Đột biến gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson thể gan

2015<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> ðỘT BIẾN GEN ATP7B Ở BỆNH NHÂN WILSON THỂ GAN<br /> ðỗ Thanh Hương, Trần Huy Thịnh, Ninh Quốc ðạt, Trần Vân Khánh<br /> Trường ðại học Y Hà Nội<br /> Nghiên cứu ñược tiến hành nhằm phát hiện các dạng ñột biến gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson thể gan.<br /> 16 bệnh nhân chẩn ñoán xác ñịnh b ệnh Wilson thể gan dựa theo tiêu chuẩn của Ferenci ñược lựa chọn vào<br /> nghiên cứu. Kỹ thuật giải trình tự gen ñược sử dụng ñể xác ñịnh ñột biến trên gen ATP7B. Kết quả cho thấy<br /> ñã phát hiện ñược18 dạng ñột b iến gen ATP7B trên nhóm bệnh nhân Wilson thể gan, trong ñó phát hiện<br /> ñược 4 dạng ñột b iến mới chưa ñược công b ố (p.T850I, c. ins 47/48 CGGCG, p.F1240I và p.G50S); 11 ñột<br /> biến ñã ñược công b ố gây b ệnh (p.S105Stop, c.-75C > A, c.-118/117 ins GCCGC, p.W939C, p.C980S,<br /> p.C980Stop, p.G943D, p.N1270I, p.T715A, p.R778L, c.4060 + 6 C > T) và 3 ñột b iến dạng ña hình thái hay<br /> thể biến dị (p.V456L, p.K832R, p.F1144I).<br /> Từ khóa: Bệnh Wilson thể gan, gen ATP7B, ñột biế n gen<br /> <br /> I. ðẶT VẤN ðỀ<br /> <br /> gan như ng thường ñược chẩn ñoán muộn với<br /> <br /> Bệnh Wilson ñược biết ñến là bệnh thoái<br /> <br /> biểu hiện triệu chứng nặng. Nếu bệnh ñược<br /> <br /> hóa gan - nhân ñậu, ñược tác giả Kinnear<br /> <br /> chẩn ñoán và ñiều trị sớm ñặc biệt là ở những<br /> <br /> Wilson mô t ả lần ñầu tiên vào năm 1912 [ 1].<br /> <br /> bệnh nhân Wilson thể gan, có thể ngăn chặn<br /> <br /> Cho ñến nay, bệnh ñược phát hiện ở hầu hết<br /> các quốc gia và các chủng tộc trên Thế giới<br /> <br /> ñược các biến chứng và hạn chế sự phát triển<br /> của bệnh.<br /> <br /> với tỷ lệ mắc là 1/105 ñến 1/35.000 trẻ sinh ra.<br /> <br /> Ở Việt Nam, lần ñầu tiên có hai t rường<br /> <br /> ðây là bệnh di truyền, ñột biến gen lặn trên<br /> <br /> hợp bệnh nhân bị bệnh Wilson ñược phát hiện<br /> <br /> nhiễm sắc thể thường 13q14.3, mã hóa gen<br /> <br /> mang ñột biến gen Arg778Leu vào năm 2010<br /> <br /> ATP7B gây t hiếu hụt enzym A TP ase typ P<br /> <br /> [3]. Các nghiên cứu sau ñó tiếp tục xác ñịnh<br /> <br /> (P - A TP ase) [2]. Gen A TP7B gồm 21 ex on<br /> <br /> ñột biến ở một số vùng t rọng ñiểm và hoàn<br /> <br /> chiều dài khoảng 80kb, mã hóa c ho phân tử<br /> <br /> thiện quy trình xác ñịnh ñột biến gen A TP7B<br /> <br /> protein 1465 acid amin. Gen này có vai trò<br /> <br /> [4; 5]. Như vậy, số lượng nghiên cứu ñột biến<br /> <br /> ñiều hòa quá trình hấp thu, phân bố và thải<br /> <br /> gen A TP7B ở Việt Nam còn hạn chế và chưa<br /> <br /> trừ ñồng t rong cơ thể. Do ñó, khi ñột biến<br /> <br /> ñầy ñủ về ñột biến gen A TP 7B, cũng chưa có<br /> <br /> gen xảy ra s ẽ gây rối loạn quá t rình chuyển<br /> <br /> phân tích gen giúp chẩn ñoán sớm các bệnh<br /> <br /> hóa ñồng, ñặc biệt là giảm bài tiết ñồng qua<br /> <br /> nhân tổn thương gan. Do vậy, ñề tài ñược tiến<br /> <br /> ñường mật. Lượng ñồng ứ lại t rong cơ thể sẽ<br /> <br /> hành nhằm phát hiện các dạng ñột biến gen<br /> <br /> lắng ñọng dần trong các t ổ chức: gan, não<br /> <br /> ATP7B ở bệnh nhân Wilson thể gan.<br /> <br /> (chủ yếu ở nhân xám trung ương), mắt, da,<br /> thận, xươ ng,... và gây ra c ác triệu c hứng ña<br /> <br /> II. ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> dạng trên lâm sàng. B ệnh biểu hiện sớm ở<br /> <br /> 1. ðối tượng<br /> 16 bệnh nhân ñược chẩn ñoán xác ñịnh<br /> <br /> ðịa chỉ liên hệ: ðỗ Thanh Hương, Bộ môn Nhi, Trường<br /> ðại học Y Hà Nội<br /> Email: drdothanhhuong@yahoo.com<br /> Ngày nhận: 27/5/2015<br /> Ngày ñược chấp thuận: 20/7/2015<br /> <br /> TCNCYH 95 (3) - 2015<br /> <br /> bệnh Wilson theo thang ñiểm Ferenci ñều có<br /> tổng số ñiểm WD ≥ 4, với biểu hiện tăng<br /> enzym gan (AS T và ALT ≥ 60 UI/l), tăng lượng<br /> ñồng trong nước tiểu 24 giờ (≥ 100 µg/ngày),<br /> 1<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> ceruloplasmin huy ết thanh giảm (< 20mg/dl)),<br /> <br /> 3. Xử lý số liệu<br /> <br /> có vòng Kayser - Fleischer [6] và phân loại thể<br /> <br /> Số liệu ñược thu thập theo một mẫu bệnh<br /> <br /> lâm sàng theo tiêu chuẩn của Hội Gan Mật<br /> <br /> án nghiên cứu thống nhất. Nghiên cứu ñược<br /> <br /> quốc tế năm 2003 [ 7]. Các bệnh nhân thể gan<br /> ñược chọn làm ñối tượng nghiên cứ u ñều có<br /> tăng enzym gan, một số bệnh nhân có biểu<br /> hiện suy gan và không có triệu chứng thần<br /> kinh. Các bệnh nhân này ñược ñiều trị tại bệnh<br /> viện Bạch Mai và bệnh viện Nhi Trung ương.<br /> <br /> thực hiện t ại Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein, Trường ðại học Y Hà Nội.<br /> 4. ðạo ñức nghiên cứu<br /> Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia<br /> vào nghiên cứu và c ó quyền rút khỏi nghiên<br /> cứu khi không ñồng ý tiếp tục tham gia vào<br /> <br /> 2. Phương pháp<br /> Lấy mẫu bệnh phẩm: 2ml máu tĩnh mạch<br /> chống ñông bằng EDTA.<br /> Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi:<br /> DNA t ổng số ñược tách c hiết từ máu toàn<br /> phần bằng phenol - chloroform - isopropanol<br /> (25:24:1).<br /> <br /> nghiên cứu. Bệnh nhân sẽ ñược thông báo về<br /> kết quả xét nghiệm gen ñể giúp c ho các bác<br /> sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác ñồ<br /> ñiều trị phù hợ p. Các thông tin cá nhân ñược<br /> ñảm bảo bí mật.<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> <br /> Kỹ thuật giải t rình tự gen: Toàn bộ 21 exon<br /> của gen A TP7B ñược khuếch ñại với các cặp<br /> <br /> Kết quả xác ñịnh ñột biến gen ATP7B<br /> <br /> mồi ñặc hiệu [ 2]. Các sản phẩm PCR sẽ ñược<br /> <br /> Nghiên cứu ñã phát hiện ñược 18 dạng ñột<br /> <br /> tiến hành giải trình tự trực tiếp trên máy ABI<br /> <br /> biến trên các exon: 1, 2, 3, 8, 10, 13, 14, 16, 18<br /> <br /> 3100 Genetic Analyzer. Kết quả ñược thu thập<br /> <br /> và 5’UTR. Các ñột biến hay gặp là: p.V456L<br /> <br /> và xử lý bằng phần mềm AB I PRISMTM 3100 –<br /> <br /> trên exon 3 (9/18 ñột biến); ñột biến -ins 47/ 48<br /> <br /> A vant<br /> <br /> CGGCG t rên exon 1 (7/18 ñột biến); ñột biến<br /> <br /> Data<br /> <br /> Collection,<br /> <br /> DNA<br /> <br /> S equencing<br /> <br /> Analysis 5.2 và BLAS T NCBI.<br /> <br /> c. -75 C > A vùng 5’ UTR (6/18 ñột biến)<br /> <br /> Các gen ñột biến ñược so sánh t rên ngân<br /> <br /> (bảng 1). Trong ñó có 4 dạng ñột biến mới<br /> <br /> hàng gen: DNA (NG - 008806) và mRNA (NM-<br /> <br /> chưa ñược công bố, ñó là: p. T850I; c. ins<br /> <br /> 000053).<br /> <br /> 47/48 CGGCG (hình 1); p.F1240I và p.G50S.<br /> <br /> Người bình thường<br /> <br /> 2<br /> <br /> Bệnh nhân mã số W11.00<br /> <br /> TCNCYH 95 (3) - 2015<br /> <br /> 2015<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> Người bình thường<br /> <br /> Bệnh nhân mã số W11.00<br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh giải trình tự gen ATP7B exon 1 và exon 3 của bệnh nhân W11.00<br /> Bảng 1. Kết quả xác ñịnh ñột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson<br /> <br /> TT<br /> <br /> Mã số<br /> <br /> 1<br /> <br /> W1.00<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> W5.00<br /> <br /> W11.00<br /> <br /> W17.00<br /> <br /> Exon<br /> <br /> ðột biến<br /> <br /> Thể ñột<br /> <br /> Chú<br /> <br /> Tài liệu<br /> <br /> 2<br /> <br /> p.S105 Stop<br /> <br /> ðồng hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Mak CM, (2008)<br /> <br /> 10<br /> <br /> p.K832R (c.2652A > G)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> Okada T, (2000)<br /> <br /> 1<br /> <br /> Ins 47/48 CGGCG<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> New<br /> <br /> 3<br /> <br /> p.V456L (c.1523 G > C)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> 10<br /> <br /> p.T850I (c.2706 C > T)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> New<br /> <br /> 1<br /> <br /> ins 47/48 CGGCG<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> New<br /> <br /> 3<br /> <br /> p.V456L (c.1523G >C)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> Gu YH, (2003)<br /> <br /> 5’UTR<br /> <br /> c.-75C > A<br /> <br /> ðồng hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Yamaguchi A,<br /> <br /> 5’UTR<br /> <br /> c.-118/117 ins GCCGC<br /> <br /> ðồng hơp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Gu YH, (2003)<br /> <br /> 3<br /> <br /> p.V456L (c. 1523 G > C)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> Gu YH, (2003)<br /> <br /> 10<br /> <br /> p.K832R (c.2652A > G)<br /> <br /> ðồng hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> Okada T, (2000)<br /> <br /> 1<br /> <br /> ins 47/48 CGGCG<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> New<br /> <br /> 3<br /> <br /> p.V456L (c. 1523 G > C)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> Gu YH, (2003)<br /> <br /> 10<br /> <br /> p.K832R (c.2652A > G)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> Okada T, (2000)<br /> <br /> 12<br /> <br /> p.W939C (c.2974G > C)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Folhoffer A,<br /> <br /> 13<br /> <br /> p.C980S (c.3106G > C;<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Mak CM, (2005)<br /> <br /> Gu YH, (2003)<br /> <br /> W19.00<br /> <br /> TCNCYH 95 (3) - 2015<br /> <br /> 3<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> TT<br /> <br /> Mã số<br /> <br /> 5<br /> <br /> W19.00<br /> <br /> 6<br /> <br /> W21.00<br /> <br /> 7<br /> <br /> W22.00<br /> <br /> 8<br /> <br /> W23.00<br /> <br /> 9<br /> <br /> W24.00<br /> <br /> 10<br /> <br /> W29.00<br /> <br /> 11<br /> <br /> W32.00<br /> <br /> 12<br /> <br /> 13<br /> <br /> 14<br /> <br /> 4<br /> <br /> W33.00<br /> <br /> W36.00<br /> <br /> W40.00<br /> <br /> Exon<br /> <br /> ðột biến<br /> <br /> Thể ñột<br /> <br /> Chú<br /> <br /> Tài liệu<br /> <br /> 13<br /> <br /> p.C980 Stop(c.3107C > A)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Mak CM, (2008)<br /> <br /> 16<br /> <br /> p.F1144I (c.3587T > A)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> Todorov T,<br /> <br /> 1<br /> <br /> ins 47/48 CGGCG<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> New<br /> <br /> 3<br /> <br /> p.V456L (c. 1523 G > C)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> 1<br /> <br /> ins 47/48 CGGCG<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> New<br /> <br /> 3<br /> <br /> p.V456L (c.1523G > C)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> Gu YH, (2003)<br /> <br /> 14<br /> <br /> p.G943D<br /> <br /> ðồng hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Wan L, (2006)<br /> <br /> 5’UTR<br /> <br /> c.-75C > A<br /> <br /> ðồng hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> 1<br /> <br /> ins 47/48 CGGCG<br /> <br /> ðồng hợp<br /> <br /> New<br /> <br /> 3<br /> <br /> p.V456L (c. 1523 G > C)<br /> <br /> ðồng hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> 18<br /> <br /> p.F1240I (c.3975C > A)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> New<br /> <br /> 18<br /> <br /> p.N1270I (c.3966A > T)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Yamaguchi A,<br /> <br /> 8<br /> <br /> p.T715A (c.2147T > G)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Gupta A, (2005)<br /> <br /> 8<br /> <br /> p.R778L (c. 2490 G > T)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Nanji MS,<br /> <br /> 1<br /> <br /> ins 47/48 CGGCG<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> New<br /> <br /> 10<br /> <br /> p.T850 I (c.2706 C > T)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> New<br /> <br /> 5’UTR<br /> <br /> c.-75C > A<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Yamaguchi A,<br /> <br /> 3<br /> <br /> p.V456L (c. 1523 G > C)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> Gu YH, (2003)<br /> <br /> 10<br /> <br /> p.K832R (c.2652A > G)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> Okada T, (2000)<br /> <br /> 5’UTR<br /> <br /> c.-75C > A<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Yamaguchi A,<br /> <br /> 2<br /> <br /> p.G50S (c.305G > A)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> New<br /> <br /> 18<br /> <br /> c.4060 + 6 C > T<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Liu XQ, (2004)<br /> <br /> 5’UTR<br /> <br /> c.-75C > A<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Yamaguchi A,<br /> <br /> 5’UTR<br /> <br /> c.-118/117 ins GCCGC<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Gu YH, (2003)<br /> <br /> 3<br /> <br /> p.V456L (c. 1523 G > C)<br /> <br /> Dị hợp<br /> <br /> SNP<br /> <br /> Gu YH, (2003)<br /> <br /> Gu YH, (2003)<br /> <br /> Yamaguchi A,<br /> (1998)<br /> <br /> Gu YH, (2003)<br /> <br /> TCNCYH 95 (3) - 2015<br /> <br /> 2015<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> TT<br /> <br /> Mã số<br /> <br /> 15<br /> <br /> W44.00<br /> <br /> 16<br /> <br /> W45.00<br /> <br /> Exon<br /> <br /> ðột biến<br /> <br /> Thể ñột<br /> <br /> Chú<br /> <br /> Tài liệu<br /> <br /> 5’UTR<br /> <br /> c.-75C > A<br /> <br /> ðồng hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Yamaguchi A,<br /> <br /> 5’UTR<br /> <br /> c.-118/117 ins GCCGC<br /> <br /> ðồng hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Gu YH, (2003)<br /> <br /> 5’UTR<br /> <br /> c.-75C > A<br /> <br /> ðồng hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Yamaguchi A,<br /> <br /> 5’UTR<br /> <br /> c.-118/117 ins GCCGC<br /> <br /> ðồng hợp<br /> <br /> DV<br /> <br /> Gu YH, (2003)<br /> <br /> * New: ðột biến mới; DV: Disease Variant (ñột biến gây bệnh); SNP: Single Nucleotide Polymorphism (tính ña hình ñơn nucleotid)<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> <br /> (c.2706 C > T); c. ins 47/48 CGGCG; p.F1240I<br /> <br /> Thống kê từ các nghiên cứu trên Thế giới<br /> cho thấy có hơn 300 dạng ñột biến gen gây<br /> <br /> (c.3975C > A) và p.G50S (c.305G > A).<br /> <br /> bệnh Wilson, bao gồm các ñột biến vô nghĩa,<br /> <br /> 19.00; W21.00; W22.00; W24. 00; W32.00)<br /> <br /> sai nghĩa, thêm hoặc bớt nucleotide gây lệch<br /> <br /> mang ñột biến c. ins 47/48 CGGCG trên ex on<br /> <br /> khung dịch mã protein [6]. Tần suất mắc các<br /> <br /> 1. ðột biến thêm 5 nucleotide CGGCG trong<br /> <br /> dạng ñột biến khác nhau giữa các quốc gia và<br /> <br /> vùng mã hóa acid amin gây lệch toàn bộ<br /> <br /> chủng tộc trên Thế giới [8 - 14]. Trong ñó,<br /> <br /> khung dịch mã, làm mất khả năng tổng hợp<br /> <br /> dạng ñột biến phổ biến nhất ở nhóm bệnh<br /> <br /> protein. Bệnh nhân có biểu hiện bệnh nặng<br /> <br /> nhân Wilson khu vực châu Âu là ñột biến<br /> <br /> nếu ñây là ñột biến ñồng hợp tử.<br /> <br /> H1069Q (C3270A ) gây<br /> <br /> ra sự<br /> <br /> thay<br /> <br /> Có 7 bệnh nhân (mã số W5.00; W11.00; W<br /> <br /> thế<br /> <br /> Bệnh nhân mã số W5.00 và W32.00 mang<br /> <br /> Histidine thành Glutamine thuộc vùng N của<br /> <br /> ñột biến mới p.T850I (c.2706 C > T) trên ex on<br /> <br /> protein A TP7B [ 10; 12]. ðột biến Arg778Leu<br /> <br /> 10. ðột biến này nằm trong vùng cấu trúc<br /> <br /> trên exon 8 của gen A TP 7B ñã ñược công bố<br /> <br /> xuyên màng. ðột biến p. T850I làm thay ñổi<br /> <br /> là phổ biến nhất trong quần thể người châu Á<br /> [9; 11; 13; 14]. Kết quả nghiên cứu của chúng<br /> <br /> tính chất acid amin tại vị trí 850 và làm ảnh<br /> hưởng ñến chức năng prot ein. Hơn nữa, cả 2<br /> <br /> tôi năm 2007 ñã phát hiện 2 bệnh nhân mang<br /> <br /> bệnh nhân này ñều có thêm ñột biến mới c.<br /> <br /> ñột biến Arg778Leu dạng dị hợp trong nhóm<br /> <br /> ins 47/48 CGGCG trên exon 1dạng dị hợ p cho<br /> <br /> 29 bệnh nhân ñược phân tích gen [3]. Trong<br /> <br /> nên 2 dạng ñột biến mới này gây nên biểu<br /> <br /> nhóm nghiên cứu này (năm 2012 - 2014),<br /> <br /> hiện lâm sàng của bệnh Wilson.<br /> <br /> chúng tôi phát hiện ñược 18 dạng ñột biến và<br /> <br /> Bệnh nhân mã số W36.00 mang ñột biến<br /> <br /> chỉ có 1 bệnh nhân mang ñột biến Arg778Leu.<br /> <br /> mới p.G50S (c.305G > A) trên exon 2 và bệnh<br /> <br /> Những ñột biến này ñều nằm trong vùng chức<br /> <br /> nhân mã số W24.00 mang ñột biến mới<br /> <br /> năng của protein A TP 7B [8]. Cũng trong<br /> <br /> p.F1240I (c.3975C > A) trên exon 18. Cả hai<br /> <br /> nghiên cứu này phát hiện ñược 4 dạng ñột<br /> <br /> bệnh nhân này ñều mang ñột biến missense<br /> <br /> biến mới chưa ñược công bố, ñó là: p.T850I<br /> <br /> nằm trong vùng mã hoá (thay thế nucleotid<br /> <br /> TCNCYH 95 (3) - 2015<br /> <br /> 5<br /> <br />