zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Khoa Học Tự Nhiên

Nghiên cứu hình thái giải phẫu lá, khả năng kháng khuẩn và kháng ung thư của loài Tầm Gửi năm nhị (Dendrophthoe pentandra (l.) miq.) ký sinh trên một số cây trồng ở thành phố Hồ Chí Minh

Chia sẻ: ĐInh ĐInh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:11

Báo xấu

36
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Công trình này nghiên cứu hình thái, giải phẫu lá, khả năng kháng khuẩn và gây độc tế bào ung thư của loài Tầm gửi năm nhị ký sinh trên cây Mít (Artocarpus heterophyllus Lamk.), Xoài (Mangifera indica L.), Dâu tằm (Morus alba L.), Sao đen (Hopea odorata Roxb.) và Tràm Liễu (Callistemon citrinus Skeels.) trồng ở thành phố Hồ Chí Minh (TP HCM) qua điều chế cao nước và cao khô. Mời các bạn cùng tham khảo để biết thêm nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu hình thái giải phẫu lá, khả năng kháng khuẩn và kháng ung thư của loài Tầm Gửi năm nhị (Dendrophthoe pentandra (l.) miq.) ký sinh trên một số cây trồng ở thành phố Hồ Chí Minh

Năm học 2010 – 2011 NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI GIẢI PHẪU LÁ, KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG UNG THƯ CỦA LOÀI TẦM GỬI NĂM NHỊ (DENDROPHTHOE PENTANDRA (L.) MIQ.) KÝ SINH TRÊN MỘT SỐ CÂY TRỒNG Ở THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Phạm Xuân Bằng (SV năm 4, Khoa Sinh học) GVHD: TS Phạm Văn Ngọt ThS Nguyễn Hoàng Hạt 1. Mở đầu Loài Tầm gửi năm nhị (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) (TGNN) còn được gọi là Mộc ký ngũ hùng thuộc họ Tầm gửi (Loranthaceae) ký sinh trên nhiều loài cây trồng và cây hoang dại. Trong dân gian người ta thường dùng lá TGNN phối hợp với lá chè nấu nước uống trị ho. Ở Ấn Độ người ta dùng lá giã đắp trị chỗ đau và loét. Khả năng kháng khuẩn của loài này bước đầu cho thấy cao ethyl acetate được điều chế từ cây TGNN ký sinh trên cây Xoài (Mangifera indica) có hoạt tính kháng khuẩn đối vớí Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus aureus đề kháng methycilin (MRSA) ATCC 43300 và Bacillus subtilis PY 79 ở nồng độ 1024 µg/ml. Công trình này nghiên cứu hình thái, giải phẫu lá, khả năng kháng khuẩn và gây độc tế bào ung thư của loài TGNN ký sinh trên cây Mít (Artocarpus heterophyllus Lamk.), Xoài (Mangifera indica L.), Dâu tằm (Morus alba L.), Sao đen (Hopea odorata Roxb.) và Tràm Liễu (Callistemon citrinus Skeels.) trồng ở thành phố Hồ Chí Minh (TP HCM) qua điều chế cao nước và cao khô. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Phương pháp thu mẫu Mẫu TGNN được thu hái từ 5 loài cây Mít, Xoài, Dâu tằm, Sao đen, Tràm liễu vào tháng 10 đến 11-2010 trồng ở quận Thủ Đức TP HCM. Mẫu TGNN được bảo quản với giấy báo ẩm, sau đó cho vào túi nilon đem về phòng thí nghiệm. Ứng với mỗi loài cây chủ, thu hái 30 cành TGNN ký sinh trên 10 cây chủ. 2.2. Phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu lá Chọn 30 lá bánh tẻ TGNN (từ 30 cành) cho mỗi loài cây chủ để mô tả các dạng lá, kích thước lá và màu sắc của lá. Sau đó giải phẫu lá, cắt lá thành từng lát mỏng bằng dao lam, nhuộm kép với phẩm nhuộm là dung dịch carmin - phèn chua và xanh methylen để khảo sát vi phẫu tại phòng thí nghiệm Thực vật Trường Đại học Sư phạm TP HCM. A B Hình 1. Vị trí đo kích thước (A) và cắt giải phẫu lá (B) 11
Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 2.3. Phương pháp điều chế mẫu thử hoạt tính Rửa sạch mẫu TGNN, tách lấy lá và cành; cành cắt thành từng đoạn 2 - 3 cm, lá đem thái nhỏ làm 4. Tạo 15 mẫu TGNN ứng với mỗi loài cây chủ Mẫu TGNN tươi được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 80oC. Lấy 100g mẫu khô (50g cành khô và 50g lá khô) hòa với 500ml nước cất đem đun bằng ấm điện cho tới khi còn khoảng 50ml (khoảng 70 phút). Sau đó chế nước sắc vào cốc đong. Để thử hoạt tính kháng khuẩn thì dùng luôn mẫu thử dạng cao nước: pha 50ml nước sắc TGNN vào 50 ml nước cất vô trùng. Để thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư thì tiếp tục đặt cốc đong chứa cao nước vào nồi đun cách thủy cho tới khi mẫu thử được cô cạn thành cao khô. Ghi ký hiệu từng mẫu thử như sau: Bảng 1. Ký hiệu các mẫu cao Tầm gửi năm nhị Tầm gửi năm nhị Cao nước Cao khô Ký sinh trên cây Mít TMcw TMcd Ký sinh trên cây Dâu tằm TDcw TDcd Ký sinh trên cây Sao đen TScw TScd Ký sinh trên cây Tràm liễu TTLcw TTLcd Ký sinh trên cây Xoài TXcw TXcd 2.4. Thử hoạt tính kháng khuẩn của cao khô Chuẩn bị môi trường tăng sinh BHI (Brain Heart Infusion Broth), môi trường làm kháng sinh đồ MHA (Mueller Hinton Agar) mua tại công ty Nam Khoa đối với các chủng Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Klebsiella pneumoniae; môi trường làm kháng sinh đồ MPA (Malt-Peptone-Agar) chế tạo trong phòng thí nghiệm Vi sinh - Sinh hóa trường Đại học Sư phạm TP HCM đối với các chủng Bacillus subtilis, Escherichia coli Các chủng vi khuẩn thử nghiệm bao gồm Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli , Klebsiella pneumoniae. Xác định hoạt tính kháng khuẩn các mẫu thử TMcw. TXcw, TDcw, TScw, TTLcw, bằng phương pháp đục lỗ thạch. Đánh giá độ mạnh của hoạt tính: căn cứ vào đường kính vòng kháng khuẩn sau khi trừ 0.9cm đường kính vòng đục lỗ nhỏ cao thử. 2.5. Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cao thô Mẫu thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư TMcd. TXcd, TDcd, TScd, TTLcd được Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử – Bộ môn Di truyền – Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên thực hiện theo phương pháp thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B). 12
Năm học 2010 – 2011 Các mẫu thử hòa tan trong DMSO, pha loãng đến nồng độ 1.000µg/ml trong môi trường nuôi cấy rồi lọc vô khuẩn bằng màng lọc 0,22 µm. Dòng tế bào tiến hành thử nghiệm là dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa. Mẫu thử đối chứng là Camptothecine 0,01 µg/ml - một chất hóa học có khả năng gây độc tế bào ung thư ở nồng độ rất thấp. 2.6. Phương pháp xử lí số liệu Dùng toán thống kê và phần mềm Excel 2010 và Statgraphics Centurion XVI. để xử lý số liệu thu được. 3. Kết quả nghiên cứu 3.1. Hình thái lá - TGNN ký sinh trên cây Mít có 2 kiểu lá: + Kiểu lá 1: phiến lá hình bầu dục, chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – 2 lần, đầu lá và đáy lá tù (phụ lục hình 1A). + Kiểu lá 2: phiến lá hình trứng, chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – 2 lần, đầu lá tù, đáy lá tròn (phụ lục hình 1B). - TGNN ký sinh trên cây Dâu tằm có 3 kiểu lá: + Kiểu lá 1: phiến lá hình bầu dục, chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – 3 lần, đầu lá nhọn, đáy lá tù (phụ lục hình 2A). + Kiều lá 2: phiến lá tròn, có chiều rộng gần bằng chiều dài, đầu lá và đáy lá đều tròn (hình phụ lục hình 2B). + Kiểu lá 3: phiến lá hình trứng, chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – 2 lần, đầu lá tù, đáy lá tròn (phụ lục hình 2C). Thường gặp kiểu lá hình bầu dục và kiểu lá hình trứng. Lá TGNN ký sinh trên cây Dâu tằm có màu lục đậm. - TGNN ký sinh trên cây Xoài có 2 kiểu lá: + Kiểu lá 1: phiến hình bầu dục có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – 3 lần, đầu lá nhọn và đáy lá tù (phụ lục hình 3A). + Kiểu lá 2: phiến lá hình trứng có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – 2 lần, đầu lá tù, gốc lá lõm 1 bên (phụ lục hình 3B). Ở loài TGNN ký sinh trên cây Xoài có lá chủ yếu là kiểu 1 (lá bầu dục). Về màu sắc cả hai kiểu lá trên đều có lá màu lục lợt. - TGNN ký sinh trên cây Sao đen có 3 kiểu lá: + Kiểu lá 1: phiến hình bầu dục có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – 2 lần, đầu lá nhọn và đáy lá tù (phụ lục hình 4A). + Kiểu lá 2: phiến hình mũi mác có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – 2 lần, đầu lá nhọn và đáy lá tù, mép lá có thùy nhỏ, hình mũi mác(hình 4B). + Kiểu lá 3: phiến hình tim có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – 2 lần, đầu lá tù lõm lại hình tim và đáy lá tù (phụ lục hình 4C). Về màu sắc lá: lá có màu lục đậm - TGNN ký sinh trên cây Tràm liễu có 2 kiểu lá: 13
Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH + Kiểu lá 1: phiến hình bầu dục có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – 2 lần, đầu lá nhọn và đáy lá tù (phụ lục hình 5A). + Kiểu lá 2: phiến lá hình trứng có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – 2 lần, đầu lá tù, gốc lá lõm 1 bên (phụ lục hình 5B). Ở loài TGNN có lá chủ yếu là kiểu 1 (lá bầu dục). Về màu sắc cả hai kiểu lá trên đều có lá màu lục lợt. Nhận xét: Loài TGNN ký sinh ở 5 loài cây chủ có nhiều dạng lá khác nhau, trong đó kiểu lá hình bầu dục là thường gặp. Lá của TGNN ký sinh trên cây chủ Mít, Dâu tằm và Sao đen có màu lục đậm; còn ký sinh trên cây Xoài và Tràm liễu lá có màu lục lợt. 3.2. Kích thước lá Kích thước lá TGNN (kiểu lá bầu dục) được trình bày ở bảng 2.. Qua các số liệu ở bảng 2. Cho thấy TGNN ký sinh trên 5 loài cây chủ khác nhau, cùng trong điều kiện khí hậu giống nhau, có sự sai khác có ý nghĩa về kích thước lá. Lá TGNN ký sinh trên cây Xoài có kích thước lớn nhất, còn lá TGNN ký sinh trên cây chủ Dâu tằm là nhỏ nhất. Bảng 2. Các chỉ số kích thước lá TGNN ký sinh trên 5 cây chủ Chỉ số Chiều dài trung Chiều rộng Chiều dài cuống lá Cây chủ bình (cm) trung bình (cm) trung bình (cm) Mít 11,80 ± 1,24 5,48 ± 0,68 0,68 ± 0,11 Dâu tằm 11,18 ± 1,36 7,00 ± 1,05 0,57 ± 0,11 Xoài 14,70 ± 1,85 5,84 ± 0,33 1,02 ± 0,04 Sao đen 12,35 ± 2,00 5,24 ± 0,97 0,94 ± 0,15 Tràm liễu 11,77 ± 1,22 4,96 ± 0,75 0,84 ± 0,16 3.3. Giải phẫu lá TGNN Cấu tạo lá TGNN ký sinh ở 5 loài cây chủ được thể hiện ở hình 7, 8, 9, 10 và 11 1. Biểu bì trên với cuticul 2. Hạ bì trên 3. Lục mô 4. Biểu bì dưới với cuticul 5. Hạ bì dưới 6. Mô dầy 7. Bó dẫn gân chính Hình 2. Cấu tạo giải phẫu lá TGNN ký sinh trên cây Mít (x 100) 14
Năm học 2010 – 2011 Hình 3. Cấu tạo giải phẫu lá TGNN ký sinh trên cây Dâu tằm (x 100) Hình 4. Cấu tạo giải phẫu lá TGNN ký sinh trên cây Xoài (x 100) Hình 5. Cấu tạo giải phẫu lá TGNN ký sinh trên cây Sao đen (x 100) Hình 6. Cấu tạo giải phẫu lá TGNN ký sinh trên cây Tràm liễu (x 100) Độ dày các lớp mô của lá TGNN được trình bày trong bảng 3. Bảng 3. Độ dày (µm) các lớp mô lá TGNN ký sinh trên 5 loài cây chủ Cấu tạo lá Độ dày của mô lá TGNN ký sinh trên cây chủ 15
Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH Loại mô và Số lớp Sao Tràm Mít Dâu tằm Xoài tầng cuticul tế bào đen liễu Tầng cutiul 4,27 4,70 4,40 4,40 2,90 - trên ± 0,32 ± 0,26 ± 0,28 ± 0,35 ± 0,36 11,77 13,60 14,20 15,97 12,70 Biểu bì trên 1 ± 0,72 ± 1,12 ± 1,99 ± 1,84 ± 1,04 34,21 38,17 34,63 35,64 33,10 Hạ bì trên 2-3 ± 2,45 ± 3,05 ± 3,88 ± 2,78 ± 2,91 394,20 533,30 383,80 422,92 340,50 Lục mô 5-6 ± 22,59 ± 25,73 ± 31,90 ± 13,71 ± 11,04 35,42 33,77 32,30 12,14 33,22 Hạ bì dưới 2-3 ± 2,06 ± 8,18 ± 2,92 ± 1,51 ± 3,05 11,55 13,02 12,74 29,30 12,69 Biểu bì dưới 1 ± 0,89 ± 0,94 ±1,44 ± 4,06 ± 1,10 Tầng cutiul 3,78 4,20 3,83 3,78 2,30 - dưới ± 0,33 ± 0,29 ± 0,51 ± 0,37 ± 0,28 495,16 640,80 485,78 524,14 437,37 Độ dầy lá ± 23,20 ± 28,35 ± 39,01 ± 15,50 ± 12,50 Nhận xét: - Về đại thể lá TGNN ký sinh trên các loài cây chủ khác nhau có cấu tạo giống nhau, nhưng có sự sai khác về độ dầy của các mô. - Lá TGNN có tầng cuticul mặt trên và mặt dưới của khá dầy, trên 3,78 µm. Lá TGNN ký sinh trên cây Tràm liễu có tầng cuticul mỏng nhất. - Có 2 - 3 lớp hạ bì trên và 2 - 3 lớp hạ bì dưới. Sự có mặt của tầng cuticul khá dầy và hạ bì chứng tỏ loài TGNN là loài cây ưa sáng. - Lục mô không phân hóa, có độ dày lớn nhất so với các mô khác. Sự sai khác về độ dày của lá là do độ dày của lục mô. Lá TGNN ký sinh trên cây Dâu tằm có độ dày lớn nhất, còn lá TGNN ký sinh trên Tràm liễu có độ dày mỏng nhất. 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn Các cao thử TMcw, TXcw, TScw, TTLcw, đều cho hoạt tính kháng khuẩn đối với 3 chủng vi khuẩn thử nghiệm là Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Cao thử TDcw không có khả năng 3 chủng vi khuẩn này. Tất cả các cao thử TMcw, TXcw, TScw, TTLcw, TDcw đều không có hoạt tính kháng Escherichia coli, Klebsiella pneumonia. Hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn trên của các cao thử được thể hiện qua bảng 4. Bảng 4. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các cao thử (n = 3) Đường kính vòng kháng (cm) Tên cao Bacillus Escherich Staphylococ Pseudomona Klebsiella subtilis ia coli cus aureus s aeruginosa pneumonia. TMcw 0.8 ± 0,76 - 1,4 ± 0,064 1,2 ± 0,076 - TXcw 0.8 ± 0,03 - 1,8 ± 0,076 0,8 ± 0,05 - 16
Năm học 2010 – 2011 TDcw 0.35 ± 0,05 - 0,5 ± 0,086 - - TScw 0.8 ± 0,058 - 1,9 ± 0,058 1,1 ± 0,104 - TTLcw 0,5 ± 0,06 - 1,3 ± 0,08 1,1 ±0,1 - TMcw TXcw TDcw TScw TTLcw Hình 7. Kết quả hoạt tính kháng Bacillus subtilis của các cao thử (26/12/2010 ) (Toàn bộ các mẫu thử đều cho hoạt tính kháng B. subillis. Hoạt tính của các mẫu thử ở mức yếu) TMcw TXcw TDcw TScw TTLcw Hình 8. Kết quả hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của các cao thử (26/12/2011) 17
Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH (Toàn bộ các mẫu thử đều cho hoạt tính kháng Staphylococus aureus. Hoạt tính kháng khuẩn của các cao thử ở mức trung bình) TMcw TXcw TDcw TScw TTLcw Hình 9. Kết quả hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa của các cao thử (25/01/2011) (Cao TDcw không có hoạt tính kháng Pseudomomas aeruginosa .Toàn bộ các cao thử còn lại đều cho hoạt tính kháng Pseudomomas aeruginosa. Hoạt tính kháng khuẩn của các cao thử ở mức yếu) 3.5. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các cao thử TMcd, TDcd, TScd TTLcd, TXcd được thể hiện qua bảng sau: Bảng 5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư Tỷ lệ % gây độc tế bào Mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình TMcd 91,57 92,12 93,29 92,33 ± 0,880 TDcd 94,41 94,09 94,49 94,33 ± 0,208 TScd 94,21 95,75 94,94 94,97 ± 0,772 TTLcd 11,08 13,99 14,34 13,14 ± 1,791 TXcd 80,89 83,11 83,92 82,64 ± 1,564 Camptothecine 63,94 58,92 61,43 61,43 ± 2,506 0.01 µg/ml Sau 48 giờ cảm ứng ở nồng độ 1000µg/ml, tất cả các mẫu thử nghiệm đều có khả năng gây độc tế bào ung thư cổ tử cung HeLa cao, trừ mẫu TTLcd. 18
Năm học 2010 – 2011 TMcd TDcd TXcd TScd TTLcd Camptothecine 0.01ppm Hình 10. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào ung thư sau 48 giờ cảm ứng cao thử (10/03/2011 ) 4. Kết luận và kiến nghị 4.1. Kết luận - Lá TGNN có nhiều dạng, trong đó dạng thường gặp có hình bầu dục. Lá TGNN ký sinh trên cây Xoài có kích thước lớn nhất, lá TGNN ký sinh trên cây Dâu tằm có kích thước nhỏ nhất. - Lá TGNN ký sinh trên các loài cây chủ khác nhau nhưng có cấu tạo giống nhau, chúng có sự sai khác về độ dầy của lục mô. Lá TGNN ký sinh trên cây Dâu tằm có độ dày lớn nhất và lá TGNN ký sinh trên cây Tràm liễu có độ dày nhỏ nhất. - Cao nước li trích từ loài TGNN ký sinh trên cây Mít, Xoài, Sao đen, Tràm liễu đều có hoạt tính kháng 3 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. - Cao khô li trích từ loài TGNN ký sinh trên cây Mít, Xoài, Sao đen, Dâu tằm đều có hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ở nồng độ 1.000µg/ml. 4.2. Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn khác, xác định nồng độ ức chế tối thiểu của các mẫu thử hoạt tính. - Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các cao thử trên các dòng tê bào ung thư khác như dòng tế bào ung thư phổi, dòng tế bào ung thư vú… 19
Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, tr.762. 2. Phạm Hoàng Hộ (2003 ), Cây cỏ Việt Nam – quyển II, Nxb Trẻ, tr.134. 3. Trần Công Khánh (1981), Thực tập Hình thái và giải phẫu thực vật, Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội, tr.22, 28, 32 -3 4. 4. Phạm Văn Ngọt, Nguyễn Hoàng Hạt, Quách Văn Toàn Em, Hoàng Văn Tới (2010), Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của loài Mộc ký ngũ hùng (Dendrophthoe pentadra (L.) Miq.) thuộc họ Tầm gửi (Loranthaceae), Tạp chí khoa học, Trường Đại học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh, tr 67-71. 5. Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr 168 – 170. PHỤ LỤC B A Hình 1. Các kiểu lá TGNN ký sinh trên cây Mít A B C Hình 2 . Các kiểu lá TGNN ký sinh trên cây Dâu tằm 20
Năm học 2010 – 2011 A B Hình 3. Các kiểu lá TGNN ký sinh trên cây Xoài A B C Hình 4. Các kiểu lá TGNN ký sinh trên cây Sao đen A B Hình 5. Các kiểu lá TGNN ký sinh trên cây Tràm liễu 21

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.