẫn còn khá bấp bênh. Các tác giả trong và ngoài nước đều thống nhất rằng, sự phân bố và điều kiện môi trường sống của nấm Trichoderma có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh enzyme, tiết kháng sinh và đối kháng nấm bệnh của chúng. Các chủng nấm có nguồn gốc bản địa sẽ cho hiệu quả phòng trừ tốt hơn so với các chủng nhập cư. Xuất phát từ nhận định này, sinh vien tiến hành đề tài PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA SPP TỪ ĐẤT HỒ TIÊU Ở ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CHÚNG VỚI CÁC NẤM GÂY BỆNH TRONG ĐẤT, nhằm tìm ra các chủng có triển vọng để phòng trừ các loài bệnh hại có trong đất ở vùng nghiên cứu. Mục đích đề tài ➢ Tìm ra được chủng nấm Trichoderma trong đất hồ tiêu ở Đồng Nai có khả năng đối kháng với tác nhân gây bệnh trong đất. ➢ Bổ sung thêm các chủng nấm Trichoderma có nguồn gốc ở vùng sinh thái mới vào bộ sưu tập của phòng thí nghiệm trường Hutech. Nội dung nghiên cứu ➢ Phân lập các chủng nấm Trichoderma từ đất cây hồ tiêu ở Đồng Nai. ➢ Đánh giá các đặc điểm sinh học của các chủng nấm Trichoderma phân lập được. ➢ Đánh giá khả năng đối kháng với các bệnh trong đất hồ tiêu của các chủng Trichoderma phân lập được. 2
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. 1 Giới thiệu chung về nấm Trichoderma Trichoderma là loại nấm có mặt nhiều trong đất, các rễ cây, chúng có khả năng phân hủy gỗ, các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật (Howell và cộng sự, 2003). Các chủng Trichoderma là thành phần chính trong hệ VSV của đất, đó có thể là do khả năng trao đổi chất phong phú và cạnh tranh tích cực của chúng. Trichoderma được cho là ít liên quan đến dịch bệnh ở thực vật sống, mặc dù một nhóm của Trichoderma harzianum gây bệnh trên nấm thương mại. Năm 1996 thì Samuels đã đưa ra đánh giá toàn diện về đặc tính sinh học của Trichoderma, kỹ thuật thu nhận được enzyme tiết ra từ Trichoderma và khả năng kiểm soát sinh học của chúng (Tran Nguyen Ha, 2010). Nấm Trichoderma sp. thuộc ngành nấm Mycota, lớp nấm bất toàn (imperfect fungi) Deuteromycetes, bộ nấm bông Moniliales, học Moniliaceae, chi Trichoderma (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Nấm Trichoderma phát triển nhanh và sinh nhiều bảo tử màu xanh lá cây (Huỳnh Văn Phục, 2006). 1. 1.1. Vị trí phân loại Trichoderma Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho công tác phân loại do còn nhiều đặc điểm chưa được biết đầy đủ. Persoon ex Gay ( 1801 ) phân loại Trichoderma như sau. Giới Fungi Ngành Ascomycota Lớp Euascomycetes Bộ Hypocreales Họ Hypocreaceae 3
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Chi Trichoderma Ainsworth và Sussman (1968) lại cho rằng Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae. Theo nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da silva (1997), Trichoderma thuộc họ Hypocreaceae, lớp nấm túi Ascomycetes, các loài Trichoderma được chia thành 5 nhóm: Trichoderma, longibrachiatum, Saturisporum, pachybasium và Hypocreanum . Theo GS Nguyễn Lân Dũng và một số tác giả khác, chi Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales họ Moniliaceae 1. 1.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc Trichoderma Hầu hết chi Trichoderma không có giai đoạn sinh sản hữu tính. Chúng sinh sản bằng bào tử đính từ khuẩn ti khí sinh. Khuẩn ti khí sinh không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, phát triển nhanh trong MT nuôi cấy ở 25-30oC, thường không phát triển ở 35oC. Khuẩn lạc không màu trong MT thạch đường bột bắp hay trên MT giàu chất dinh dưỡng như PDA. BT hình thành trong vòng 1 tuần thành khối lỏng lẻo hoặc rắn chắc có màu xanh, màu vàng và ít khi có màu trắng. Chất tạo màu vàng thường chìm trong khối agar, đặc biệt trong môi trường PDA. Cuống sinh BT phân nhánh cao (khó để xác định hoặc đo đếm) kết thành bụi chặt hay lỏng, thường tạo nên những vòng đồng tâm đặc trưng hoặc hướng theo khuẩn ty khí sinh. Những nhánh chính của cuống sinh BT tạo ra các nhánh bên có thể kết cặp hoặc không, nhánh dài nhất xa phần đỉnh, thể bình phát sinh trực tiếp từ thân chính gần đỉnh. Các nhánh có thể tái phân nhánh, với những nhánh thứ cấp thường kết cặp. 4
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.1 Cuống bào tử trần ở nấm T.hazrianum (trái) và T.aggresivum (phải) (http://explow.com/Trichoderma). 1. 1.3. Đặc điểm một số chủng Trichoderma ở Việt Nam • Trichoderma atroviride Đặc điểm: Khuẩn lạc phát triển nhanh, đạt 8-9cm sau 14 ngày nuôi cấy ở 20 0C, sợi nấm trong suốt, vách dày, trơn láng rộng 2- 14µm. Bào tử màu xanh, có hình cầu méo hoặc bầu dục đường kính từ 4-12µm, khi nấm già thường mất màu hay màu vàng nhạt hoặc xám, bào tử già phát ra mùi hương dừa (Kubicek và Harman,1998) . Hình 1.2 Trichoderma atroviride (http://explow.com/Trichoderma). 5
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP • Trichoderma hazianum Đặc điểm: Môi trường có nhiệt độ từ 15-350C, pH: 3,7-4,7 rất thích hợp cho sự phát triển của nấm (Dosmch và Gams, 1980). Khuẩn lạc phát triển nhanh, đường kính khoảng 9cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 200C. Bào tử đính có hình cầu méo đến bầu dục ngắn, màu xanh lục, vách trơn láng, kích thước (2,7- 3,2)x(2,5-2,8)µm. Hình 1.3 Trichoderma hazianum (http://expow.com/Trichoderma). • Trichoderma koningii Đặc điểm: Khuẩn lạc có đường kính 3-5cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 200C, bào tử có hình trụ ngắn, vách trơn láng, kích thước (3,0-4,8)x(1,9-2,8)µm. Sinh hóa: Hiện diện nhiều ở lớp đất mặt, nhưng ở độ sâu 120cm vẫn có sự hiện diện của loài nấm này. Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ từ 260C trở lên tùy theo nguồn gốc của loài, pH: 3,7-6,0 (Huỳnh Văn Phục, 2006). 6
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.4 Trichoderma koningii (http://explow.com/Trichoderma). • Trichoderma hamatum Đặc điểm: Đường kính khuẩn lạc đạt 7cm khi nuôi cấy 5 ngày ở 200C. Bào tử màu xanh lục, trơn, dạng elip, có kích thước khác nhau tùy theo chủng (Domsch và Gams,1980). Sinh hóa: Nhiệt độ 240C và pH: 3,7-4,7 là những điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển của Trichoderma hamatum và chúng phát triển chậm lại ở 00C (Domsch và Gams,1980). Hình 1.5 Trichoderma hamatum (http://explow.com/Trichoderma). 7
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP • Trichoderma viride Đặc điểm: Bào tử màu xanh lục, vách xù xì, dạng hình cầu, kích thước (4-5)x(2,5-3)µm. (cook và baker, 1983). Sinh hóa: Có thể sử dụng cả hai nguồn nitrogen đơn giản và phức tạp. Khi Trichoderma tăng trưởng trên nguồn cacbonhydrate như là nguồn cacbon cho dinh dưỡng thì ammonium được sử dụng tốt hơn là nitrate (Danielson và Davey, 1973). Hình 1.6 Trichoderma viride (http://explow.com/Trichoderma). 1. 1.4. Vai trò tiêu diệt các loài nấm gây bệnh trên thực vật 1.1.4.1 Nguyên tắc chung Nghiên cứu về cơ chế đối kháng có ý nghĩa quan trọng bởi lẽ muốn sử dụng hiệu quả nhất những tác nhân kiểm soát bệnh thực vật, chúng ta phải hiểu những tác nhân đó làm việc như thế nào và giới hạn của chúng là gì. Trên cơ sở đó, tác động có hiệu quả tới các khâu nuôi dưỡng, bảo quản và cuối cùng sử dụng những tác nhân kiểm soát sinh học sao cho có thể khai thác tốt nhất khả năng kiểm soát bệnh của chúng. Nhiều nghiên cứu từ trước tới nay đã chỉ ra rằng, Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế khác nhau trong phòng trừ và tiêu diệt nấm bệnh như: hiện tượng kí sinh nấm, sự sản sinh kháng sinh, sự tiết những enzyme phá huỷ thành tế bào nấm bệnh, khả nămg cạnh tranh mạnh 8
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP chất dinh dưỡng và không gian sống. Những cơ chế này không tách biệt nhau, và để đối kháng với các chủng nấm bệnh thì chúng có thể kết hợp hai hay nhiều cơ chế trong suốt quá trình ký sinh và tiêu diệt. Ví dụ, sự kiểm soát botrytis trên nho bởi Trichoderma bao gồm cả sự cạnh tranh dinh dưỡng và sự ký sinh lên hạch nấm, cả hai cơ chế đã ngăn chặn tác nhân gây bệnh (Huỳnh Văn Hiếu, 2009). Cả cơ chế tạo ra chất kháng nấm và cơ chế ký sinh đều có thể liên quan đến sự cạnh tranh dinh dưỡng, và sự sản xuất ra các chất độc được biết có ảnh hưởng đến tình trạng dinh dưỡng của môi trường. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các chất kháng sinh và các enzyme thủy phân không chỉ được tạo ra đồng thời mà còn hỗ trợ nhau trong cơ chế đối kháng ký sinh (Huỳnh Văn Hiếu, 2009). Theo Kredics (2003), quá trình đối kháng của nấm Trichoderma với nấm bệnh chủ yếu bằng 2 cơ chế: Thứ nhất: Nấm Trichoderma bao quanh và cuộn lấy nấm bệnh. Thứ hai: Nấm Trichoderma tiết ra các loại enzyme thủy phân. Klein và Eveleigh (1998), thì cho rằng nấm Trichoderma tấn công trực tiếp bằng cách cuộn quanh và tiết ra enzyme phân hủy chitin của nấm gây hại thành những phân tử nhỏ dễ hấp thu, đồng thời giúp cây trồng kháng lại bệnh (Huỳnh Văn Phục, 2006). 1.1.4.2 Cơ chế đối kháng Nấm Trichoderma phát triển nhanh trong đất, nên chúng tăng nhanh về số lượng so với các loài nấm khác (Saksena,1960). Chúng sẽ chiếm chỗ trước khi các loại nấm gây bệnh xâm nhiễm vào mô cây trồng. Cơ chế ký sinh, đối kháng của các loài nấm đối kháng thể hiện. Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” ở vùng tiếp xúc giữa nấm đối kháng với nấm gây bệnh xuất hiện sự quấn chặt của sợi nấm đối kháng quanh sợi nấm gây bệnh, sau đó xả ra hiện tượng thủy phân thành vách sợi nấm bệnh, nhờ đó mà nấm đối kháng xâm nhập 9
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP vào bên trong sợi nấm, phá vỡ tế bào sợi nấm và tiêu diệt nấm gây bệnh. Cơ chế tác động của các loài nấm đối kháng dựa trên cơ sở các loài nấm đối kháng có khả năng sản sinh ra một số chất kháng sinh (thực chất là chất độc tố do nấm đối kháng sản sinh ra nhưng không làm tổn hại đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng và không ảnh hưởng đến hệ VSV đối kháng ở trong đất và ở vùng rễ cây trồng): Gliotoxin, Trichoderma viridin, Dermadin, Cyclosporin, Alamethicin, vv… Chất kháng sinh do nấm đối kháng sản sinh ra có khả năng kìm hãm, ức chế quá trình sinh trưởng của sợi nấm, đến quá trình xâm nhiễm ký sinh của nấm gây bệnh và có thể tiêu diệt nấm gây bệnh (Huỳnh Văn Phục, 2006). • Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế. Weidling (1932) đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh và đặt tên cho hiện tượng đó là “giao thoa sợ nấm”. Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” là hiện tượng tấn công trực tiếp của nấm này lên một nấm khác. Nó là một quá trình rất phức tạp bao gồm các bước chính sau: đầu tiên là sự nhận biết sự có mặt của nấm bệnh, sau đó là quá trình tấn công, xuyên qua thành tế bào và cuối cùng giết chết nấm bệnh. Một số chi tiết của cơ chế này ở Trichoderma đã được nghiên cứu và làm sáng tỏ (Vũ Nguyên Thành, 2009). Để giải thích rõ hiện tượng “giao thoa sợi nấm” chúng ta có thể chia quá trình tấn công của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh làm 3 giai đoạn. Giai đoạn 1: Bước đầu tấn công nấm bệnh Quan sát giai đoạn đầu tấn công chủng nấm bệnh. Trong giai đoạn đầu này có thể chia làm 4 bước: Bước 1: Nấm Trichoderma phát hiện nấm bệnh . 10