Khả năng gây độc tế bào ung thư của các cặn chết từ lá cây ngái (ficus hispida l.). Phân lập và nhận biết axit betulinic từ cặn chết etylaxetat

T¹p chÝ Hãa häc, T. 43 (3), Tr. 312 - 316, 2005<br /> <br /> <br /> kh¶ n¨ng g©y ®éc tÕ bµo ung th cña c¸c cÆn chiÕt tõ<br /> l¸ c©y ng¸i (ficus hispida l.). ph©n lËp vµ nhËn biÕt<br /> axit betulinic tõ cÆn chiÕt etylaxetat<br /> §Õn Tßa so¹n 13-7-2004<br /> V¨n Ngäc H íng, Vò Minh Trang<br /> Khoa Hãa häc, Tr!êng §¹i häc Khoa häc tù nhiªn, §HQG H* Néi<br /> <br /> <br /> summary<br /> The total alkaloid and non-alkaloid fractions were extracted from the leave of Ficus hispida<br /> L., colleted in Nghe An province. Its cytotoxicity in vitro against three cancer cell lines has been<br /> investigated. The cytotocic activities of total alkaloids against these cancer cell lines are very<br /> strong than that of non-alkaloid fraction. From non-alkaloid part, betulinic acid was isolated and<br /> its structure was elucidated by spectroscopic methods.<br /> <br /> <br /> I - Më ®Çu cÆn chiÕt ancaloit v phi ancaloit tõ l¸ c©y ng¸i,<br /> còng nh. viÖc ph©n lËp v x¸c ®Þnh cÊu tróc cña<br /> C©y ng¸i (Ficus hispida L.) l c©y bôi rËm, axit betulinic tõ cÆn chiÕt phi ancaloit.<br /> mäc phæ biÕn ë c¸c tØnh miÒn trung v b¾c ViÖt<br /> Nam. Nã l c©y thuèc d©n téc, ®.îc dïng phæ II - Thùc nghiÖm<br /> biÕn trong c¸c b i thuèc gia truyÒn chèng ung<br /> th. cña c¸c d©n téc miÒn t©y NghÖ An [1]. Nã 1. C¸c thiÕt bÞ v hãa chÊt ®· dïng<br /> còng l c©y ®ang ®.îc c¸c nh khoa häc thÕ giíi Phæ IR ghi trªn m¸y AVTAR 360 theo<br /> quan t©m, gÇn ®©y ng.êi ta ph¸t hiÖn trong l¸ ph.¬ng ph¸p truyÒn qua KBr. Phæ EI-MS ghi<br /> c©y ng¸i cã nhiÒu chÊt cã ho¹t tÝnh chèng ung trªn m¸y Hewlett Packard 5998B Engine víi n¨ng<br /> th. phæi (Lu.1), ung th. mòi hÇu (KB), ung th. l.îng b¾n ph¸ 70 eV. Phæ 1H&13C-NMR ghi trªn<br /> tiÒn liÖt tuyÕn (LNCaP) v ung th. ruét gi m¸y Bruker Avance 500, ®é chuyÓn dÞch hãa<br /> (Col.2) [2]. häc tÝnh theo ppm, h»ng sè t.¬ng t¸c spin-spin<br /> Ngo i t¸c dông ch÷a ung th., nh©n d©n ta tÝnh theo Hz, chuÈn néi TMS v dung m«i<br /> cßn sö dông c©y ng¸i ®Ó ch÷a c¶m cóm, viªm CDCl3. B¶n s¾c ký líp máng l b¶n nh«m tr¸ng<br /> phÕ qu¶n, c¸c bÖnh vÒ tiªu hãa [3]. ë Ên §é s½n 60F254 cña MERCK. C¸c hãa chÊt dïng l<br /> ng.êi ta dïng c©y ng¸i ®Ó ch÷a c¸c bÖnh vÒ tiªu lo¹i P cña Trung Quèc hay MERCK. Silica gel<br /> ch¶y, d¹ d y, chèng viªm... [4]. Râ r ng ng¸i l cét cì h¹t 40 - 63 µm.<br /> mét c©y thuèc d©n téc quý gi¸, ®¸ng ®.îc quan 2. MÉu thùc vËt<br /> t©m.<br /> L¸ c©y ng¸i (Ficus hispida L.) thu h¸i t¹i<br /> Trong c«ng tr×nh n y chóng t«i b.íc ®Çu NghÖ An v o th¸ng 11 n¨m 2003, ®.îc GS,<br /> th«ng b¸o c¸c kÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh g©y ®éc in TSKH NguyÔn NghÜa Th×n, gi¸m ®èc b¶o t ng<br /> vitro ®èi víi 3 dßng tÕ b o ung th.: Ung th. gan thùc vËt tr.êng §¹i häc KHTN gi¸m ®Þnh v<br /> ng.êi (Hep G2), ung th. m ng tö cung ng.êi cung cÊp. MÉu sau khi ®.îc röa s¹ch, lo¹i bá<br /> (FI) v ung th. m ng tim ng.êi (RD) cña c¸c c¸c l¸ qu¶ gi , h. háng, thèi r÷a, sÊy ë 45 - 50oC<br /> 312<br /> råi nghiÒn th nh bét v b¶o qu¶n trong lä cã b»ng phÔu butne v trung ho b»ng NH4OH ®Æc<br /> m u, n¬i kh« r¸o. ®Õn pH = 10, chiÕt 3 lÇn b»ng CHCl3, mçi lÇn 60<br /> 3. ChiÕt c¸c ho¹t chÊt trong l¸ c©y ng¸i ml. Gép dÞch chiÕt CHCl3, l m kh« b»ng Na2SO4<br /> khan, cÊt lo¹i dung m«i, thu ®.îc 2,125 g cÆn<br /> a) ChiÕt c¸c ancaloit tæng ancaloit. Còng tiÕn h nh nh. trªn nh.ng<br /> Ng©m 250 g bét l¸ c©y ng¸i víi 500 ml dung víi axit axetic 3%, axit citric v H2SO4 3%. KÕt<br /> dÞch axit tactric 3% trong 72 giê. Läc dÞch chiÕt qu¶ ®.îc tr×nh b y ë b¶ng 1.<br /> <br /> B¶ng 1: KÕt qu¶ chiÕt c¸c ancaloit trong 250 g bét l¸ Ficus hispida L.<br /> C¸c axit dïng ®Ó chiÕt Axit axetic Axit xitric Axit tactric Axit H2SO4<br /> HiÖu suÊt c¸c cÆn 3% 3% 3% 3%<br /> TÝnh theo gam 0,625 0,875 2,125 2,050<br /> TÝnh theo % nguyªn liÖu kh« 0,250 0,300 0,820 0,850<br /> Ký hiÖu c¸c cÆn A C T S<br /> <br /> b) Ph¸t hiÖn c¸c ancaloit trong c¸c cÆn chiÕt A, mét ®iÒu kiÖn s¾c ký v hÖ dung m«i<br /> C, T v* S CHCl3/EtOAc/MeOH 94 : 2 : 4 (v : v : v). HiÖn<br /> s¾c phæ b»ng thuèc thö Dragendorf v<br /> Thùc hiÖn s¾c ký líp máng c¸c cÆn A, C, T serisunfat. KÕt qu¶ ph¸t hiÖn c¸c ancaloit trong<br /> v S trªn cïng mét b¶n s¾c ký 60F254, trong cïng c¸c cÆn trªn ®.îc chØ ra trong b¶ng 2.<br /> <br /> B¶ng 2: C¸c ancaloit cã trong c¸c cÆn chiÕt tõ l¸ c©y ng¸i theo ph.¬ng ph¸p axit<br /> Rf 0,10 0,19 0,27 0,36 0,52 0,70<br /> Dr v ng v ng v ng v ng v ng v ng Sè<br /> C¸c<br /> ancaloit<br /> cÆn Sc v ng tÝm hång ®á x¸m n©u<br /> A (-) (-) (-) (-) (-) (-) 0<br /> C (x) (x) (-) (x) (-) (x) 4<br /> T (x) (x) (x) (x) (x) (x) 6<br /> S (x) (x) (x) (x) (x) (x) 6<br /> <br /> c) ChiÕt c¸c phi ancaloit trong l¸ c©y ng¸i 4. Thö kh¶ n¨ng g©y ®éc tÕ b o ung th, cña<br /> c¸c cÆn tæng ancaloit v phi ancaloit cña l¸<br /> 250 g bét l¸ c©y ng¸i sau khi ®~ chiÕt hÕt<br /> c¸c ancaloit b»ng axit tactric, ®.îc röa s¹ch c©y ng¸i (Ficus hispida L.)<br /> axit, l m kh« v ng©m víi 350 ml MeOH trong §éc tÝnh cña c¸c cÆn tæng c¸c ancaloit v<br /> 72 giê ë nhiÖt ®é phßng. Läc dÞch chiÕt b»ng phi ancaloit chiÕt tõ l¸ c©y ng¸i ®èi víi tÕ b o<br /> phÔu butne v lÆp l¹i 2 lÇn n÷a. Gép dÞch chiÕt ung th. gan ng.êi (Hep G-2), ung th. m ng tö<br /> l¹i, lo¹i bít MeOH trong ch©n kh«ng ®Õn 1/3 cung ng.êi (FI) v ung th. m ng tim ng.êi<br /> thÓ tÝch v pha thªm 1 thÓ tÝch n.íc. ChiÕt dÞch (RD) ®.îc thö theo ph.¬ng ph¸p ®ang ®.îc ¸p<br /> thu ®.îc b»ng n-hexan ®Õn lóc nh¹t m u dÞch dông t¹i ViÖn nghiªn cøu quèc gia Hoa Kú<br /> chiÕt n-hexan, chiÕt tiÕp b»ng EtOAc 3 lÇn mçi (NIC) [5]. TÕ b o ung th. ®.îc duy tr× sèng liªn<br /> lÇn 60 ml. Gép dÞch chiÕt EtOAc, l m kh« b»ng tôc ë ®iÒu kiÖn chuÈn, sau khi tÕ b o ®.îc ho¹t<br /> Na2SO4 khan, cÊt lo¹i dung m«i thu ®.îc 2,85 g hãa ph¸t triÓn ®Õn giai ®o¹n logarit th× thö<br /> cÆn EtOAc ký hiÖu E, hiÖu suÊt 1,14%. nghiÖm ®.îc tiÕn h nh víi c¸c mÉu thö ®~<br /> 313<br /> chuÈn bÞ s½n tõ 4 - 10 thang nång ®é kh¸c nhau. b¶ng 1 v 2. KÕt qu¶ n y cho thÊy axit yÕu nh.<br /> Thö nghiÖm ®.îc lËp l¹i 3 lÇn trªn phiÕu vi axit axetic kh«ng chiÕt ®.îc ancaloit v axit<br /> l.îng 96 giÕng. Gi¸ trÞ IC50 ®.îc tÝnh theo citric chØ chiÕt ®.îc 4 ancaloit cßn c¸c axit<br /> ch.¬ng tr×nh b¶ng ®.êng cong víi gi¸ trÞ logarit m¹nh nh. axit tactric v H2SO4 3% kh«ng<br /> dùa trªn gi¸ trÞ c¸c thang nång ®é kh¸c nhau cña nh÷ng chiÕt ®.îc nhiÒu ancaloit (6) m hiÖu<br /> mÉu thö v gi¸ trÞ OD ®o ®.îc. KÕt qu¶ cña thö suÊt chiÕt còng cao ( 0,82%). S¸u ancaloit<br /> nghiÖm n y ®.îc ghi trªn b¶ng 3. trong l¸ c©y ng¸i kh«ng nh÷ng kh¸c nhau vÒ Rf<br /> 5. Ph©n lËp axit betulinic tõ cÆn phi ancaloit m cßn hiÖn m u kh¸c nhau víi thuèc thö<br /> chiÕt tõ l¸ c©y ng¸i (Ficus hispida L.) Seriumsunfat v cïng hiÖn m u v ng da cam víi<br /> thuèc thö ®Æc tr.ng Dragendop. KÕt qu¶ n y<br /> S¾c ký cét 2 g cÆn E trªn 80 g Silicagel cì còng cho thÊy 6 ancaloit cã trong l¸ c©y ng¸i cã<br /> 40 - 60 µm trong cét d i 1 m, ®.êng kÝnh 3 cm, c.êng ®é baz¬ yÕu nªn axit yÕu axetic 3%<br /> nhåi .ít, víi dung m«i röa n-hexan/EtOAc theo kh«ng chiÕt ®.îc.<br /> gradient (100% n-hexan 100%EtOAc) víi Trong c¸c hîp chÊt phi ancaloit cã trong l¸<br /> tèc ®é röa 1 ml/phót, lÊy th nh 120 ph©n ®o¹n, c©y ng¸i, chóng t«i chØ chó ý ®Õn c¸c hîp chÊt<br /> mçi ph©n ®o¹n 10 ml. KiÓm tra c¸c ph©n ®o¹n cã ®é ph©n cùc trung b×nh tan ®.îc trong<br /> b»ng s¾c ký líp máng v gép c¸c ph©n ®o¹n cã EtOAc. §Ó chiÕt ®.îc c¸c hîp chÊt n y chóng<br /> s¾c phæ gièng nhau th nh 8 nhãm. S¾c ký cét t«i dïng bét l¸ c©y ng¸i sau khi ®~ chiÕt hÕt<br /> nhanh nhãm 4 trªn silicagel cì 40 - 50 µm, víi ancaloit b»ng axit tactric 3% v chiÕt hÕt chÊt<br /> dung m«i röa n-hexan/EtOAc (1/4), thu th nh kh«ng ph©n cùc b»ng n-hexan. KÕt qu¶ chiÕt<br /> 20 ph©n ®o¹n. Tõ ph©n ®o¹n 9 - 15, sau khi lo¹i cho thÊy h m l.îng c¸c chÊt chiÕt ®.îc b»ng<br /> hÕt dung m«i, kÕt tinh ph©n ®o¹n trong EtOAc/ EtOAc kh¸ lín 1,14%.<br /> MeOH 95/5 (v/v) thu ®.îc 0,12 g (hiÖu suÊt 6% §Ó t×m kiÕm nhanh chãng c¸c hîp chÊt<br /> so víi cÆn E), mét chÊt v« ®Þnh h×nh cã ®iÓm chèng ung th. trong l¸ Ficus hispida chóng t«i<br /> ch¶y 290 - 292oC, Rf 0,77 (EtOAc/EtOH, 1/4, tiÕn h nh thö in vitro ®éc tÝnh cña 2 cÆn chiÕt<br /> v/v). Ký hiÖu l FMT.1. C¸c sè liÖu quang phæ tæng ancaloit v phi ancaloit ®èi víi 3 dßng tÕ<br /> MS, 1H&13C-NMR, DEPT 90, DEPT 135 ®.îc b o ung th.. KÕt qu¶ ®.îc tr×nh b y ë b¶ng 3.<br /> nªu trong phÇn th¶o luËn kÕt qu¶ nghiªn cøu. KÕt qu¶ n y cho thÊy c¶ hai cÆn tæng c¸c<br /> ancaloit v phi ancaloit ®Òu cã ®éc tÝnh ®èi víi 3<br /> III - kÕt qu¶ v& Th¶o luËn dßng tÕ b o ung th. ®.a thö, trong ®ã c.êng ®é<br /> ®éc ®èi víi tÕ b o ung th. cña cÆn tæng c¸c<br /> Qua c¸c t i liÖu [1 - 4] chóng ta thÊy c©y ancaloit ®Æc biÖt cao. IC50 cña nã ®èi Hep G-2 l<br /> ng¸i (Ficus hispida L.) l c©y thuèc d©n téc quý. 0,70, FI l 0,95 v ®èi víi RD l 0,97. C¸c gi¸<br /> Ngo i viÖc dïng ®Ó ch÷a c¸c lo¹i bÖnh ung th., trÞ n y c ng cã ý nghÜa v× cÆn n y l mét hçn<br /> cßn ch÷a nhiÒu bÖnh kh¸c, ®iÒu n y cho thÊy hîp nhiÒu chÊt trong ®ã cã 6 ancaloit. §iÒu n y<br /> c¸c hîp chÊt cã ho¹t tÝnh sinh häc trong c©y khÝch lÖ chóng t«i trong nghiªn cøu ph©n lËp,<br /> ng¸i rÊt phong phó. §Ó cho viÖc nghiªn cøu x¸c ®Þnh cÊu tróc ph©n tö v ho¹t tÝnh chèng<br /> thuËn tiÖn chóng t«i chiÕt ph©n líp c¸c ho¹t chÊt ung th. cña c¸c chÊt trong cÆn n y. KÕt qu¶<br /> sinh häc trong l¸ c©y ng¸i th nh hai nhãm. nghiªn cøu sÏ ®.îc c«ng bè trong c¸c c«ng tr×nh<br /> Nhãm c¸c chÊt ancaloit v nhãm c¸c chÊt phi s¾p tíi.<br /> ancaloit. Trong c«ng tr×nh n y chóng t«i tiÕn h nh<br /> C.êng ®é baz¬ cña c¸c ancaloit phô thuéc ph©n lËp v nhËn biÕt c¸c chÊt trong cÆn phi<br /> v o th nh phÇn v cÊu tróc ph©n tö cña chóng, ancaloit (E) v× cÆn n y còng cã ph¶n øng t.¬ng<br /> nªn ®Ó chiÕt kiÖt c¸c ancaloit chóng t«i tiÕn ®èi víi 3 dßng tÕ b o ung th. ®~ thö (xem b¶ng<br /> h nh chiÕt víi c¸c axit cã c.êng ®é kh¸c nhau. 3). B»ng ph.¬ng ph¸p s¾c ký cét th.êng, cét<br /> Tõ axit axetic cã c.êng ®é yÕu pKa = 4,73, axit nhanh v kÕt tinh ph©n ®o¹n chóng t«i ®~ ph©n<br /> xitric cã pKa = 3,13 ®Õn axit cã c.êng ®é m¹nh lËp ®.îc mét hîp chÊt tinh khiÕt. ChÊt n y cã<br /> h¬n nh. axit tactric-pKa = 2,98 v axit cã c.êng pic ion ph©n tö [M]+ 456 v ph©n m¶nh cã m/z:<br /> ®é m¹nh nhÊt H2SO4. KÕt qu¶ ®.îc chØ ra trong 248, 220, 189, 175, 55, phæ IR cña nã cã nhãm<br /> 314<br />  B¶ng 3: §éc tÝnh ®èi víi 3 dßng tÕ b o ung th. cña c¸c cÆn tæng ancaloit v<br /> phi ancaloit chiÕt tõ l¸ Ficus hispida L.<br /> <br /> IC50 µg/ml<br /> C¸c mÉu KÕt luËn<br /> Hcp G-2 FI RD<br /> Tæng ancaloit 0,70 0,95 0,97 D.¬ng tÝnh c¶ 3 dßng<br /> Phi ancaloit 13,6 10,7 10,9 D.¬ng tÝnh c¶ 3 dßng<br /> <br /> hidroxyl cã pic réng ë 3479,71 cm-1, c¸c nhãm nhãm CH2, phæ 13C-NMR cho thÊy trong ph©n<br /> CH2, CH3 ë 2933,09; 2866; 254 cm-1, nhãm tö FMT-1 cã 7 cacbon bËc 4.<br /> cacbonyl ë 1712,12 cm-1 v liªn kÕt ®«i cuèi Tõ c¸c sè liÖu phæ trªn v kÕt hîp víi<br /> m¹ch 2 nhãm thÕ cïng phÝa ë 1627,50 cm-1, liªn HMBC, HMQC, COSY cña FMT-1, chóng t«i<br /> kÕt C-O ë 1348 cm-1 v 883 cm-1 ®Æc tr.ng cho thiÕt lËp ®.îc c«ng thøc cÊu t¹o cña FMT-1 nh.<br /> CH cña liªn kÕt ®«i cuèi m¹ch. h×nh 1 v cã tªn l axit 3- -hidroxyl lup-20<br /> Phæ 1H-NMR cña FMT-1 cho thÊy trong (29)-en-28-oic- hay cßn gäi l axit betulinic.<br /> ph©n tö cña nã cã 6 nhãm CH3 cã ®é chuyÓn dÞch C¸c sè liÖu phæ 1H v 13C-NMR cña FMT-1<br /> hãa häc 0,75 (s.3H); 0,82 (s.3H); 0,95 (s.3H); tr×nh b y ë b¶ng 4.<br /> 29<br /> 0,96 (s.3H); 0,97 (s.3H) v 1,27 ppm (s.3H).<br /> 30<br /> 21<br /> Phæ 13C-NMR cho thÊy cã 30 cacbon trong 19<br /> 22<br /> ph©n tö FMT-1. §¸ng chó ý cã 3 pic ë 117,58 12<br /> 18<br /> <br /> 11<br /> ppm, 150,57 ppm v 179,67 ppm ®Æc tr.ng cho 25 36<br /> 13 17<br /> 28<br /> 1 COOH<br /> 2 cacbon cña liªn kÕt ®«i 2 nhãm thÕ mét phÝa 2 10<br /> 9<br /> 8 15<br /> 16<br /> <br /> v cña cacbon cña nhãm cacbonyl. 3<br /> 27<br /> 4 6 7<br /> DEPT 90 cho thÊy cã 6 nhãm CH, DEPT HO 23<br /> 24<br /> 135 cho thÊy cã 6 nhãm CH, 6 nhãm CH3 v 11 H×nh 1<br /> <br /> B¶ng 4: Sè liÖu phæ 1H & 13C-NMR cña FMT-1 ghi trong CDCl3<br /> Sè proton ®é Sè proton ®é<br /> STT H ,ppm , ppm<br /> C STT H , ppm C,ppm<br /> béi, J., Hz béi, J. ,Hz<br /> 1 38,72 16 32,21<br /> 2 27,45 17 56,60<br /> 3 CH, t, 8 3,46 79,00 18 47,01<br /> 4 38,90 19 49,52<br /> 5 55,40 20 150,57<br /> 6 18,32 21 29,71<br /> 7 34,38 22 36,98<br /> 8 40,70 23 CH3, s, 3H 0,94 28,01<br /> 9 50,60 24 CH3, s, 3H 0,82 15,37<br /> 10 37,24 25 CH3, s, 3H 0,75 15,98<br /> 11 20,90 26 CH3, s, 3H 0,95 16,13<br /> 12 25,67 27 CH3, s, 3H 0,97 14,24<br /> 13 38,30 28 179,67<br /> 14 42,45 29 CH2, 2s, 2H 4,72 117,58<br /> 15 30,65 30 CH3, s, 3H 1,58 19,40<br /> 315<br />  C¸c sè liÖu phæ cña FMT-1 còng nh. ®iÓm 2. Sergio-R. Perazu-Sanchez et al Planta. Med,<br /> ch¶y cña nã phï hîp víi sè liÖu phæ cña axit 183 - 186 (2002).<br /> betulinic trong t i liÖu [6]. C¸c nghiªn cøu gÇn 3. Vâ V¨n Chi. Tõ ®iÓn c©y thuèc ViÖt Nam,<br /> ®©y cho thÊy axit betulinic l chÊt cã ho¹t tÝnh Nxb. Y häc, Tr. 822 (1997).<br /> sinh häc lý thó, kh«ng nh÷ng nã cã ho¹t tÝnh<br /> chèng ung th. m cßn cã t¸c dông chèng viªm 4. Anonymous. The Useful Plants of India,<br /> v HIV [7]. Ng y nay nã ®ang ®.îc nghiªn cøu New Delli Publication and information<br /> thö nghiÖm ®¸nh gi¸ tiÒn l©m s ng [8]. Nã cã directorate CSTR, 221 (1986).<br /> trong nhiÒu lo i thùc vËt kh¸c nhau nh.ng lÇn 5. D. A. Vanden Bergher and A. J. Vlientink<br /> ®Çu tiªu ®.îc chóng t«i t×m thÊy trong l¸ Ficus Methods in Plant Biochemistry Vol. 6, P. 47<br /> hispida L.. - 68 (1991).<br /> 6. F. Kashiwaola et al. J. Nat. Prod., 61, P.<br /> T&i liÖu tham kh¶o 1090 - 1095 (1998).<br /> 1. NguyÔn NghÜa Th×n, NguyÔn ThÞ H¹nh, 7. Gery Takeoka et al. J. Agric. Food Chem.,<br /> Ng« Trùc Nh~. Thùc vËt häc d©n téc, c©y 48, 3437 - 3439 (2000).<br /> thuèc cña ®ång b o Th¸i Con Cu«ng-NghÖ An. 8. TrÇn TiÕn §¹t, TrÇn V¨n Thanh. T¹p chÝ<br /> Nxb. N«ng nghiÖp 2001 trang 131 -132. D.îc häc, sè 2, Tr. 7 - 8 (1999).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 316<br />