Giáo trình Thực hành Vi sinh vật học - TS. Võ Thị Xuyến

Chia sẻ: Caphesuadathemhanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:44

Thêm vào BST

Báo xấu

73
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Giáo trình Thực hành Vi sinh vật học cung cấp cho người học những kiến thức như: Chuẩn bị dụng cụ - pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật; Phân lập vi sinh vật; Nuôi cấy, quan sát sự phát triển của vi sinh vật;...Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Thực hành Vi sinh vật học - TS. Võ Thị Xuyến

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN LANG KHOA CÔNG NGHỆ Giáo trình thực hành: VI SINH VẬT HỌC (LƯU HÀNH NỘI BỘ) GVTH: TS. VÕ THỊ XUYẾN ` TP. HỒ CHÍ MINH - 2020
MỤC LỤC NGUYÊN TẮC CHUNG KHI LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT .................................................................................. 1 I. NGUYÊN TẮC LÀM VIỆC ............................................................................ 1 II. MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẰM ĐẠT KẾT QUẢ TỐT TRONG THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC ................................................................... 1 III. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC TẬP ............................................................ 2 BÀI 1: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT .......................................................................................................... 3 I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU ................................................................................... 3 II. VẬT LIỆU ...................................................................................................... 3 III. CHUẨN BỊ DỤNG CỤ ................................................................................. 3 1. Bao gói dụng cụ .............................................................................................. 3 2. Phương pháp khử trùng dụng cụ ..................................................................... 4 IV. PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG ........................................................................... 6 1. Khái niệm chung.............................................................................................. 6 2. Các yêu cầu cơ bản của môi trường dinh dưỡng ............................................. 6 3. Phương pháp làm môi trường .......................................................................... 7 V. THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ .................................................. 11 BÀI 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT................................................................. 12 I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU ................................................................................. 12 II. VẬT LIỆU .................................................................................................... 12 III. KHÁI NIỆM ................................................................................................ 12 IV. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT ............... 12 1. Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ (từ quần thể vi sinh vật) trên các môi trường phân lập ...................................................................................................................... 13 2. Phân lập vi sinh vật trên môi trường đặc ở đĩa petri ..................................... 13 3. Kiểm tra độ thuần khiết của giống phân lập .................................................. 14 V. PHÂN LẬP MỘT SỐ GIỐNG VI SINH VẬT ............................................ 15 1. Phân lập nấm men ......................................................................................... 15 2. Phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Mucor ............ 16 3. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................ 17 4. Phân lập xạ khuẩn .......................................................................................... 17
VI. THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ ................................................. 17 BÀI 3: NUÔI CẤY, QUAN SÁT SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 18 I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU ................................................................................. 18 II. VẬT LIỆU .................................................................................................... 18 III. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT ............................................ 18 1. Khái niệm ...................................................................................................... 18 2. Mục đích của việc nuôi cấy ........................................................................... 18 3. Nguyên tắc ..................................................................................................... 18 4. Các phương pháp nuôi cấy ............................................................................ 19 IV. CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI VI SINH VẬT .................................................... 22 1. Nhiệt độ ......................................................................................................... 22 2. Độ ẩm ............................................................................................................ 22 3. Điều kiện hiếu khí và yếm khí: ..................................................................... 22 V. QUAN SÁT ĐẶC TÍNH SINH LÝ CỦA VI SINH VẬT NUÔI CẤY ...... 23 1. Quan sát đặc tính phát triển của vi sinh vật trên môi trường đặc. ................. 23 2. Quan sát đặc tính phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng. ............. 23 VI. THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ ................................................. 24 BÀI 4: ĐẾM SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT ..................................... 25 I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU ................................................................................. 25 II. VẬT LIỆU .................................................................................................... 25 III. THU VÀ PHA LOÃNG MẪU .................................................................... 25 1. Thu mẫu ......................................................................................................... 26 2. Pha loãng mẫu ............................................................................................... 26 IV. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT .................................... 27 1. Xác định trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật bằng phòng đếm hồng cầu ... 27 2. Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch. ....................................................................................... 29 V. THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ .................................................. 30 BÀI 5: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI . 31 I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU ................................................................................. 31 II. VẬT LIỆU .................................................................................................... 31 III. QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT................................................... 32 1. Quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống – làm tiêu bản tạm thời ..................... 32
2. Quan sát vi sinh vật ở trạng thái chết – làm tiêu bản cố định (tiêu bản vi sinh vật chết nhuộm màu) ......................................................................................... 34 IV. THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ ................................................. 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 40
NGUYÊN TẮC CHUNG KHI LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT I. NGUYÊN TẮC LÀM VIỆC Khi làm việc với vi sinh vật, sinh viên thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật. Bên cạnh những loài có ích, có rất nhiều loài gây bệnh cho người, động vật, thực vật. Vì vậy, trong quá trình nghiên cứu, việc tiếp xúc thường xuyên với vi sinh vật và các vật phẩm có vi sinh vật là điều không thể tránh khỏi. Do đó, để giữ gìn sức khỏe và đạt hiệu quả cao trong công tác nghiên cứu, người làm thí nghiệm cần phải thực hiện nghiêm ngặt các quy tắc sau: 1. Phải mặc áo blouse trong thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm. 2. Không nói chuyện, không ăn uống, không hút thuốc và không đi lại lộn xộn trong phòng thí nghiệm. 3. Khi làm việc trong phòng thí nghiệm vi sinh vật phải tuyệt đối giữ vệ sinh, tôn trọng sự ngăn nắp và trật tự của phòng thí nghiệm. 4. Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm, môi trường nuôi cấy vi sinh vật gây bẩn ra bàn ghế, sách vở, quần áo hay các vật dụng khác. Trường hợp gây bẩn phải làm vệ sinh ngay. 5. Khi sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ… phải hết sức thận trọng, tránh làm đổ vỡ và hư hỏng. 6. Khi xảy ra tai nạn hoặc sự cố, cần báo ngay với cán bộ phụ trách để có biện pháp xử lý thích hợp, kịp thời. 7. Sau khi kết thúc bài thực hành, phải vệ sinh nơi làm việc của mình, vệ sinh các dụng cụ máy móc, dụng cụ thí nghiệm và xếp vào nơi qui định. Rửa tay sạch và dùng cồn sát khuẩn trước khi rời khỏi phòng thí nghiệm. II. MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẰM ĐẠT KẾT QUẢ TỐT TRONG THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC - Trước khi vào bài thực hành: Cần nghiên cứu kỹ mục đích – yêu cầu và nội dung toàn bộ bài hướng dẫn để hình dung được công việc sắp làm. Hiểu thật rõ các nguyên tắc của mỗi thí nghiệm để thấy được cơ sở khoa học của việc đề ra phương pháp thực nghiệm. Đọc thật cẩn thận cách tiến hành thí nghiệm để hiểu được tiến trình của nó. Nếu có vấn đề gì không rõ thì phải xem lại các khái niệm, các kiến thức có liên quan với lý thuyết để làm sáng tỏ vấn đề trong bài. 1
- Trong giờ thực hành: Cần có sổ ghi chép các công việc thí nghiệm ví dụ: tên thí nghiệm, đối tượng nghiên cứu, những nguyên tắc cơ bản của phương pháp, những kết quả đạt được… Cần thực hiện đúng các thao tác và quy trình thí nghiệm để đạt được mục đích và yêu cầu đề ra. - Sau mỗi giờ thực hành: Phải làm đầy đủ tường trình theo phần câu hỏi và bài tập (nếu có) đã nêu cuối bài. III. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC TẬP Kết quả cuối đợt thực tập được đánh giá dựa vào mức độ chuyên cần (hiện diện đầy đủ, nghiêm túc trong học tập), mức độ hiểu nguyên tắc, nhớ các thao tác chính của mỗi bài thực tập và mức độ thành thạo thao tác. Hai chỉ tiêu sau được đánh giá dựa vào kiểm tra viết (hoặc vấn đáp) và thực hành cuối đợt thực tập. 2
BÀI 1: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU - Biết cách bao gói, làm nút bông, khử trùng dụng cụ bằng nồi hấp khử trùng ở áp suất cao và bằng tủ sấy. - Nắm vững yêu cầu, nguyên tắc, các bước thực hiện pha chế và khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật. II. VẬT LIỆU - Ống nghiệm, bình tam giác, pipet, đĩa petri … sạch để bao gói. - Ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri để pha môi trường - Gòn không thấm, giấy báo, thun… - Cân các loại - Máy đo pH hoặc giấy đo pH - Cốc thủy tinh, đũa khuấy, phễu thủy tinh, muỗng cân hóa chất, giấy lọc - Bếp điện, nồi đun - Dao, kéo, giá ống nghiệm - Agar, khoai tây, nước cất - Xilen - Giấy lau kính hiển vi - Các loại hóa chất cần cho pha chế môi trường dinh dưỡng III. CHUẨN BỊ DỤNG CỤ 1. Bao gói dụng cụ 1.1 Nguyên tắc - Dụng cụ được bao gói để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, phải thật sạch và khô, không bị nứt mẻ. - Việc bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng. 1.2 Phương pháp bao gói dụng cụ Việc bao gói dụng cụ gồm hai khâu: - Làm nút bông: đối với ống nghiệm, bình tam giác, pipet… - Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ thủy tinh. 3
1.3 Cách làm nút bông Dùng một miếng gòn không thấm nước cuộn lại, nhét vào miệng ống nghiệm sao cho vừa đủ chặt. Yêu cầu: - Nút gòn có kích thước và độ chặt vừa phải - Đầu nút phải tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm - Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng. Cách làm nút gòn này cũng được áp dụng cho các chai lọ, bình cầu, bình tam giác… cách làm cũng tương tự như đối với ống nghiệm. Nhưng lượng gòn sử dụng phải nhiều hơn và có thể được bọc bằng một lớp vải gạc. 1.4 Cách bao gói dụng cụ Với các dụng cụ sau khi làm nút bông, cần được bao gói phần có nút bông bằng giấy dầu hay giấy báo để khi hấp khử trùng nút bông không bị ướt và đảm bảo điều kiện vô trùng tốt hơn. Cách làm như sau: - Cắt các mảnh giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói. - Quấn giấy quanh phần đầu của nút bông. - Gập ống giấy sát vào nút bông ở mặt trước và hai bên. - Gập nốt phần giấy còn lại và cài sâu vào bên trong. Yêu cầu: + Phần giấy bao ngoài phải chặt và kín. + Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt. + Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng Với các dụng cụ như pipet, đĩa pêtri, que gạt phải dùng giấy bao kín toàn bộ. Có thể thay giấy báo bằng 1 hộp nhôm kín đựng tất cả các dụng cụ trên để khử trùng. 2. Phương pháp khử trùng dụng cụ Có thể khử trùng bằng một số tác nhân lý hóa như nhiệt độ, bức xạ, lọc và hóa chất. Tác nhân khử trùng được chọn tùy mục đích và vật liệu cần khử trùng. - Các dụng cụ thủy tinh bền với nhiệt nên thường được khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô trong tủ sấy. Các thanh gạt thủy tinh được khử trùng bằng cách đốt với cồn 700C và các que cấy kim loại được khử trùng bằng cách đốt trực tiếp trên ngọn lửa. - Trường hợp cần khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật, phương pháp nhiệt ẩm bằng nồi hấp áp lực (autoclave, 1atm, 1210C) thường được sử dụng để các thành 4
phần hữu cơ của môi trường không bị cháy, biến tính và môi trường không bị mất nước - Trường hợp môi trường chứa các chất phân tử lượng nhỏ không bền với nhiệt như vitamin, amino acid, hoặc huyết thanh chứa các protein là nhân tố tăng trưởng, phương pháp nhiệt ẩm có thể làm biến tính các thành phần này nên thường được khử trùng riêng bằng phương pháp lọc qua màng. 2.1 Khử trùng dụng cụ, môi trường bằng nồi hấp áp lực Phương pháp này thực hiện trong nồi hấp vô trùng ở áp suất cao. Là thiết bị làm bằng kim loại, chịu được nhiệt độ và áp suất cao, có khả năng tự động điều chỉnh áp suất và thời gian khử trùng theo yêu cầu của người sử dụng. - Nguyên tắc hoạt động Làm gia tăng nhiệt độ bằng hơi nước bảo hòa dưới một áp suất lớn hơn áp suất bình thường của khí quyển. Khi áp suất hơi nước tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo nhờ hệ thống van rất chặt chẽ. Mối quan hệ giữa áp suất ghi trên áp kế với nhiệt độ trong nồi biểu hiện qua bảng sau đây: Áp suất (atm) Nhiệt độ (0C) 0 100 0,5 112 1,0 121 1,5 128 2,0 134 Phương pháp khử trùng bằng nhiệt ẩm cho phép diệt cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật. - Trình tự các bước sử dụng nồi hấp áp lực như sau + Bổ sung nước ở đáy nồi đến vạch quy định + Xếp dụng cụ và vật liệu cần khử trùng vào giá đặt bên trong nồi hấp, không nên xếp quá chặt để hơi nước lưu thông dễ dàng + Đậy kín nắp nồi hấp. Trường hợp nắp có nhiều ốc vặn, cần vặn ốc theo từng cặp đối xứng nhau. + Mở van thông hơi giữa 2 nồi (trường hợp nồi hấp 2 lớp) + Bật công tắc, đun nồi hấp. + Khi nhiệt độ lên đến 800C hoặc 0,5 atm, mở từ từ van xả để đuổi hết không khí ra khỏi nồi trong vòng 3 – 5 phút cho đến khi luồng hơi nước thoát ra liên tục, đóng van lại. 5
+ Khi áp suất lên đến mức cần thiết thì bắt đầu tính thời gian khử trùng. + Khi đủ thời gian khử trùng, tắt điện, chờ nhiệt độ và áp suất hạ xuống giá trị 0 mới được mờ nắp để tránh gây ra tai nạn hoặc tránh áp suất thay đổi đột ngột làm hư môi trường. Một số nồi hấp hiện đại có thể tự kiểm soát thời gian, áp suất và tự đuổi khí ra khỏi nồi, cho phép bỏ qua một số thao tác tương ứng ở phần trên. Chú ý: để đảm bảo an toàn và hiệu quả của việc hấp khử trùng, ngoài việc thận trọng thực hiện đúng qui trình đã chỉ dẫn, người làm thí nghiệm cần phải + Kiểm tra mực nước và bổ sung lượng nước cần thiết trước khi sử dụng. + Với nắp nồi có nhiều ốc vặn, cần phải xiết ốc theo từng cặp đối xứng để đảm bảo độ kín, tránh làm nắp nồi bị chênh hoặc hư vòng đệm cao su. + Tuyệt đối không mở nắp nồi khi kim chỉ nhiệt độ và áp suất chưa trở về 0. + Trực tiếp theo dõi quá trình hấp khử trùng cho đến khi kết thúc và ngắt điện. Các bình tam giác, chai lọ, ống nghiệm chứa môi trường trước khi được khử trùng bằng phương pháp nhiệt ẩm cần được đậy chặt nhưng đảm bảo cho phép không khí và hơi nước thông qua. Thông thường, các hộp petri hoặc nút bông còn được bao gói bằng giấy hoặc giấy nhôm để tránh nguy cơ bị nhiễm sau khi khử trùng. Sau khi hấp các hộp petri cần được sấy khô trước khi dùng. 2.2 Khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng phương pháp nhiệt khô Các hộp petri, ống hút thủy tinh bền với nhiệt có thể được khử trùng bằng phương pháp sấy ở 1700C trong 2 giờ trong tủ sấy. Trong trường hợp này, các ống hút cần được nhét nút bông không thấm nước ở đầu hút. Hộp petri, ống hút, các dụng cụ cần khử trùng khác được gói kín bằng giấy hoặc giấy nhôm trước khi sấy. IV. PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG 1. Khái niệm chung Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxi hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định pH của môi trường. 2. Các yêu cầu cơ bản của môi trường dinh dưỡng Bất kỳ một môi trường dinh dưỡng nào để nuôi cấy vi sinh vật cũng cần đạt được các yêu cầu cơ bản sau đây: - Có đủ chất dinh dưỡng cần thiết - Có độ pH thích hợp - Có độ nhớt nhất định 6
- Hoàn toàn vô khuẩn - Không chứa các yếu tố độc hại 3. Phương pháp làm môi trường 3.1 Nguyên tắc Khi điều chế môi trường, ta dựa trên các nguyên tắc sau đây: - Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loại vi sinh vật. - Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường. - Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. 3.2 Các bước làm môi trường dinh dưỡng a. Pha chế Cân, đong chính xác từng thành phần của môi trường và pha chế đúng theo trình tự đã hướng dẫn. + Với môi trường lỏng: các chất cân đong xong cho hòa tan vào nước + Với môi trường đặc: là môi trường lỏng có bổ sung thêm agar (1,5 – 2,5%). Cân hóa chất cho hòa tan vào nước, bổ sung lượng nước đủ theo công thức. Cho agar vào, đun sôi và khuấy đều cho đến khi agar vừa tan. b. Làm trong môi trường Môi trường nuôi cấy vi sinh vật – nhất là môi trường lỏng cần phải hoàn toàn trong để dễ quan sát sự phát triển của chúng. Có thể làm trong môi trường bằng những phương pháp sau: + Với môi trường lỏng: người ta lọc qua vải màn nhiều lớp, qua bông thấm nước hoặc qua giấy lọc. + Với môi trường đặc thường lọc qua vải màn 2 lớp hoặc giấy lọc trong điều kiện có phễu lọc nóng. c. Điều chỉnh pH của môi trường Độ pH của môi trường tùy theo đối tượng vi sinh vật nuôi cấy và tùy theo yêu cầu khảo cứu. Vì vậy khi làm môi trường cần điều chỉnh pH cho thích hợp. Muốn điều chỉnh pH của môi trường, người ta dùng HCl, NaOH 0,1N hoặc nồng độ 10%. Cũng có thể dùng các chất khác như H3PO4, H2PO4, H2SO4, KOH…. 7
Để kiểm tra pH của môi trường tốt nhất là dùng máy đo pH. Phương pháp này nhanh nhạy và độ chính xác cao. Trong phòng thí nghiệm, người ta thường dùng chỉ thị màu xanh bromotinol (ở pH = 7,3 chỉ thị màu xanh có màu lam lục. Ơ pH  6 có màu vàng, ở pH  7,6 có màu lam lục) hay giấy quỳ để đo pH. Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng độ chính xác không cao. d. Phân phối môi trường vào dụng cụ Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác. Nếu là môi trường đặc, cần phải đun cho agar vừa tan rồi mới phân phối vào dụng cụ. Khi phân phối môi trường vào các dụng cụ thì cần phải chú ý: + Đối với ống nghiệm: nếu dùng làm môi trường thạch nghiêng thì lượng môi trường cần được phân phối chiếm ¼ thể tích ống nghiệm. + Nếu dùng làm thạch đứng thì lượng môi trường là 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm. + Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm 1/2 - 2/3 thể tích của bình. + Các thao tác phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc. e. Khử trùng môi trường Tùy theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà chế độ và phương pháp khử trùng khác nhau như sau: + Phương pháp Pasteur + Phương pháp Tyndal. + Phương pháp lọc bằng dụng cụ lọc vô khuẩn. + Phương pháp hấp bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao f. Phương pháp làm môi trường đặc - Làm thạch nghiêng Sau khi khử trùng xong, ta lấy các ống nghiệm còn lỏng đặt nghiêng trên thước gỗ hoặc que thủy tinh sao cho thạch trong ống nghiêng tới 2/3 chiều dài của ống. Tuyệt đối không để thạch chạm vào nút bông. Để yên cho đến khi thạch đông đặc. Yêu cầu mặt thạch phải phẳng, nhẵn, không bị đứt (hình 3a) - Làm thạch đứng Cho các ống nghiệm với lượng môi trường đặc chiếm ½ đến 2/3 ống nghiệm. Thạch còn nóng ta để đứng ống thạch vào giá, để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc (hình 3b). 8
- Đổ thạch vào đĩa petri (hình 4) Trong toàn bộ qui trình đổ thạch vào đĩa petri đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng và gồm các thao tác sau: + Mở bao gói giấy các đĩa petri + Tay phải cầm dụng cụ chứa môi trường + Tay trái lấy nút bông ra và hơ miệng bình trên ngọn đèn cồn. + Nghiêng bình và rót nhẹ môi trường vào đĩa petri sau khi tay trái mở hé nắp trên của đĩa + Đậy nắp trên lại, xoay tròn đĩa petri để môi trường được phân phối đều trên mặt đĩa. + Để yên cho môi trường nguội và đông đặc. + Lật ngược hộp cho đáy lên trên. Chú ý: Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn. Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2 mm. Sau 1 – 2 ngày kiểm tra xem môi trường có nhiễm khuẩn không rồi mới sử dụng. Nhớ viết vào nhãn tên môi trường, ngày pha chế. Hình 1: Hình 2: Cách đổ thạch vào đĩa petri Cách đặt thạch nghiêng (a); Cách đặt thạch đứng (b) g. Bảo quản và kiểm tra môi trường Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ từ 0 – 50 C và không để môi trường bị khô. Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường người ta thường đặt chúng vào tủ ấm 370C, trong 48 – 72h. Sau lấy ra quan sát loại bỏ các môi 9
trường có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu. 3.3 Pha chế một số môi trường thông dụng a. Môi trường PGA (potato glucose agar): dùng nuôi cấy nấm mốc. - Khoai tây 200g. - Glucose 20 g. - Agar 20g. - Nước cất 1000ml. - pH 6,5 Cách pha chế: - Cân lượng cần thiết các thành phần môi trường đủ cho 1000 ml môi trường PGA - Khoai tây gọt sạch vỏ và rửa sạch, dùng dao cắt thành các lát, nấu sôi rồi lọc lấy nước chiết - Cho glucose vào dịch chiết khoai tây và làm tan hoàn toàn. Bổ sung lượng nước cho đủ theo công thức - Cho agar vào, đun sôi và khuấy đều cho đến khi agar tan hoàn toàn. - Dùng phễu thủy tinh, rót môi trường vào ống nghiệm để làm thạch nghiêng. Đậy ống nghiệm bằng nút bông. - Khử trùng 1 atm/15 phút. - Sau khi hấp vô trùng xong, lấy ra và để nghiêng một góc 20o. Để nguội cho môi trường đặc lại. b. Môi trường peptone lỏng: nuôi cấy vi khuẩn. - Cao thịt 5g - Peptone 10 g - Nước cất 1000 ml Cách pha chế: - Cân đúng các thành phần trên cho vào trong cốc chứa 1000ml nước cất. Đem đun nhẹ cho tan đều. - Dùng phễu thủy tinh rót vào mỗi ống nghiệm 5ml. - Đậy nút bông, gói giấy và hấp vô trùng 1 atm/15 phút. Nếu pha môi trường peptone đặc thì bổ sung thêm 20 gam agar/1 lít. c. Môi trường PCA (Plate Count Agar). 10
- Cân chính xác 23,5 g môi trường bột tổng hợp khô cho vào cốc chứa khoảng 600 ml nước cất, đun cho tan môi trường trên bếp điện. - Khi môi trường đã tan đều bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000 ml. - Phân vào 9 bình tam giác mỗi bình khoảng 60 – 80 ml môi trường. - Tất cả đều làm nút bông, gói giấy và hấp vô trùng 121oC/15 phút. d. Môi trường Gause: dùng để nuôi cấy xạ khuẩn - Tinh bột tan 20,0 g - K2HPO4 0,5 g - MgSO4.7H2O 0,5g - KNO3 1g - NaCl 0,5 g - FeSO4 0,1g - Thạch 20 g - Nước 1000 ml - pH 7,2 - 7,4 e. Môi trường Hansen: dùng để nuôi cấy nấm men - Glucose 50g - Peptone 10 g - KH2PO4 3g - MgSO4 3g - Agar 20 g - Nước cất 1000 ml - pH 6 V. THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ - Thực hành bao gói và khử trùng các loại dụng cụ: ống nghiệm, ống hút, que gạt, đĩa petri, bình tam giác... - Thực hành pha môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật. Câu hỏi: 1. Trình bày mục đích và nguyên tắc cơ bản của việc bao gói dụng cụ? 2. Trình bày nguyên tắc hoạt động và các bước sử dụng nồi hấp vô trùng? 3. Trình bày những nguyên tắc và yêu cầu cơ bản của việc pha chế môi trường dinh dưỡng? 4. Trình bày các bước chế môi trường dinh dưỡng mà nhóm được phân công? 11
BÀI 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU - Nắm vững nguyên tắc và mục đích của việc phân lập vi sinh vật - Thực hiện được các bước phân lập và làm thuần các chủng vi sinh vật II. VẬT LIỆU - Cỏ khô ngâm trong nước 2 – 3 ngày; bánh men cơm rượu; nước trái cây (thơm, nho…) để 2 ngày; cơm nguội để 4 - 5 ngày. - Môi trường thạch đĩa (Hansen, PGA, peptone, Gause/Czapek – dox), thạch nghiêng (PGA) để phân lập - Đèn cồn, gòn thấm, giấy vệ sinh - Que gạt vô trùng, que cấy vòng, que cấy móc - Các ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng - Các bình tam giác chứa 99ml nước cất vô trùng - Nhãn dán (hoặc bút ghi ống nghiệm) - Pipet 1ml vô trùng - Giá để ống nghiệm III. KHÁI NIỆM Trong thiên nhiên, hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, sinh hóa hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết. Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ 1 tế bào ban đầu. IV. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT Nguyên tắc: tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc mọc riêng rẽ, cách biệt nhau. Với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu. Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau: - Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ một quần thể vi sinh vật trong thiên nhiên như đất, nước, không khí, những mẫu vật và sản phẩm khác… 12
- Phân lập vi sinh vật thuần khiết - Kiểm tra độ thuần khiết. 1. Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ (từ quần thể vi sinh vật) trên các môi trường phân lập Bước đầu là làm sao cho chúng mọc tách rời nhau. Để đạt được mục đích này người ta phải pha loãng mẫu cần phân lập. Nếu mẫu ở trạng thái đặc phải đưa về dạng lỏng bằng cách: + Nghiền mẫu + Hòa tan mẫu trong nước cất vô trùng Sau đó thực hiện như mẫu ở dạng lỏng. + Tiếp tục pha loãng ở nồng độ cần thiết. + Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó Mỗi loài vi sinh vật có tính đặc trưng trên môi trường dinh dưỡng. Lợi dụng tính chất này người ta tạo ra môi trường mà ở đó chỉ phát triển bình thường một nhóm vi sinh vật nhất định. Các vi sinh vật khác hoặc bị kiềm hãm phát triển hoàn toàn hoặc từng phần. Ví dụ: cần phân lập nấm mốc hoặc xạ khuẩn thì phân lập trên môi trường có thêm chất kháng sinh để ức chế vi khuẩn. 2. Phân lập vi sinh vật trên môi trường đặc ở đĩa petri a. Đối với vi sinh vật hiếu khí - Trãi mẫu bằng phương pháp gạt: + Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường thích hợp. + Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trãi đều khắp mặt thạch. + Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa petri thứ 2 rồi đĩa thứ 3. + Đặt các đĩa petri 1, 2, 3 trên vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp. Sau 1 thời gian nhất định, tùy giống vi sinh vật ta sẽ nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa thứ 2 và 3. - Trãi mẫu bằng phương pháp ria: + Khử trùng que cấy vòng, để nguội + Lấy một ít dịch tế bào ria các đường trên hộp petri như hình vẽ + Sau mỗi đường ria, đốt que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo 13
+ Gói đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ thích hợp. Sau 1 thời gian nhất định, tùy giống vi sinh vật ta sẽ nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đường ria. Hình 3: Phân lập bằng kỹ thuật ria b. Đối với vi sinh vật kỵ khí. + Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thủy để loại bỏ không khí trong môi trường. + Để nguội môi trường còn 45 – 500C. + Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc đều. + Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy thật nhanh nắp lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí. + Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp. + Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường, dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp. 3. Kiểm tra độ thuần khiết của giống phân lập Độ thuần khiết của các giống đã phân lập sẽ được kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần của khuẩn lạc. a. Kiểm tra vết cấy Quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật qua vết cấy trên môi trường đặc. 14
+ Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập đã tinh khiết thì giữ lại. + Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ b. Kiểm tra lại độ thuần chủng của các khuẩn lạc + Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng. + Tách các khuẩn lạc này ra và hòa tan, pha loãng ở nồng độ cần thiết trong nước cất vô trùng. + Nhỏ một giọt dịch trên vào đĩa petri có môi trường. + Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa petri thứ nhất, rồi đĩa thứ 2, thứ 3. + Đặt các đĩa petri vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy loại vi sinh vật. + Sau đó lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ. Sự thuần khiết của khuẩn lạc là biểu hiện sự thuần khiết của giống. Ngoài ra, độ thuần khiết của các giống phân lập có thể được kiểm tra bằng kính hiển vi, được tiến hành như sau: chuẩn bị các tiêu bản cố định nhuộm màu tế bào hoặc các tiêu bản tế bào sống để kiểm tra. Các giống thuần khiết của nhiều loại vi khuẩn Pseudomonas, Bacterium, Bacillus…. Thường đồng nhất về hình thái, chỉ khác nhau ít nhiều về kích thước giữa các tế bào. Tế bào của nhiều vi sinh vật khác như Mycobacterium, Nocardia, Corynebacterium rất đa dạng vì vậy rất khó xác định độ tuần khiết của chúng khi soi kính hiển vi. V. PHÂN LẬP MỘT SỐ GIỐNG VI SINH VẬT 1. Phân lập nấm men - Nguồn phân lập + Men bánh mì: men cái bánh mì (dạng paste hoặc bột) hòa tan trong nước cất vô trùng, sau đó pha loãng vài lần trước khi sử dụng. + Men rượu hoặc men cơm rượu: bánh men bẻ đôi, cạo lấy phần bột ở giữa, hòa trong nước cất vô trùng, pha loãng vài lần trước khi sử dụng. + Men trái cây: cho vào ống nghiệm sạch một ít nước mía hoặc trái cây tươi (thơm, nho…), dầm lấy nước. Bọc miệng ống nghiệm bằng giấy. Để ở nhiệt độ phòng 24 giờ, khi dịch trong ống nghiệm bắt đầu sủi bọt, pha loãng vài lần trước khi sử dụng. - Môi trường phân lập: Hansen. - Tiến hành phân lập + Trãi mẫu bằng phương pháp ria: 15
Chuẩn bị nguồn phân lập như phần trên. Dùng que cấy vòng lấy một ít dịch tế bào nấm men (tương đương một vòng đầu que cấy). Dàn đều một cạnh petri. Đốt đầu que cấy để khử trùng và bắt đầu kéo thành những đường zic-zắc khởi đầu từ cạnh có dàn tế bào nấm men. Tuần tự tiến hành ở 3 vùng kế tiếp. Gói hộp petri, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. + Trãi mẫu bằng que gạt : Cho lên mặt thạch petri 0,1 ml dịch tế bào nấm men. Dùng que gạt đã nhúng cồn khử trùng để dàn dịch tế bào nấm men cho đều khắp bề mặt thạch (có thể gạt tiếp trên đĩa thứ 2 và 3) Gói petri, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. - Làm thuần Sau hai ngày ủ ở nhiệt độ phòng, quan sát các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường Hansen. Chọn khuẩn lạc có đặc tính điển hình của nấm men (khuẩn lạc to, màu đục sữa, khô, gồ cao…) Dùng qua cấy vòng tách khuẩn lạc nói trên sang petri chứa môi trường Hansen khác (nếu đường cấy trên petri đầu tiên nhiễm nhiều) hoặc ria trên ống thạch nghiêng (nếu khuẩn lạc rời và ít nhiễm) Tiếp tục cấy nhiều lần cho đến khi các khuẩn lạc đồng nhất. Giống được xem là thuần khi tất cả các khuẩn lạc hiện diện trên môi trường đều có chung đặc tính về hình thái. Quan sát dưới kính hiển vi không có tế bào lạ. 2. Phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Mucor - Nguồn phân lập: có thể phân lập nấm mốc này trên cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khô vài ngày. - Môi trường phân lập: PGA - Tiến hành phân lập: Dùng que cấy móc (đã khử trùng), gạt nhẹ lên hệ sợi tơ hoặc trên bào tử đính (dạng bụi phấn), chuyển sang ống nghiệm thạch nghiêng. Đánh ngược phần lưng móc lên thành bên trong của ống nghiệm cho bào tử rơi xuống hay cắm đầu móc xuống mặt thạch thành ba điểm theo chiều dọc mặt thạch. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. Sau hai ngày, lấy ra quan sát. Nếu trên mặt thạch chỉ có một loại tơ hoặc bào tử nấm mốc phân lập là dạt. Còn nếu lẫn nấm mốc khác hoặc vi khuẩn, thì cần tiếp tục cấy chuyền cho đến khi thuần khiết (chỉ còn loại nấm mốc mong muốn). Thông qua màu sắc của mốc để nhận diện. + Mốc có màu trắng: có thể là Mucor hay Rhizopus 16