Giáo trình công nghệ sinh học thực phẩm II - Chương 5

Chia sẻ: Nguyễn Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:15

Thêm vào BST

Báo xấu

345
lượt xem 160
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tài liệu tham khảo Giáo trình công nghệ sinh học thực phẩm II - Chương 5 Sản xuất chế phẩm enzym

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình công nghệ sinh học thực phẩm II - Chương 5

Glucose Axit fotfoenol pyruvic Eritrozo-4- P Axit skimic Axit antranilic Axit corismic Triptophan Axit prephenic Axit phenylpyruvic Axit hydroxyphenylpyruvic Phenylalanine Tirozin Sơ ñ 5: Cơ ch t ng h p triptophan, phenilalanin, tirozin trong t bào vi sinh v t ð t ng h p th a triptophan ngư i ta dùng ch ng e. coli tr dư ng tirozin và phenylalanine. CHƯƠNG V: S N XU T CH PH M ENZYM 5.1 Nh ng tính ch t ưu vi t c a enzyme Enzym là m t ch t xúc tác sinh h c. Nó có ñ y ñ các tính ch t c a ch t xúc tác hoá h c, ngoài ra còn có nh ng ưu vi t sau: 1. Có tính chuyên hoá cao (tính ñ c hi u): m i enzyme ch tác d ng lên m t cơ ch t nh t ñ nh nào ñó theo ý mu n mà không gây nên m t bi n ñ i nào khác. Ví d : amylaza ch thu phân tinh b t, proteaza ch thu phân protein.v.v. 2. Cư ng l c xúc tác l n: v i m t lư ng nh enzyme có th làm xúc tác ñ chuy n hoá m t lư ng cơ ch t l n. Ví d : 1g pepxin có kh năng thu phân 50kg tr ng, 1g rennin có th làm ñông t 72 t n s a, 1mol catalaza có th làm chuy n hoá 5x106mol H2O2 trong 1 giây. 3. Tác d ng trong m t ñi u ki n êm d u: ph n l n các enzyme ho t ñ ng nhi t ñ không cao, pH thư ng là trung tính và áp su t thư ng. 4. Enzym không ñ c h i: t t c các lo i enzyme ñ u có ngu n g c t sinh v t nên không ñ c h i ñ i v i s c kh e con ngư i. Chính vì nh ng ưu vi t ñó mà trong nh ng năm g n ñây ch ph m enzyme ñư c s d ng r ng rãi và ngành công nghi p enzyme cũng ñư c phát tri n không ng ng. 5.2 Ngu n nguyên li u ñ thu nh n enzyme: Enzyme có th thu nh n t nhi u ngu n nguyên li u khác nhau như: ñ ng v t, th c v t và vi sinh v t.
5.2.1 ð ng v t: Enzyme n m trong các cơ quan n i t ng c a ñ ng v t: - Tu t ng: ch a nhi u enzyme amylaza, maltaza, proteaza, esteraza, lipaza.v.v. - D dày ch a nhi u enzyme pepxin, các enzyme tiêu hoá (trong ngăn th tư c a d dày bò có 1 lo i vi khu n có kh năng sinh t ng h p xenlulaza), trong d dày c a bê và nghé có ch a enzyme rennin làm ñông t s a. - Ru t: ch a ch y u là enzyme enterokinaza có kh năng phá v các liên k t peptit. - Gan: là cơ quan ch a r t nhi u enzyme. Không th thu enzyme t ñ ng v t trên qui mô công nghi p ñư c vì th i gian nuôi ñ ng v t quá dài nên không kinh t . 5.2.2 Th c v t: Ngư i ta có th thu ñư c m t s enzyme trong th c v t thư ng ñ ng như thu papain t ñu ñ , bromelain t d a, amylaza t malt, plazmin (c papain) t h ficus (sung, v ). Trong các h ñ u có enzyme ureaza. Trong thu c lá có ch a enzyme amylaza, esteraza, pectinaza, proteaza. Trong chè có ch a nhi u enzyme oxy hoá kh như polyphenoloxydaza. Trong rau qu cũng ch a nhi u lo i enzyme khác nhau. Thu enzyme t th c v t cũng không kinh t vì mu n có nhi u th c v t thì ph i tr ng nên ph i có ñ t và chi phí t n kém trong vi c chăm bón. 5.2.3 Vi sinh v t: So v i ñ ng v t và th c v t thì vi c thu nh n enzyme t vi sinh v t có nhi u l i th hơn. - T vi sinh v t có th thu nh n ñư c nhi u enzyme khác nhau, trong ñó có nh ng lo i không th thu nh n ñư c t ñ ng v t ho c th c v t. - B ng cách thay ñ i ñi u ki n nuôi c y ho c dùng tác nhân ñi u ch nh ngư i ta có th ñi u khi n quá trình sinh t ng h p enzyme c a vi sinh v t theo ý mu n. - Vi sinh v t có kh năng sinh s n và phát tri n nhanh, t ng h p enzyme v i t c ñ c c kỳ l n trong m t th i gian ng n. Chính vì th vi c s n xu t enzyme t vi sinh v t ít t n th i gian. - Enzyme thu nh n t vi sinh v t có ho t tính r t m nh, vư t xa các enzyme t các ngu n sinh v t khác. - Vi sinh v t có kh năng sinh s n, phát tri n và t ng h p enzyme trên các môi trư ng dinh dư ng ñơn gi n, d ki m và r ti n (có th là ph li u c a các ngành s n xu t khác nhau). Cho nên vi c s n xu t enzyme t vi sinh v t cũng r t kinh t .
Chính vì các l i th trên nên ngu n enzyme t vi sinh v t có th ñưa vào ngành s n xu t ch ph m enzyme công nghi p. B ng 1: Kh năng s d ng các lo i enzyme t vi sinh v t Lo i enzyme Vi sinh v t S d ng Amylaza Bacillus Subtilis, Bacillus Bia và rư u (phân hu tinh b t Stearotherophilus. thành ñư ng lên men, s n xu t nha) α-amylaza Asp.niger S n xu t bánh mì, bánh ng t Asp.oryzac (thu phân m t ph n tinh b t) Glucoamylaza Asp.niger S n xu t glucoza, bia (làm Asp.oryzac gi m hàm lư ng dextrin) Endomycopsis bispora Pectnaza Asp.niger S n xu t và làm trong d ch qu , Asp.oryzac các ch ph m rau cho dinh Sclerotinia libertina dư ng tr sơ sinh. Các xenluloza Trichoderma viride CN th c ph m (làm tan thành t bào th c v t rau), rư u (thu nh n ñư ng t xenluloza). ðextranaza Penicillium funiculorum S n xu t dexran v i kích thư c phân t nh t ñ nh. Ch t b sung cho thu c ñánh răng. Invectaza Sacch.Cerevisiac D ch hoá ñư ng ñ làm keo, s n xu t m t ong nhân t o. Các proteaza Bacil.Subtilis, Bacil.Cereus B sung vào b t gi t ñ lo i Bacil.Stearotheroopilus, protein, làm m m th t, ch t tr Streptomyces griseus, tiêu hoá, dùng trong công ngh Asp.oryzac làm phim Enzym làm ñông Mucor pusillus S n xu t fomat sa Keratinaza Streptomyces fradiac Ngành da (kh lông) β-galactozidaza Asp.niger, Pen.notatum B o qu n th c ph m (lo i O2) Xác ñ nh glucoza (ch n ñoán b nh ñái ñư ng). Streptokinaza Streptococcus, ði u tr (tiêu c c ngh n) Spec.chotridium ði u tr các v t thương, v t histolyticum b ng L-asparaginaza Eschericha coli, Erivinia ði u tr b nh b ch c u aroidac Penixilinazylaza Escherichia coli SX các penixilin bán t ng h p
5.3 S n xu t enzym t vi sinh v t: Quá trình s n xu t g m 3 giai ño n: - Tuy n ch n vi sinh v t và c i t o gi ng - Nuôi c y vi sinh v t - Tách và tinh ch enzym 5.3.1 Tuy n ch n vi sinh v t và c i t o gi ng: 1. Tuy n ch n: Kh năng t o enzym c a vi sinh v t r t ña d ng và phong phú. M i lo i enzym có th thu nh n ñư c t nhi u ch ng vi sinh v t khác nhau và ngư c l i m t ch ng vi sinh v t cũng có kh năng sinh nhi u lo i enzym. Ví d : Aspergillus oryzae Amylaza có th thu nh n nh Bacillus Subtilis Bac.Stearothermophilus α-Amylaza Asp.niger Asp.oryzae Asp.awamori Glucoamylaza Asp.oryzae, niger Endomycopsis, awamori Asp.niger Pectinaza Asp. oryzae Asp.awamori Asp.oryzae Proteaza Bac.Subtilis Streptomyces griseus Proteinaza Asp.awamori, flavus, Candidus Bac.mesentericus, Bac.Subtilis Xenlulaza Trichoderma viride Asp.terreus Kh năng sinh enzym c a các ch ng vi sinh v t không gi ng nhau và khác nhau ngay c trong cùng m t ch ng. Vì v y, khi tuy n ch n vi sinh v t ph i ti n hành tìm ki m, phân l p, l a ch n hàng ch c, hàng trăm th m chí ñ n hàng nghìn gi ng vi sinh v t khác nhau m i có ñư c nh ng ch ng vi sinh v t có ho t l c cao trong vi c t o nh ng enzym c n thi t. 2. C i t o gi ng: ð nâng cao s c s n xu t enzym c a vi sinh v t cũng như làm tăng cư ng ho t tính c a enzym ngư i ta ph i s d ng các phương pháp khác nhau ñ c i t o gi ng, ñ c bi t là phương pháp gây ñ t bi n. B ng phương pháp ñ t bi n nhi u nư c ñã thu ñư c nh ng ch ng vi sinh v t có nh ng ñ c tính t t, ch t ng
h p m t ho c vài ba enzym nhưng ñ u có ho t tính cao so v i ch ng nguyên thu ban ñ u. 5.3.2 Nuôi vi sinh v t: 5.3.2.1 Các y u t nh hư ng t i s t ng h p enzym: 1. nh hư ng c a thành ph n môi trư ng dinh dư ng: Là y u t quan tr ng có nh hư ng l n ñ n s phát tri n và t ng h p enzym c a vi sinh v t. Cùng m t lo i vi sinh v t nhưng n u nuôi c y trên các môi trư ng có thành ph n dinh dư ng khác nhau thì m c ñ t o thành enzym và thành ph n enzym ñư c t o thành cũng khác nhau. Ví d : nuôi Asp.oryzae b ng phương pháp b m t trên môi trư ng cám ñ i m ch thì có th t o ñư c nhi u enzym, trong ñó có các lo i enzym có ho t tính cao như amylaza, proteaza, maltaza, pectinaza, invectaza, ribonucleaza. Nhưng n u nuôi trên môi trư ng Kzapek c i ti n v i nitrat và tinh b t thì ch t o thành ch y u là α-amylaza, còn các enzym khác t o thành v i lư ng không ñáng k . Hi n tư ng này ñư c gi i thích b ng lý thuy t sinh t ng h p c m ng enzym. Hi n tư ng c m ng này ch th y vi sinh v t ch không th y ñ ng và th c v t. Khi trong môi trư ng có nh ng ch t khó ñ ng hoá vi sinh v t ph i ti t vào môi trư ng m t ho c nh ng enzym tương ng ñ phân hu nó thành nh ng ch t có th ñ ng hoá ñư c. Cho nên khi thêm các ch t c m ng vào môi trư ng dinh dư ng thì kh năng sinh t ng h p enzym c a vi sinh v t có th tăng lên g p nhi u l n so v i trư ng h p bình thư ng. ð nh nghĩa: M t quá trình sinh t ng h p ñư c g i là c m ng n u như nó ch x y ra m c ñ ñáng k khi trong môi trư ng có cơ ch t ñ c hi u c a enzym này ho c các ch t trao ñ i có c u trúc tương t cơ ch t. Các enzym thu c lo i này g i là enzym c m ng, các cơ ch t kích thích quá trình t ng h p này g i là ch t c m ng. Mu n t ng h p ñư c enzym c m ng c n có 4 ñi u ki n: - Th nh t: Có gen tương ng trong nhi m s c th - Th hai: Có nguyên li u ñ y ñ ñ xây d ng các phân t enzyme ñó (các axit amin, các h p ph n coenzyme). -Th ba: Có năng lư ng c n thi t cho vi c t ng h p enzyme. - Th tư: Có ch t c m ng. N u có ñ 3 ñi u ki n trên nhưng thi u ch t c m ng thì enzyme cũng không ñư c t o thành. Trong công ngh s n xu t enzyme c n ph i l a ch n ch t c m ng thích h p và xác ñ nh n ng ñ t i ưu c a nó trong môi trư ng ñ có hi u su t sinh t ng h p cao nh t. 2. nh hư ng c a ñ m: Trong phương pháp nuôi c y b m t, ñ m c a môi trư ng có v trí ñ c bi t quan tr ng. Khi ñ m th p vi sinh v t b rơi vào tình tr ng b t l i cho ho t
ñ ng s ng nên có khuynh hư ng t o bào t và h n ch s t ng h p enzyme. Khi ñ m quá cao thì ñ tơi x p và thoáng khí c a canh trư ng b gi m, do ñó s t ng h p enzyme khó khăn. ð m cho phép vi sinh v t t ng h p enzyme t t thư ng t 53÷65%, ph thu c vào ñ c ñi m sinh lí c a vi sinh v t, vào c u trúc cơ h c c a môi trư ng và ñi u ki n thoát m c a môi trư ng nuôi c y. 3. pH c a môi trư ng: So v i phương pháp nuôi chìm thì phương pháp b m t ít ch u nh hư ng c a pH môi trư ng ñ n quá trình sinh t ng h p enzyme vì trong quá trình nuôi pH c a môi trư ng khá n ñ nh. V i phương pháp nuôi c y chìm pH môi trư ng bi n ñ i khá rõ r t trong quá trình nuôi và gây nh hư ng l n t i s t ng h p enzyme. Do ñó, ngư i ta thư ng ñi u ch nh pH ñ thu ñư c enzyme v i hi u su t cao. M i lo i enzyme thư ng ñư c t ng h p m nh trong m t vùng pH xác ñ nh ñ i v i t ng lo i vi sinh v t. Ví d : amylaza và pectinaza c a n m m c ñư c t ng h p m nh trong môi trư ng có pH=4,5÷5, còn proteaza trong môi trư ng có pH=6÷6,5. 4. Nhi t ñ : Ph n l n các vi sinh v t có kh năng t ng h p m nh các enzyme ñ u thu c lo i ưa nhi t trung bình, có nhi t ñ t i thích 22÷320C. V i vi khu n có lo i thích nhi t ñ cao hơn (35÷550C) và chúng có kh năng t ng h p các enzyme có ñ b n nhi t cao. Khi nâng nhi t ñ môi trư ng t i quá m c thích h p thì kh năng sinh t ng h p enzyme b gi m rõ r t. 5. Oxy: ð vi sinh v t sinh trư ng và phát tri n ñư c thì ph i có oxy. Do ñó, trong th i kỳ tích lu sinh kh i ph i cung c p ñ y ñ oxy cho môi trư ng. 6. Th i gian nuôi: Th i gian nuôi c y thích h p c a m i lo i vi sinh v t ñư c xác ñ nh b ng th i gian cho phép tích t enzyme t i ña. Th i gian ñó ph thu c vào ch ng vi sinh v t và ít ph thu c vào enzyme chúng t ng h p. 5.3.2.2 L a ch n môi trư ng nuôi c y: Thành ph n môi trư ng dinh dư ng là m t trong nh ng y u t có nh hư ng quy t ñ nh ñ n ho t ñ ng s ng c a vi sinh v t cũng như kh năng sinh t ng h p enzyme c a chúng. ð b o ñ m nh ng yêu c u t i thi u cho vi sinh v t phát tri n và t ng h p enzyme thì trong môi trư ng c n có các ch t ch a cacbon, nitơ, hydro, oxy và các ch t khoáng như Mg, Ca, P,S , Fe, K .v.v. - Ngu n cung c p cacbon thư ng dùng là gluxit. Khi s d ng ñư ng c n nh r ng m t s ñư ng có tác d ng kìm hãm s sinh t ng h p m t s enzyme
thu phân. Ví d : ñư ng glucose có th kìm hãm sinh t ng h p m t s enzyme h amylaza. Ngoài gluxit cũng có th s d ng ngu n cacbon khác như m , d u, axit h u cơ, rư u. Trong s các axit h ư cơ thì axit lactic ñư c vi sinh v t h p th d dàng hơn c . Axit này có nhi u trong nư c chi t ngô. Cho nên cao ngô ñư c dùng v a là ngu n b sung ñ m v a là ngu n cung c p cacbon cho vi sinh v t phát tri n. - Ngu n cung c p nitơ có th là các h p ch t h u cơ ho c vô cơ. Các h p ch t h u cơ là nh ng h p ch t giàu ñ m như cao ngô, b t ñ u tương, khô ñ u, khô l c… Ngu n nitơ vô cơ như urê, NH3, các mu i amôn. Ngoài ra, m t s axit amin, bazơ purin (adenine, guanine…), pyrimidin cũng ñư c b sung vào môi trư ng nuôi c y. Các axit amin có tác d ng khác nhau ñ i v i vi sinh v t cũng như vi c sinh t ng h p enzyme. Nhi u axit amin có kh năng tăng cư ng sinh t ng h p enzyme, m t s khác l i kìm hãm ho c không có nh hư ng rõ r t. - Các nguyên t khoáng cũng có nh hư ng rõ r t ñ n quá trình sinh t ng h p enzyme. Các nguyên t này bao g m c nguyên t ña lư ng và vi lư ng. Vi lư ng là s t, k m, ñ ng, coban. Các nguyên t này thư ng có trong nư c ho c trong các thành ph n h u cơ khác c a môi trư ng (b t, cao ngô) do ñó không c n b sung ho c ch b sung d ng v t. N ng ñ c a các nguyên t này tăng s kìm hãm m nh s phát tri n c a vi sinh v t. Các nguyên t ña lư ng ñư c ñưa vào dư i d ng mu i vô cơ nhưng c n tính c hàm lư ng c a chúng ñã có s n trong các thành ph n c a môi trư ng. Trong các nguyên t này c n lưu ý ñ n P và S vì 2 nguyên t này là thành ph n c u t o c a nhi u ch t quan tr ng, nh t là nucleotit, lipit, vitamin… - Các y u t sinh trư ng: các vitamin ch y u dùng ñ kích thích sinh trư ng c a vi sinh v t. Tuy nhiên c n nh r ng, trong nhi u trư ng h p môi trư ng thích h p cho s sinh trư ng c a vi sinh v t chưa h n ñã là thích h p ñ sinh t ng h p enzyme. Có khi môi trư ng kìm hãm s tích lu sinh kh i t bào nhưng v n tăng cư ng sing t ng h p enzyme. ð xác ñ nh thành ph n môi trư ng dinh dư ng thích h p cho m i vi sinh v t có th ti n hành l a ch n trên cơ s kinh nghi m ho c dùng các phương pháp toán h c qui ho ch th c nghi m. Khi l a ch n nguyên li u ñ chu n b môi trư ng c n chú ý r ng, trong các nguyên li u t nhiên có ch a nhi u ch t khác nhau, k c các nguyên t khoáng ña lư ng cũng như vi lư ng và có c các y u t sinh trư ng. Do v y, trong nhi u trư ng h p không c n b sung thêm các lo i mu i vô cơ. M t khác, các nguyên li u này r ti n do v y nó thư ng dùng trong công nghi p ñ s n xu t ch ph m enzyme t vi sinh v t.
Các nguyên li u t nhiên thư ng dùng ñ chu n b môi trư ng là cám g o, b t ngô, b t ñ u tương, khô l c ho c các ph li u như men bia, r ñư ng… Trong các nguyên li u này thì cám g o và b t ngô là ngu n cacbon t t nh t. Còn n m men bia t phân, khô l c là ngu n nitơ t t nh t. Khi chu n b môi trư ng còn c n ph i chú ý ñ n các ch t có tác d ng ñi u hoà sinh t ng h p enzyme, ñ c bi t là các ch t c m ng. ð i v i m i lo i enzyme có th có nhi u ch t c m ng cho nên ph i l a ch n ch t c m ng có hi u qu nh t. Ví d như ch t c m ng c a sinh t ng h p amylaza là tinh b t, dextrin; c a proteaza là các protein có tr ng lư ng phân t nh . S d ng các ch t c m ng thư ng làm tăng ñáng k lư ng enzyme ñư c t ng h p. Tuy nhiên, khi l a ch n ch t c m ng c n tính toán c n th n v giá thành c a nó. 5.3.2.3 Các phương pháp nuôi c y vi sinh v t: Có nhi u phương pháp khác nhau ñ nuôi vi sinh v t t ng h p enzyme. 1. Phương pháp b m t: Phương pháp này thích h p ñ nuôi các lo i n m m c vì kh năng phát tri n c a nó nhanh, m nh nên ít t p nhi m. • Qui trinh công ngh : Môi trư ng ph i tr n làm m h p ñánh tơi và làm ngu i gieo m c gi ng vào thi t b nuôi vào phòng nuôi nuôi m c canh trư ng. Các ch t dinh dư ng thư ng là các nguyên li u t nhiên như các ch t th i c a công ngh th c ph m ho c h n h p c a nhi u ch t. Trong môi trư ng c n thêm ch t c m ng c n thi t cho s t ng h p enzym ho c b sung thêm ch t dinh dư ng ngu n nitơ, photpho như nư c chi t ngô, khoai tây, d ch t phân n m men…ð b o ñ m ñ x p c a môi trư ng c n có ch t làm x p như tr u (10÷20%). Trư c khi gieo c y c n thanh trùng môi trư ng ñ ñ m b o không b nhi m vi sinh v t l . Quá trình nuôi c y kéo dài t 33÷48h. Có các hi n tư ng: - Th i nhi t, c n gi to=28÷32oC - Gi m m, gi ϕphòng=96÷100% - Cung c p O2: trong quá trình m c phát tri n l y O2 và th i CO2 c n cung c p không khí vô trùng. • Ưu như c ñi m c a phương pháp: Ưu: - Cho n ng ñ enzym cao hơn so v i phương pháp b m t - Có th s y khô nhanh chóng môi trư ng (d ng thô) mà không nh hư ng ñ n ho t l c enzym. - Tránh s nhi m trùng toàn b kh i canh trư ng - T n ít ñi n năng.
Như c: - Khó cơ gi i hoá, t ñ ng hoá. - Năng su t th p. - T n nhi u lao ñ ng. - T n nhi u m t b ng. 2. Phương pháp nuôi c y chìm: • V i phương pháp này vi sinh v t phát tri n trong môi trư ng l ng có s c khí và khu y ñ o liên t c. Ngu n cacbon s d ng trong phương pháp này là tinh b t, các ch t th i có ñư ng như r ñư ng và các nguyên li u khác. Ngu n nitơ hay dùng là ch t h u cơ như cao ngô, d ch men bia, d ch thu phân, khô l c…Ngoài ra trong thành ph n môi trư ng cũng c n b sung thêm các ch t khoáng. Môi trư ng c n ñư c thanh trùng b ng cách s c hơi tr c ti p to=121÷125oC trong th i gian 60÷90 phút ñ i v i môi trư ng ch a nguyên li u b t, ñ m thô và 20÷30 phút v i các lo i môi trư ng có ch a ñư ng. Trong quá trình nuôi c y chìm c n ph i s c khí vô trùng và khu y ñ o liên t c. N u có b t ph i dùng d u phá b t. Th i gian t 1÷4 ngày tuỳ ch ng. Ph i chú ý ñi u ch nh pH. • Ưu, như c: + Ưu: - Ti t ki m di n tích - D cơ gi i hoá, t ñ ng hoá. - S d ng h p lí ch t dinh dư ng, tránh lãng phí. - Thu enzym ít t p ch t - ð m b o v sinh, vô trùng nên ít nhi m vi sinh v t l . + Như c: - N ng ñ enzym th p, c n làm ñ c canh trư ng trư c khi tách nên giá thàcao. - T n ñi n do s c khí. - N u không ñ m b o vô trùng s nhi m hàng lo t. 3. Phương pháp nuôi chìm 2 bư c: - Bư c 1: vi sinh v t nuôi trong thi t b ñ phát tri n t i ña. - Bư c 2: chuy n sinh kh i sang thi t b khác ñ sinh t ng h p enzym. 5.3.3 Tách và tinh ch enzym: Trong th c t enzym ñư c s d ng nhi u d ng khác nhau. M t s lĩnh v c có th s d ng dư i d ng canh trư ng khô mà ch t lư ng s n ph m không thay ñ i (như s n xu t rư u, công ngh thu c da). ða s các ngành công nghi p (ch y u là th c ph m và công nghi p nh ) ñòi h i ph i s d ng các ch ph m enzym s ch (g i là ch ph m k thu t). Còn trong y h c ph i s d ng các ch ph m enzym tinh khi t. Tuy nhiên, cho ñ n nay chưa tìm ñư c m t phương
pháp chung ñ tách m t enzym nào ñó mà ph i ph i h p nhi u phương pháp khác nhau. Quá trình làm s ch enzym g m 2 giai ño n là chi t enzym và tách enzym. 5.3.3.1 Chi t enzym: M c ñích c a công ño n này là tách các enzym ra kh i canh trư ng sau lên men. Quá trình này ph thu c vào lo i enzym (ngo i bào hay n i bào) và môi trư ng lên men (l ng ho c r n) mà ti n hành khác nhau. ð i v i enzym ngo i bào n m trong canh trư ng l ng thì ti n hành tách sinh kh i ñ thu dung d ch có ch a enzyme. N u enzym ngo i bào n m trong canh trư ng r n (x p) thì dùng nư c vô trùng ho c các dung d ch ñ m thích h p ñ chi t enzym. ð thu các enzym n i bào thì ph i ti n hành phá v t bào b ng m t trong các phương pháp sau: - Phương pháp ñ ng hoá (nghi n trong máy ñ ng hoá) - Nghi n v i b t thu tinh, cát… - T phân - Làm l nh ñông và tan giá l p ñi l p l i nhi u l n - Nh tác ñ ng c a siêu âm - Dùng áp su t th m th u cao - Phương pháp khuy ch tán Sau khi phá v t bào thì dùng nư c c t ho c dung d ch mu i loãng ho c các dung d ch ñ m thích h p ñ chi t enzym. 5.3.3.2 Tách enzym: M c ñích c a giai ño n này là làm s ch và tách các enzym ra kh i h n h p ph thu c vào m c ñ tinh s ch c a các ch ph m enzym mà quá trình tách cũng r t khác nhau. 1. Thu nh n ch ph m k thu t: Ch ph m enzym k thu t là ch ph m enzym ñư c tinh ch sơ b có th ch a m t ho c vài enzym ch y u. ð thu ch ph m enzym k thu t thì ñ u tiên ph i cô ñ c dung d ch enzym nhi t ñ 30oC cho ñ n khi ñ t n ng ñ 20g/lit. Sau ñó ti p t c cô nhi t ñ 40oC cho ñ t n ng ñ 30÷50g/lit. Khi cô có th cho thêm ch t b o qu n ho c ch t n ñ nh. Ti p theo ñem s y phun v i nhi t ñ không vư t quá 70oC. Ngoài ra ñ thu ch ph m enzym k thu t ngư i ta cũng có th k t t a b ng dung môi h u cơ ho c mu i trung tính và sau ñó cho ch t n ñ nh vào s y khô r i nghi n. Dung môi h u cơ thư ng dùng là rư u etylic, izopropylic, axeton…k t t a b ng dung môi h u cơ d a trên nguyên t c khi thêm dung môi vào dung d ch enzym thì l c hút gi a các phân t protein-enzym tích ñi n và các phân t
nư c bao quanh chúng b gi m. Khi n ng ñ dung môi thêm vào ñ t ñ n m c làm cho năng lư ng hydrat hoá gi a các phân t nư c và protein nh hơn năng lư ng liên h p gi a các phân t protein-enzym thì lúc ñó các phân t protein- enzym liên h p l i t o k t t a. Tuỳ theo tính ch t c a enzym và dung môi h u cơ mà m i m t lo i enzym ñư c k t t a m t n ng ñ dung môi khác nhau. Ví d proteaza k t t a trong etanol 76÷78%, α-amylaza k t t a trong etanol 70%, glucoamylaza k t t a trong etanol 45% và trong axeton 70%. Dùng dung môi h u cơ có ưu ñi m là c t và thu h i ñư c. Nhưng dung môi d làm cho enzym b vô ho t. ð kh c ph c như c ñi m ñó ph i ti n hành k t t a enzym nhi t ñ th p (5oC) và th i gian ng n. Các mu i trung tính thư ng dùng ñ k t t a enzym là: (NH4)2SO4, NaCl…tuỳ theo tính ch t t ng lo i enzym mà ngư i ta dùng n ng ñ mu i khác nhau. Ví d amylaza thư ng k t t a trong (NH4)2SO4 n ng ñ 0,75% ñ bão hoà; glucoamylaza n ng ñ 0,8÷0,9% ñ bão hoà. Phương pháp dùng mu i trung tính k t t a còn g i là diêm tích. Phương pháp này d a trên nguyên t c các ion mu i có tác d ng phá v các l p hydrat bao quanh phân t protein do s hút các phân t trái d u v phía nó. K t qu làm phân t protein b m t nư c và ñông t . Sau khi k t t a ph i lo i các mu i trung tính ra kh i enzym b ng phương pháp th m tích. ð th c hi n ngư i ta cho enzym vào các màng bán th m (xenlofan) r i cho vào các dung d ch ñ m thích h p ngâm trong 24 gi và sau ñó th l i n u ñã lo i h t mu i thì ñưa ñi x lí ti p. 2. Thu nh n ch ph m tinh khi t: ð thu nh n ch ph m tinh khi t ph i k t h p nhi u phương pháp và qua nhi u giai ño n. ð u tiên ph i ti n hành lo i b các protein không ho t ñ ng b ng phương pháp bi n tính ch n l c. Các protein bi n tính có th tách ra b ng cách l c ho c ly tâm. Sau ñó enzym ñư c k t t a b ng dung môi h u cơ ho c mu i trung tính. Ti p theo dùng s c kí (s c kí trao ñ i ion, h p ph , phân b , gel phân t v.v...) ñ thu phân ño n enzym có ho t l c cao nh t. Sau khi tinh ch xong ph i dùng phương pháp ñi n di ñ ki m tra m c ñ ñ ng nh t c a enzym. 5.4 ðánh giá ch t lư ng c a enzym: 5.4.1 Phương pháp ñánh giá: Ch t lư ng c a enzym ñư c ñánh giá b ng m c ñ ho t ñ ng c a nó t c là ho t ñ c a enzyme. Th c t ngư i ta ño ho t ñ c a enzym thông qua vi c xác ñ nh lư ng cơ ch t m t ñi hay lư ng s n ph m ñư c t o thành trong ph n ng. V nguyên t c có th chia ra làm 3 nhóm phương pháp xác ñ nh ho t ñ enzym:
1. ðo lư ng cơ ch t b m t ñi hay lư ng s n ph m ñư c t o thành trong m t th i gian nh t ñ nh v i m t n ng ñ enzym xác ñ nh. 2. ðo th i gian c n thi t ñ thu ñư c m t lư ng bi n thiên nh t ñ nh c a cơ ch t hay s n ph m ng v i m t n ng ñ enzym nh t ñ nh. 3. ðo n ng ñ enzym c n thi t ñ làm bi n ñ i m t lư ng cơ ch t hay thu nh n m t lư ng s n ph m nh t ñ nh trong m t th i gian nh t ñ nh. 5.4.2 ðơn v : ð ño ho t ñ c a enzym ngư i ta dùng ñơn v ho t ñ . - ðơn v enzym qu c t (kí hi u UI): là lư ng enzym có kh năng xúc tác làm chuy n hóa m t micromol cơ ch t sau m t phút ñi u ki n tiêu chu n ( pHopt, toopt ñ i v i enzym c n xác ñ nh) - ðơn v Katal (Kat): là lư ng enzym có kh năng xúc tác làm chuy n hoá m t mol cơ ch t trong m t giây ñi u ki n tiêu chu n 1 -6 × 10 Kat=16,67 nKat (nanoKat) 1UI= 60 - Ho t ñ riêng c a ch ph m enzym: là s ñơn v UI ho c s ñơn v Kat ng v i 1ml ch ph m (n u là dung d ch) ho c 1mg ch ph m (n u là b t). N u enzym ñã tinh s ch thì ho t ñ ñư c bi u th b ng s UI ho c s Kat trên 1mg enzym. - Ho t ñ phân t : s phân t cơ ch t ñư c chuy n hoá b i m t phân t enzym trong m t ñơn v th i gian. 5.4.3 Nh ng chú ý khi ñánh giá ch t lư ng enzym: ð ñánh giá chính xác ñ ho t ñ ng c a enzym thì khi xác ñ nh ho t ñ c a nó c n chú ý: - N ng ñ cơ ch t trong ph n ng ph i trong m t gi i h n thích h p ñ th a ñ bão hoà enzym nhưng không quá cao ñ n m c kìm hãm enzym. - V i nh ng enzym c n có ch t ho t hoá ho c ch t làm b n thì ph i cho ch t này vào enzym trư c khi cho cơ ch t vào ph n ng. - Xác ñ nh ho t ñ c n ti n hành pHopt và c ñ nh. pH thư ng thay ñ i ph thu c vào cơ ch t và thành ph n dung d ch ñ m. - Nhi t ñ dùng xác ñ nh ho t ñ ph i nh hơn nhi t ñ t i ưu c a enzym ñ ñ phòng s kìm hãm c a enzym nhi t ñ cao. - Th i gian xác ñ nh ho t ñ thư ng 5÷30 phút. Nhưng cũng có trư ng h p kéo dài ñ n 24 gi n u ho t ñ c a enzym quá th p. Trong th i gian dài ph i cho thêm nh ng ch t di t khu n ñ tránh hi n tư ng t p nhi m. 5.5 Enzym không tan: Enzym không tan hay còn g i là enzym c ñ nh là enzym n m trong m t không gian b gi i h n. S gi i h n linh ho t c a enzym ñ t ñư c b ng cách ñưa nó vào m t pha cách li, tách r i kh i pha dung d ch t do và ñó nó v n
có kh năng ti p xúc ñư c v i phân t cơ ch t. Pha ch a enzym thư ng không tan trong nư c nhưng cũng có th là polymer cao phân t ưa nư c. 5.5.1 Ưu như c ñi m c a enzym không tan: 1. Ưu ñi m: - Gi m giá thành vì có th s d ng l p l i nhi u l n m t lư ng enzym xác ñ nh. - Enzym không l n trong các s n ph m do ñó tránh ñư c nh hư ng không t t c a nó ñ i v i s n ph m. - Có th làm ng ng nhanh chóng các ph n ng khi c n thi t. - Enzym không tan b n hơn enzym tan do ñó k t h p t n d ng các y u t nhi t ñ , pH… - Dùng enzym c ñ nh có th d dàng thay th các quá trình lên men b ng các ph n ng enzym ngoài t bào. 2. Như c ñi m: Enzym không tan có ho t ñ riêng nh hơn enzym tan 5.5.2 Phương pháp s n xu t enzym không tan: G m có 3 phương pháp: 5.5.2.1 G n liên k t ñ ng hoá tr : ða s các enzym không tan ñư c s n xu t b ng phương pháp này. Nó chia ra làm hai phương pháp là g n enzym vào ch t không hoà tan ho c g n các phân t enzym v i nhau ñ t o thành ñ i phân t không hoà tan. 1. G n phân t enzym vào ch t mang không hoà tan: • Yêu c u v ch t mang: - Có ñ hoà tan th p và b n v ng v i các tác ñ ng cơ, nhi t và hoá h c. - Các ch t mang không gây tác ñ ng kìm hãm enzym. - Không h p ph phi ch n l c ñ i v i protein. - Nên háo nư c vì ch t mang k nư c có th gây c ch v i enzym ñư c mang. - Vi c g n s có hi u qu hơn n u ch t mang và enzym có ñi n tích trái d u. • Nh ng ch t mang thư ng dùng: + Ch t mang h u cơ: như là polypeptit, polysaccarit, các d n xu t c a xenlulo (DEAE-xenlulo: dietyl animoetyl xenlulo, CM-xenlulo: cacboxyl metyl xenlulo), d n xu t c a dextran (DEAE-sephadex, CM-sephadex) ho c agaroza (aga khác v i agaroza, trong thành ph n c a agaroza có g c sunfat). Ch t mang thông d ng hơn c là các detran có liên k t ngang g i là sephadex và agaroza d ng h t g i là sepharoza. Nói chung c 2 lo i này ñ u có c u trúc l x p làm cho các phân t l n có th xâm nh p vào gel m t cách d dàng.
Ngoài ra còn có các polymer t ng h p khác như polyacrylamit, polysterol, polyamit. + Ch t mang vô cơ: so v i ch t mang h u cơ thì ch t mang vô cơ b n hơn v nhi t, cơ h c, hoá h c, vi sinh v t và nh t là không thay ñ i c u hình c a khuôn khi thay ñ i tính ch t c a môi trư ng xung quanh. Các ch t mang vô cơ như: silicagen, pentonit, nhôm hydroxyt … 2. G n các enzyme v i nhau Ngư i ta có th g n nh ng enzyme l i v i nhau nh nh ng tác nhân ña hay lư ng ch c ñ t o thành nh ng ñ i phân t enzyme không hoà tan. V i phương pháp này thu ñư c nhi u d n xu t enzyme không tan, ví d thu d n xu t tripxin không tan b ng cách dùng andehyt glutaric (OHC-(CH2)3-CHO) 1% ñ liên k t các phân t enzyme. Phương pháp này có ưu ñi m: - Ít t n th t enzyme do gi i phóng ra môi trư ng - Tăng kh năng ch ng ch u c a enzyme ñ i v i các y u t bi n tính nên ñưa vào s n xu t ñư c. Như c ñi m c a phương pháp này là s enzyme c ñ nh ít. 5.5.2.2 “Gói”enzyme trong khuôn gel Ph i ti n hành trùng h p hoá các gel ñ ng th i v i s có m t c a enzyme. Sau ñó enzyme ñư c gi l i trong gel và gel ñã có enzyme có th làm nh b ng cách nghi n trong máy ñ ng hoá ho c ép qua các l rây r i ñem s y khô nhi t ñ không quá 400C. Có th “gói” enzyme b ng các phương pháp sau: - Các gel ñư c hình thành trong s polymer hoá t ng h p - Các enzyme b nh t trong các l nh c a các s i t ng h p - Gói trong bao vi th - Phương pơháp ti n polymer 5.5.2.3 Phương pháp h p ph v t lí Phương pháp h p ph v t lí không thông qua liên k t hoá tr g n các enzyme trên ch t mang. Quá trình th c hi n h p ph khá ñơn gi n: ch t h p ph và enzyme ñư c tr n l n v i nhau trong m t kho ng th i gian cho phép s h p ph x y ra nh tương tác c a các liên k t ion, k nư c, hydrogen và l c Van der Wals. Phương pháp này có như c ñi m là quá trình gi i h p ph enzyme d dàng x y ra b i s thay ñ i pH, nhi t ñ và thành ph n ion. 5.5.3 M t s tính ch t c a enzyme không tan: - Enzyme không tan có ho t ñ riêng nh hơn enzyme tan - Enzyme không tan cũng tuân theo ñ nh lu t Michaelis Menten (s nh hư ng c a n ng ñ cơ ch t ñ n ho t tính enzyme). Tuy nhiên do có hi n tư ng c nh tranh gi a cơ ch t và ch t mang, do hi n tư ng khuy ch tán nên cũng có
nh ng sai khác ñáng k v t c ñ ph n ng c a enzyme: khi ch t mang và cơ ch t tích ñi n cùnh d u thì Khôngm không tan > Km tan, n u tích ñi n trái d u thì ngư c l i (Km - H ng s Michaielis) - Enzyme không tan có tính b n nhi t cao hơn enzyme tan - Enzyme không tan có s d ch chuy n pH t i ưu sang mi n ki m ho c axit hơn so v i enzyme tan. - Enzyme không tan có th i gian b o qu n lâu hơn và b n v i các ch t kìm hãm cũng như các tác nhân gây bi n tính. CHƯƠNG VI: S N XU T AXIT H U CƠ Axit h u cơ ñư c s d ng r ng rãi trong ch bi n và b o qu n th c ph m cũng như trong công ngh vi sinh v t. Chính vì th mà hi n nay axit h u cơ ñư c nghiên c u và s xu t r ng rãi. 6.1 Các phương pháp s n xu t axít h u cơ: ð s n xu t axít h u cơ ngư i ta có th dùng nhi u phương pháp khác nhau như: - Phương pháp t ng h p hoá h c - Phương pháp chi t tách t nguyên li u th c v t - Phương pháp sinh t ng h p nh vi sinh v t Trong các phương pháp này thì phương pháp sinh t ng h p nh vi sinh v t r t có ý nghĩa vì quá trình s n xu t nhanh, s d ng nguyên li u s n có r ti n và có th t o ñư c nhi u lo i axít h u cơ khác nhau. 6.2 K thu t s n xu t m t s axít h u cơ nh vi sinh v t: 6.2.1 S n xu t axít axetic: Axit axetic có th thu nh n b ng cách lên men ñư ng ho c oxy hoá rư u etylic. Sau ñây xét quá trình s n xu t axit axetic t rư u etylic. 1. Ch ng vi sinh v t: ð oxy hoá rư u etylic thành axít axetic ngư i ta có th s d ng nhi u lo i vi khu n khác nhau. Nhưng s d ng nhi u hơn c là các ch ng vi khu n: Bacterium schuzenbachi, Bacterium curvum. Các lo i vi khu n này có kh năng oxy hóa r t l n. 2. Phương trình lên men: CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O + Q 3. K thu t lên men: Có th s d ng phương pháp lên men liên t c ho c gián ño n. ð quá trình lên men ti n tri n ñư c t t thì c n chú ý các ñi m sau: - Nguyên li u và h n h p dinh dư ng: có th s d ng c n thô ho c c n tinh ch ñ làm môi trư ng. Theo kinh nghi m cho th y s n xu t t c n thô thì