Kết quả tinh chế, đánh giá tính an toàn và hiệu quả huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) trên thực nghiệm

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015<br /> <br /> KẾT QUẢ TINH CHẾ, ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ<br /> HIỆU QUẢ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO<br /> (NAJA SIAMENSIS) TRÊN THỰC NGHIỆM<br /> Lê Khắc Quyến*; Trịnh Xuân Kiếm**<br /> Hoàng Anh Tuấn***; Thái Danh Tuyên****<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: nghiên cứu xây dựng quy trình tinh chế huyết thanh kháng nọc (HTKN) rắn Hổ mèo<br /> (RHM) (Naja siamensis antivenom); đánh giá tính an toàn và hiệu lực của thuốc trong phòng thí<br /> nghiệm và trên thực nghiệm. Phương pháp: huyết tương ngựa đã có kháng thể đặc hiệu với<br /> nọc RHM hiệu giá cao thu được sau gây miễn dịch, tinh chế thành HTKN RHM F(ab’)2 bằng<br /> phương pháp sử dụng men pepsin và tủa bằng muối ammonium sulfate theo hướng dẫn của<br /> Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Đánh giá HTKN RHM về tính an toàn, hiệu lực theo đơn vị (LD50<br /> và ED50), chất gây sốt trên động vật thực nghiệm và đặc tính vô khuẩn trong phòng thí nghiệm<br /> theo Tiêu chuẩn Kiểm định Quốc gia. Kết quả: thiết lập được quy trình tinh chế HTKN RHM<br /> F(ab’)2 và tinh chế thành công 157 lọ HTKN RHM dưới dạng dung dịch và đông khô. Thử nghiệm<br /> đánh giá trong phòng thí nghiệm (in vitro) và trên động vật thực nghiệm (in vivo) cho thấy HTKN<br /> RHM có tính an toàn cao, hiệu lực mạnh, vô khuẩn và không có chất gây sốt. Kết luận: HTKN<br /> RHM được tinh chế thành công và đánh giá đạt tiêu chuẩn quốc gia. Thành công của nghiên<br /> cứu mở ra một hướng điều trị đặc hiệu cho BN bị nhiễm độc nọc RHM trong tương lai.<br /> * Từ khoá: Rắn Hổ mèo; Huyết thanh kháng nọc; An toàn; Hiệu lực.<br /> <br /> Result of Purification, Assessment of Safety and Effective Tests<br /> of Naja Siamensis Antivenom In Vitro and In Vivo<br /> Summary<br /> Objectives: The study established the purification of F(ab’)2 Naja siamensis (NS) antivenom<br /> and gave an assessment of safety and potency tests of this antivenom in vitro and in vivo. Methods:<br /> Horse hyper-immune plasma against NS venom was collected after immunization, purified into NS<br /> antivenom F(ab’)2 by using pepsin digestion and ammonium sulfate precipitation based on World<br /> Health Organization (WHO) guidelines. An assessment of NS antivenom for safety, potency based<br /> on units of median lethal dose (LD50) and median effective dose (ED50), pyrogens tests in vivo and<br /> sterility test in vitro under quality control of the National Standard. Results:<br /> * Bệnh viện FV<br /> ** Viện Nghiên cứu Công nghệ Phát triển Nông thôn<br /> *** Học viện Quân y<br /> **** Bệnh viện Quân y 103<br /> Người phản hồi (Corresponding): Lê Khắc Quyến (lekhacquyen@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/05/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/09/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 30/11/2015<br /> <br /> 45<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015<br /> Established a protocol for purification of F(ab’)2 Naja siamensis antivenom and made successfully<br /> 157 liquid and lyophilized vials of NS antivenom. An assessment of this antivenom in vitro and<br /> in vivo showed high safety, strong efficacy, sterility and no pyrogens. Conclusion: Naja siamensis<br /> antivenom was made successfully and met National standard. The success of this study open<br /> the trend of antidote treatment for NS envenomed patients in future.<br /> * Key words: Naja siamensis; Antivenom; Safety; Efficacy.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Năm 2009, WHO xếp rắn độc cắn vào<br /> bệnh lý nhiệt đới bị lãng quên và tái<br /> khẳng định HTKN rắn độc là biện pháp<br /> điều trị đặc hiệu duy nhất cho nhiễm độc<br /> nọc rắn [9,10]. Việc không có sẵn các<br /> HTKN đặc hiệu để điều trị nhiễm độc do<br /> các loài rắn ở các khu vực trên thế giới<br /> trở thành một vấn đề y tế cấp thiết mức<br /> độ toàn cầu [10]. Từ năm 1894, lần đầu<br /> tiên trên thế giới Calmette đã nghiên cứu<br /> sản xuất thành công HTKN rắn Hổ tại<br /> Viện Pasteur Sài Gòn [4]. Từ đây, điều trị<br /> rắn độc cắn đã bước sang trang mới<br /> bằng thuốc đặc trị HTKN [8]. Ở Việt Nam,<br /> nhóm nghiên cứu do Trịnh Kim Ảnh, Trịnh<br /> Xuân Kiếm và CS đã thành công trong<br /> việc nghiên cứu sản xuất HTKN rắn Hổ<br /> đất từ năm 1990 tại Bệnh viện Chợ Rẫy<br /> [3]. Tiếp theo, HTKN rắn Choàm quạp,<br /> Hổ chúa, rắn Lục và rắn Cạp nia lần lượt<br /> được sản xuất, giúp giảm tỷ lệ tử vong<br /> cho bệnh nhân (BN) bị rắn độc cắn vào<br /> điều trị tại Bệnh viện Chợ Rẫy từ 20%<br /> xuống còn 2,7% [7]. Tuy nhiên, nhiễm nọc<br /> độc do RHM (Naja siamensis) cắn chiếm<br /> tỷ lệ 10% vẫn là một khó khăn rất lớn cho<br /> bác sỹ lâm sàng trong điều trị, vì thiếu<br /> HTKN đặc hiệu. Vì vậy, sản xuất HTKN<br /> RHM là một nhu cầu cấp thiết từ thực tiễn<br /> lâm sàng hiện nay. Mục tiêu của nghiên<br /> cứu: Xây dựng quy trình sản xuất HTKN<br /> RHM tại Việt Nam, đánh giá về tính an toàn<br /> 46<br /> <br /> và hiệu lực trung hòa nọc độc in vitro và<br /> in vivo trên động vật thực nghiệm theo<br /> tiêu chuẩn Quốc gia cũng như hướng dẫn<br /> của WHO, góp phần giải quyết vấn đề<br /> thiếu HTKN RHM trong điều trị BN bị loài<br /> rắn độc này cắn ở nước ta hiện nay.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> - Huyết tương ngựa đã có kháng thể<br /> đặc hiệu đơn giá kháng nọc RHM hiệu giá<br /> cao được tạo ra trong nghiên cứu trước<br /> của chúng tôi [2]. Thu nhận huyết tương<br /> trong điều vô khuẩn, chống đông bằng<br /> heparin, được ly tâm tách khối hồng cầu<br /> ngay sau khi lấy máu từ 24 - 48 giờ, bảo<br /> quản ở nhiệt độ 2 - 4°C liên tục cho đến<br /> khi sử dụng.<br /> - HTKN RHM sau tinh chế, lấy ngẫu<br /> nhiên 30 mẫu.<br /> - Nọc RHM do Công ty Cổ phần Y học<br /> công nghệ KLT cung cấp.<br /> - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (Saboraud,<br /> Thioglycolate) và vi nấm do Bệnh viện<br /> Chợ Rẫy cung cấp.<br /> - Chuột nhắt trắng cân nặng từ 18 20 g/con (120 con), chuột lang cân nặng<br /> 200 - 250 g/con (3 con) và thỏ cân nặng<br /> 1,75 - 2,0 kg/con (3 con) do Ban Cung<br /> cấp Động vật thí nghiệm, Học viện Quân y<br /> cung cấp.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015<br /> <br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Loại hình nghiên cứu:<br /> Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và<br /> thực nghiệm trên động vật.<br /> * Nội dung nghiên cứu:<br /> - Xác lập quy trình tinh chế HTKN RHM<br /> dạng F(ab’)2.<br /> - Đánh giá HTKN RHM về hiệu lực<br /> theo đơn vị (LD50 và ED50) và tính an toàn<br /> (chất gây sốt trên động vật thực nghiệm,<br /> tính vô khuẩn).<br /> * Phương pháp tiến hành:<br /> - Tinh chế HTKN RHM F(ab’)2 theo<br /> hướng dẫn của WHO (2010) bằng phương<br /> pháp sử dụng enzym pepsin và kết tủa<br /> bằng muối ammonium sulfate [9].<br /> - Đánh giá tại cơ sở theo tiêu chuẩn<br /> Dược điển Việt Nam IV (2009) [1] và theo<br /> hướng dẫn của WHO (2010) [9].<br /> - Tính LD50: theo công thức SpearmanKarber [1].<br /> - Tính ED50:<br /> + Pha HTKN RHM tăng dần từ 10 μl/ml<br /> đến 60 μl/ml.<br /> + Dung dịch nọc RHM pha trong dung<br /> dịch nước muối đẳng trương 0,9%<br /> (10 mg% = 100 µg/ml), trộn đều với từng<br /> độ pha loãng HTKN, cùng thể tích. Ủ hỗn<br /> dịch trên ở 37°C trong 1 giờ.<br /> + Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột (dung dịch<br /> nọc + HTKN), V = 0,5 ml/chuột.<br /> + Số chuột thí nghiệm 8 con/lô x 4 lô.<br /> + Theo dõi trong 24 giờ, ghi nhận số<br /> chuột chết/sống, tính tỷ lệ (%).<br /> - Tìm chất gây sốt: 03 thỏ khoẻ mạnh,<br /> cân nặng 1,75 - 2,0 kg, nuôi trong 1 tuần.<br /> <br /> Ngày thí nghiệm, tiêm HTKN RHM là<br /> thành phẩm nghiên cứu vào tĩnh mạch rìa<br /> tai thỏ với thể tích V = 3 ml/kg cân nặng.<br /> Đo nhiệt độ hậu môn thỏ trước và sau khi<br /> tiêm HTKN, thời gian cách nhau 1 giờ.<br /> Quy định: chênh lệch nhiệt độ cao nhất và<br /> thấp nhất < 1°C. Nếu nhiệt độ tăng > 1°C,<br /> chắc chắn do chất gây sốt gây ra.<br /> - Vô trùng: cấy HTKN phát hiện vi khuẩn<br /> trên môi trường Saboraud, Thioglycolate<br /> và nấm tại Phòng Thí nghiệm, Khoa Vi sinh,<br /> Bệnh viện Chợ Rẫy.<br /> - Tính an toàn: 03 chuột lang khoẻ,<br /> cân nặng từ 200 - 250 g. Nuôi 1 tuần<br /> trước khi thí nghiệm. Tiêm HTKN RHM<br /> vào phúc mạc chuột, V = 2 ml/100 g x cân<br /> nặng chuột. Theo dõi chuột trong 3 tuần<br /> về cân nặng và rụng lông. Chuột vẫn phát<br /> triển bình thường và tăng cân là HTKN an<br /> toàn trên động vật thí nghiệm.<br /> * Dụng cụ và trang thiết bị:<br /> - Thiết bị chuyên dùng tinh chế HTKN:<br /> buồng lạnh vô trùng, bồn nước thay đổi<br /> nhiệt độ, pH meter, bồn inox vô trùng chứa<br /> huyết tương ngựa, phễu lọc, giấy lọc,<br /> màng lọc cellulose acetate, tủ sấy hấp<br /> dụng cụ, máy hút, bình lọc, dụng cụ sát<br /> trùng, đèn cồn, hệ thống đông khô lạnh<br /> (Christ ly°Chameer Guard), lọ đựng HTKN<br /> thành phẩm, nút cao su vô trùng.<br /> - Thiết bị, dụng cụ, động vật thí nghiệm<br /> dùng để đánh giá chất lượng HTKN RHM.<br /> - Hoá chất chuyên dụng: pepsin (Merck),<br /> ammonium sulfat (Merck), axít sulfuric,<br /> axít chlorhydric, NaOH, toluen, nước cất<br /> vô trùng.<br /> 47<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015<br /> <br /> * Thời gian và địa điểm:<br /> <br /> - Tủa thành phần không phải kháng<br /> thể bằng ammonium sulfate: cho từ từ<br /> 1.400 g ammonium sulfate vào 10 lít huyết<br /> tương. Hòa tan bằng que khuấy thủy tinh,<br /> đảm bảo vô khuẩn tốt.<br /> <br /> - Thời gian: từ tháng 07 - 2012 đến<br /> 10 - 2013.<br /> - Địa điểm tiến hành:<br /> + Bộ môn Khoa Huyết Học - Truyền máu,<br /> Bệnh viện Quân y 103.<br /> <br /> - Khử bổ thể bằng nhiệt ở 56°C/60 phút.<br /> - Lọc huyết tương, thu dịch lọc có kháng<br /> thể đặc hiệu, loại bỏ cặn thu được 8 lít.<br /> <br /> + Phòng Protein - Độc chất - Tế bào,<br /> Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân<br /> sự, Học viện Quân y.<br /> <br /> - Tủa kháng thể bằng thêm ammonium<br /> sulfate tới 36% bão hòa: thêm ammonium<br /> sulfate trong dịch lọc, ủ ở 20°C, pH 6,8/60<br /> phút. Lọc dịch, thu tủa được 600 g.<br /> <br /> + Bộ môn Độc học và Phóng xạ Quân<br /> sự, Học viện Quân y.<br /> + Khoa Vi sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy.<br /> <br /> - Thẩm tích bằng màng cellulose acetate<br /> để loại bỏ ammonium sulfate. Thu hồi dịch<br /> thẩm tích được 798 ml.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Xác lập quy trình tinh chế HTKN<br /> RHM F ab’ 2.<br /> <br /> - Lọc vô trùng bằng màng cellulose<br /> acetate, Φ = 0,2 µm. Thu được 785 ml<br /> HTKN RHM F(ab’) 2. Đóng lọ vô trùng:<br /> 157 lọ, bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8°C.<br /> <br /> - Cắt Fc của phân tử kháng thể IgG<br /> trong huyết tương ngựa bằng enzym<br /> pepsin: 10 lít huyết tương ngựa có hiệu<br /> giá kháng thể đặc hiệu cao với nọc RHM,<br /> trộn đều cùng 100 g pepsin, duy trì pH<br /> huyết tương bằng 3,2 ở nhiệt độ 20°C/60<br /> phút, đảm bảo vô khuẩn.<br /> <br /> - Đông khô HTKN RHM: đặt 100 lọ<br /> dung dịch HTKN thành phẩm vào hệ thống<br /> đông khô lạnh Chris, trong 53 giờ. Thu<br /> được 92 lọ HTKN RHM dạng đông khô,<br /> 08 lọ bị mất dịch, tỷ lệ hao hụt 8/100 = 8%.<br /> <br /> 2. Hiệu lực (potency) của HTKN RHM.<br /> * Liều chết 50% (Lethal dose-LD50) của nọc RHM Việt Nam:<br /> Bảng 1: Xác định LD50 của nọc RHM Việt Nam.<br /> STT<br /> lô<br /> <br /> Nồng độ<br /> nọc μg/ml<br /> <br /> Số lƣợng<br /> nọc/chuột (µg)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 2<br /> <br /> 48<br /> <br /> Theo dõi chuột thí nghiệm<br /> <br /> Tỷ lệ chuột<br /> chết (%)<br /> <br /> Sống<br /> <br /> Chết<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0<br /> <br /> 60<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0<br /> <br /> 3<br /> <br /> 70<br /> <br /> 7<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 80<br /> <br /> 8<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0<br /> <br /> 5<br /> <br /> 90<br /> <br /> 9<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0<br /> <br /> 6<br /> <br /> 100<br /> <br /> 10<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1<br /> <br /> 4<br /> <br /> 25<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015<br /> 7<br /> <br /> 110<br /> <br /> 11<br /> <br /> 2<br /> <br /> 2<br /> <br /> 4<br /> <br /> 50<br /> <br /> 8<br /> <br /> 120<br /> <br /> 12<br /> <br /> 2<br /> <br /> 2<br /> <br /> 4<br /> <br /> 50<br /> <br /> 9<br /> <br /> 130<br /> <br /> 13<br /> <br /> 2<br /> <br /> 2<br /> <br /> 4<br /> <br /> 50<br /> <br /> 10<br /> <br /> 140<br /> <br /> 14<br /> <br /> 1<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 75<br /> <br /> 11<br /> <br /> 150<br /> <br /> 15<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 4<br /> <br /> 100<br /> <br /> 12<br /> <br /> 160<br /> <br /> 16<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 4<br /> <br /> 100<br /> <br /> 13<br /> <br /> 250<br /> <br /> 25<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 4<br /> <br /> 100<br /> <br /> 14<br /> <br /> 500<br /> <br /> 50<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 4<br /> <br /> 100<br /> <br /> Số chuột thí nghiệm/lô = 4 con. Thể tích dịch nọc tiêm chuột = 0,5 ml.<br /> Tính toán kết quả từ bảng 1 cho giá trị LD50 của nọc RHM Việt Nam = 12 µg/chuột (20 g).<br /> * Hiệu lực (Effective dose-ED50) của HTKN RHM:<br /> Bảng 2: Xác định ED50 của HTKN RHM.<br /> HTKN RHM<br /> (ml)<br /> <br /> Dung dịch NaCl<br /> Nọc RHM<br /> 0,9% (ml)<br /> (8,33 LD50) (ml)<br /> <br /> Theo dõi chuột thí nghiệm<br /> <br /> Số LD50/<br /> chuột<br /> <br /> Chết<br /> <br /> Sống<br /> <br /> Tổng số<br /> <br /> 0,05<br /> <br /> 3,75<br /> <br /> 1,20<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 8<br /> <br /> 8<br /> <br /> 0,03<br /> <br /> 3,77<br /> <br /> 1,20<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 8<br /> <br /> 8<br /> <br /> 0,01<br /> <br /> 3,79<br /> <br /> 1,20<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 8<br /> <br /> 8<br /> <br /> 0,00<br /> <br /> 3,80<br /> <br /> 1,20<br /> <br /> 1<br /> <br /> 4<br /> <br /> 4<br /> <br /> 8<br /> <br /> ED50 = 100 LD50 /ml = 1.200 µg/ml = 500 LD50/lọ = 6.000 µg/lọ.<br /> Kết quả:<br /> - 01 ml HTKN RHM có khả năng trung hòa 100 LD50 = 1.200 µg nọc RHM.<br /> - 01 lọ HTKN RHM (5 ml) sẽ trung hòa được 500 LD50 = 6.000 µg nọc RHM.<br /> 3. Độ an toàn của HTKN RHM.<br /> * Kiểm tra chất gây sốt (pyrogen test):<br /> Bảng 3: Xác định HTKN RHM không có chất gây sốt.<br /> Thứ tự Cân nặng Thể tích tiêm<br /> thỏ<br /> (kg)<br /> HTKN (ml)<br /> <br /> o<br /> <br /> Nhiệt độ thỏ trƣớc/sau khi tiêm HTKN RHM ( C)<br /> Trước<br /> <br /> Sau 1 giờ<br /> <br /> Sau 2 giờ<br /> <br /> Sau 3 giờ<br /> <br /> Nhiệt độ<br /> chênh lệch<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1,75<br /> <br /> 5,25<br /> <br /> 39,0°C<br /> <br /> 38,8°C<br /> <br /> 39,5°C<br /> <br /> 39,5°C<br /> <br /> + 0,5°C<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1,80<br /> <br /> 5,40<br /> <br /> 39,9°C<br /> <br /> 39,5°C<br /> <br /> 39,4°C<br /> <br /> 39,4°C<br /> <br /> - 0,5°C<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1,90<br /> <br /> 5,70<br /> <br /> 39,3°C<br /> <br /> 39,2°C<br /> <br /> 39,2°C<br /> <br /> 39,45°C<br /> <br /> + 0,15°C<br /> <br /> Trong 3 giờ liên tiếp, nhiệt độ thay đổi của thỏ sau tiêm HTKN RHM < 1°C.<br /> Kết quả cho thấy HTKN RHM không có chất gây sốt.<br /> 49<br /> <br />