Khảo sát đột biến gen FLT3-ITD trên bệnh bạch cầu cấp dòng tủy người lớn tại bệnh viện Truyền máu – Huyết học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6* 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN FLT3-ITD TRÊN BỆNH BẠCH CẦU CẤP<br /> DÒNG TỦY NGƯỜI LỚN TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU – HUYẾT HỌC<br /> Hồ Châu Minh Thư*, Cao Văn Động**, Cao Sỹ Luân**, Đoàn Thị Tuyết Thu**,<br /> Phù Chí Dũng**,Phan Thị Xinh*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Khảo sát đặc điểm đột biến gen FLT3-ITD của bệnh nhân (BN) bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT)<br /> người lớn dựa trên kích thước đoạn chèn, mức độ biểu hiện đột biến và có kèm đột biến gen NPM1.<br /> Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: 36 BN BCCDT người lớn (không tính thể M3) được chẩn đoán tại<br /> Bệnh viện Truyền Máu-Huyết Học TP.Hồ Chí Minh từ 01/06/2013 đến 28/02/2019 có đột biến gen FLT3-ITD.<br /> Nghiên cứu mô tả loạt ca. Sử dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp (Sanger sequencing) và kỹ thuật phân tách<br /> đoạn DNA (DNA fragment analysis) để xác định số cặp base (bp) chèn vào gen FLT3 và lượng allele mang đột<br /> biến gen FLT3-ITD.<br /> Kết quả: Kết quả nghiên cứu cho thấy có 17 BN (47,2%) có ít nhất 1 trong 2 đặc điểm là ≥70bp chèn<br /> vào gen FLT3 và/ hoặc lượng allele mang đột biến FLT3-ITD ≥50%; trong đó, 8 trường hợp (22,2%) có số<br /> bp chèn vào gen FLT3 là ≥ 70 bp và 11 trường hợp (30,6%) có lượng allele mang đột biến gen FLT3-ITD<br /> ≥50%. Tỉ lệ các BN có đột biến gen FLT3-ITD kèm và không kèm đột biến gen NPM1 lần lượt là 52,8%<br /> (n=19) và 47,2% (n=17).<br /> Kết luận: Chúng tôi đã ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự trực tiếp kết hợp với kỹ thuật phân<br /> tách đoạn DNA trong việc khảo sát đặc điểm đột biến gen FLT3-ITD, giúp phân nhóm tiên lượng BN<br /> BCCDT chính xác hơn.<br /> Từ khóa: bạch cầu cấp dòng tủy, FLT3-ITD, kỹ thuật giải trình tự trực tiếp, kỹ thuật phân tách đoạn DNA<br /> ABSTRACT<br /> ANALYSIS OF FLT3-ITD MUTATION IN ADULT ACUTE MYELOID LEUKEMIA<br /> AT BLOOD TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL<br /> Ho Chau Minh Thu, Cao Van Dong, Cao Sy Luan, Doan Thi Tuyet Thu, Phu Chi Dung, Phan Thi Xinh<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 6 - 2019: 317 - 322<br /> Objectives: To analyse FLT3-ITD mutant level, number, size and interaction with NPM1 mutations in<br /> adult patients with acute myeloid leukemia (AML).<br /> Subjects: We analysed 36 adult patients with AML (non-APL) who had FLT3-ITD mutation at Blood<br /> Transfusion Hematology Hospital from June 1, 2013 to February 28, 2019.<br /> Method: Prospective case series. We used Sanger sequencing and DNA fragment analysis method for<br /> determining ITD length and FLT3-ITD mutant allelic burden.<br /> Results: There were 17 patients (47.2%) expressing long ITD length (≥70 bp) or high FLT3-ITD mutant<br /> allelic burden (≥50%); in there, 8 cases (22.2%) expressing long ITD length, 11 cases (30.6%) expressing high<br /> FLT3-ITD mutant allelic burden. We also found 19 out of 36 patients (52.8%) had NPM1 mutation and 17<br /> patients (47.2%) did not.<br /> Conclusion: Analyse FLT3-ITD mutation combining Sanger sequencing and DNA fragment analysis<br /> <br /> *Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh **Bệnh viện Truyền máu Huyết học<br /> Tác giả liên lạc: TS. Cao Sỹ Luân ĐT: 0917 862 262 Email: caosyluan@gmail.com<br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 317<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019<br /> <br /> was successfully established at our hospital. This may help to improve the classification and prognosis in<br /> AML patient.<br /> Key word: acute myeloid leukemia, FLT3-ITD, sanger sequencing, DNA fragment analysis<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ máu – Huyết học TP.Hồ Chí Minh.<br /> Bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) là thể bệnh ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU<br /> thường gặp nhất trong các thể bạch cầu cấp ở Đối tượng nghiên cứu<br /> người lớn. 36 BN BCCDT người lớn (không tính thể<br /> Đây là một bệnh không đồng nhất về mặt di M3) được chẩn đoán tại BV Truyền Máu-Huyết<br /> truyền học cũng như sinh học phân tử, trong đó Học TP.Hồ Chí Minh từ 01/06/2013 đến<br /> đột biến gen và nhiễm sắc thể gây ra các rối loạn 28/02/2019 có đột biến gen FLT3-ITD.<br /> về tăng trưởng, biệt hóa của các tế bào tiền thân Thiết kế nghiên cứu<br /> tạo máu. Nghiên cứu mô tả loạt ca.<br /> Các bất thường về gen có thể kể đến như đột<br /> Phương pháp tiến hành nghiên cứu<br /> biến gen CEBPA, NPM1 và đặc biệt là gen FLT3.<br /> Gen FLT3 nằm trên nhiễm sắc thể 13, mã hóa cho<br /> thụ thể tyrosine kinase thuộc nhóm III là một<br /> trong những gen thường bị đột biến nhất. Hai<br /> loại đột biến FLT3 thường gặp trong bệnh<br /> BCCDT đã được tìm thấy bao gồm nhân đoạn<br /> nội tại (FLT3-ITD) chiếm khoảng 30% các trường<br /> hợp và đột biến điểm vùng tyrosine kinase<br /> (FLT3-TKD), chiếm khoảng 10%(1,2,9). Trước đây,<br /> các bệnh nhân (BN) BCCDT có đột biến gen<br /> FLT3-ITD đều được xếp vào nhóm tiên lượng<br /> xấu(1,2,5,9). Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây<br /> cho thấy biểu hiện của gen FLT3-ITD không<br /> giống nhau giữa các BN mang đột biến. Nói cách<br /> khác, đặc điểm lâm sàng, sinh học cũng như tiên<br /> Hình 1. Sơ đồ tiến hành nghiên cứu<br /> lượng, dự hậu của các BN BCCDT có đột biến<br /> gen FLT3-ITD phụ thuộc vào sự khác biệt về đặc Ly trích RNA, tổng hợp cDNA<br /> điểm đột biến, được xác định bởi tỉ lệ allele có Mẫu tủy xương hoặc máu ngoại biên được<br /> đột biến và không có đột biến (alletic ratio) hoặc lấy trong chống đông EDTA tại thời điểm bệnh<br /> lượng allele có đột biến trên tổng số allele, cũng mới được chẩn đoán. Ly trích RNA bằng bộ kit<br /> như chiều dài đoạn chèn của đột biến(4,6,8) và các Invitrap Spin Universal RNA Mini kit (Stractec)<br /> đột biến khác kèm theo. theo quy trình kỹ thuật do nhà sản xuất cung<br /> Tuy nhiên, cho đến thời điểm nghiên cứu cấp. cDNA được tổng hợp bằng kit PrimeScript<br /> vẫn chưa có công trình nào tại Việt Nam báo cáo RT Master Mix (Takara).<br /> về việc đặc điểm của đột biến gen FLT3-ITD để Phương pháp giải trình tự gen trực tiếp<br /> hỗ trợ chẩn đoán và phân nhóm tiên lượng. (Sanger sequencing)<br /> Nhận thấy sự cần thiết của việc khảo sát đặc Phản ứng PCR gen FLT3 được thực hiện với<br /> điểm của đột biến gen FLT3-ITD ở BN BCCDT bộ hóa chất của Takara. Mỗi tube PCR<br /> để giúp định hướng phương pháp điều trị, (BN/chứng dương/chứng âm) có thể tích 20 l<br /> chúng tôi thực hiện đề tài này tại BV.Truyền chứa các thành phần: DNase-Free Water, PCR<br /> <br /> <br /> 318 Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6* 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> buffer, dNTPs (250 M cho mỗi loại), mồi xuôi polymer và capillary 50 cm (Applied<br /> 1675F và mồi ngược 2728R, Takara TaqTM Biosystems). Kết quả giải trình tự sẽ được<br /> HotStar Polymerase 1,25unit/μl và cDNA. Chu phân tích bằng phần mềm CLC Main<br /> kỳ luân nhiệt trên máy Applied Biosystems 2720 Workbench với trình tự gen FLT3 tham chiếu<br /> Thermal Cycler (Life Technologies) bao gồm là trình tự chuẩn trong cơ sở dữ liệu của NCBI<br /> 98oC trong 3 phút; theo sau là 45 chu kỳ với các để xác định kiểu đột biến, bao gồm vị trí đoạn<br /> bước luân nhiệt: 98oC trong 10 giây, 61oC trong chèn và số base (bp) được chèn vào gen FLT3.<br /> 20 giây, 72oC trong 1,5 phút; kết thúc bằng giai Phương pháp phân tách đoạn DNA (DNA<br /> đoạn kéo dài sản phẩm ở 72oC trong 5 phút; cuối fragment analysis)<br /> cùng duy trì ở 4oC.<br /> Sử dụng cDNA của các mẫu đã được xác<br /> định có đột biến gen FLT3-ITD bằng kỹ thuật<br /> giải trình tự ở trên. Các đoạn mồi dùng cho phản<br /> ứng PCR khuếch đại gen FLT3 bao gồm mồi<br /> xuôi 5’-6FAM/GC AAT TTA GGT ATG AAA<br /> GCC AGC-3’ và mồi ngược 5’-CTT TCA GCA<br /> TTT TGA CGG CAA CC-3’ được thiết kế bằng<br /> phần mềm Oligo 4.1. Mỗi tube PCR (BN/chứng<br /> dương/chứng âm) có thể tích 20 l chứa các<br /> thành phần: DNase-Free Water, PCR buffer,<br /> dNTPs (250 μM cho mỗi loại), mồi xuôi, mồi<br /> ngược, Takara TaqTM HotStar Polymerase<br /> 1,25unit/μl và cDNA.<br /> Chu kỳ luân nhiệt trên máy Applied<br /> Biosystems 2720 Thermal Cycler (Life<br /> Technologies) bao gồm 98oC trong 3 phút; theo<br /> sau là 25 chu kỳ với các bước luân nhiệt: 98oC<br /> Hình 2. Quy trình giải trình tự gen FLT3-ITD trong 10 giây, 66oC trong 40 giây, 72oC trong 1<br /> Điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose phút; kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm<br /> 1,5% có nhuộm ethidium bromide và quan sát ở 72oC trong 3 phút; cuối cùng duy trì ở 4oC.<br /> dưới hệ thống chụp ảnh Geldoc-ItTM (UVP) để Sản phẩm PCR được pha loãng với<br /> kiểm tra kết quả PCR. Sản phẩm PCR sau đó Nanopure water theo tỉ lệ 1:10, sau đó hòa tan<br /> được tinh sạch bằng illustraTM GFXTM PCR với Hi-di formamide, size standard và đọc bằng<br /> DNA and Gel Band Purification Kit (GE máy ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied<br /> Healthcare) theo hướng dẫn sử dụng của nhà Biosystems). Kết quả sẽ được phân tích bằng<br /> sản xuất. phần mềm Gene scan software (Applied<br /> Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được Biosystems) và lượng allele mang đột biến gen<br /> thực hiện phản ứng cycle sequencing với FLT3-ITD sẽ được tính theo công thức:<br /> BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit<br /> (Applied Biosystems) theo hai chiều xuôi và<br /> ngược (sử dụng mồi PCR). Sản phẩm sau đó<br /> Trong đó:<br /> được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di<br /> A: diện tích dưới đường cong của mẫu allele<br /> formamide, biến tính ở 96oC trước khi làm<br /> mang đột biến.<br /> lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng<br /> máy ABI 3500 Genetic Analyzer, với POP-7 B: diện tích dưới đường cong của mẫu allele<br /> <br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 319<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019<br /> <br /> bình thường. Số bp Lượng FLT3-<br /> STT Tuổi Giới Exon NPM1<br /> chèn ITD<br /> KẾT QUẢ 25 57 Nữ 14 57 59,1% (-)<br /> Từ 01/06/2013 đến 28/02/2019, chúng tôi có 26 26 Nữ 14 78 20,1% (+)<br /> 27 40 Nữ 14 48 19,2% (-)<br /> 36 BN BCCDT (không tính thể M3) phát hiện có<br /> 28 28 Nam 14 24 58,7% (+)<br /> đột biến gen FLT3-ITD được chọn vào nghiên<br /> 29 55 Nữ 14 24 41,1% (+)<br /> cứu này. Chẩn đoán tủy đồ chiếm đa số là thể 30 49 Nam 14 48 46,2% (+)<br /> M2 (58,3%), kế tiếp là M4 (30,5%) và không có 31 35 Nam 14 36 66% (+)<br /> trường hợp nào là M0, M6 và M7 (Bảng 1). Tuổi 32 47 Nam 14 51 33,7% (-)<br /> trung bình là 45,3 tuổi (từ 20-68 tuổi). Có 15 BN 33 36 Nam 14 84/81 59% (+)<br /> nam và 21 BN nữ. Tỉ lệ nam:nữ là 1:1,4 (Bảng 2). 34 27 Nam 14 108 38,2% (+)<br /> 35 56 Nữ 14 21 48,2% (-)<br /> Bảng 1. Sự phân phối nhóm bệnh BCCDT có đột biến 36 34 Nữ 14 57 43,5% (+)<br /> gen FLT3-ITD được chẩn đoán dựa trên tủy đồ<br /> Kết quả ở Bảng 2 cho thấy tất cả 36 BN đều<br /> Chẩn đoán Số lượng Tỉ lệ<br /> M0 0 0%<br /> có đột biến lặp đoạn nhưng bảo tồn khung đọc,<br /> M1 2 5,6% kích thước đoạn lặp thay đổi, ngắn nhất là 3 bp<br /> M2 21 58,3% (1 acid amin) và dài nhất là 108 bp (36 acid<br /> M4 11 30,5% amin). Số lượng đoạn lặp hầu hết là 1 đoạn và vị<br /> M5 2 5,6% trí đoạn lặp chỉ gặp ở vùng cận màng, chưa phát<br /> M6 0 0%<br /> hiện ở vị trí khác. Hơn nữa, chúng tôi cũng tiến<br /> M7 0 0%<br /> hành so sánh số bp chèn vào gen FLT3 theo kỹ<br /> Tổng số 36 100%<br /> thuật giải trình tự với kỹ thuật phân tách đoạn<br /> Bảng 2. Kết quả đột biến gen FLT3-IT<br /> DNA, kết quả cho thấy số bp chèn là giống nhau<br /> Số bp Lượng FLT3-<br /> STT Tuổi Giới Exon NPM1 ở cả 2 kỹ thuật trên tất cả 36 BN (Hình 3).<br /> chèn ITD<br /> 1 68 Nam 14 24 19,2% (-)<br /> 2 44 Nữ 14 54 34,8% (-)<br /> 3 52 Nữ 14 39 36,8% (-)<br /> 4 50 Nữ 14 60 42,4% (+)<br /> 5 42 Nam 14 60 15,1% (+)<br /> 6 53 Nam 14 45 44,4% (+)<br /> 7 58 Nam 14 45 39,1% (+)<br /> 8 39 Nữ 14 48 30% (-)<br /> 9 60 Nam 14 54 41,8% (+)<br /> 10 64 Nữ 14 27 47,8% (+)<br /> 11 48 Nữ 15 81 37,1% (-)<br /> 12 28 Nữ 14 60 46,8% (-)<br /> 13 51 Nữ 14 24 63,4% (-)<br /> 14 48 Nam 14 15 52,6% (-)<br /> 15 49 Nữ 14 42 51,6% (-)<br /> 16 20 Nữ 14 21 53,7% (+)<br /> 17 48 Nữ 14 21 61,2% (+)<br /> 18 53 Nữ 14 24 100% (+)<br /> 19 52 Nam 14 63 34,1% (+)<br /> Code Sample File Name Allele Size (bp) Height Area<br /> 20 59 Nam 14 84 43,9% (-)<br /> 9336 frag_002_F08.fsa 33 239 6171 4131<br /> 21 25 Nữ 14 90 10,8% (-)<br /> 9336 frag_002_F08.fsa OL 260 5711 4343<br /> 22 39 Nữ 14 90 33,5% (-)<br /> 23 44 Nam 14 90 53,6% (+) Hình 3. So sánh số bp chèn vào gen FLT3 bằng kỹ<br /> 24 46 Nữ 14 3 44,3% (-) thuật giải trình tự gen và kỹ thuật phân tách đoạn DNA<br /> <br /> <br /> <br /> 320 Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6* 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Phân tách đoạn DNA là 1 kỹ thuật điện di có ít nhất 1 trong 2 đặc điểm là số bp được chèn vào<br /> độ phân giải cao, có thể phân tách được các đoạn gen FLT3 ≥ 70bp và/ hoặc lượng allele mang đột<br /> DNA có kích thước hơn kém nhau 1 bp. Trong biến gen FLT3-ITD ≥50%; trong đó, có 2 BN<br /> nghiên cứu này, 01 trường hợp có số bp chèn mang cả 2 đặc điểm trên.<br /> vào ngắn (Hình 4) được phát hiện dễ dàng và Bảng 3. Đặc điểm đột biến gen FLT3-ITD trong mẫu<br /> chính xác. khảo sát<br /> Đặc điểm Giá trị<br /> Số bp được chèn vào < 70bp 77,8% (n=28)<br /> gen FLT3 ≥ 70bp 22,2% (n=8)<br /> Lượng allele mang đột < 50% 69,4% (n=25)<br /> biến ≥ 50% 30,6% (n=11)<br /> Số bp được chèn vào gen FLT3 < 70bp và<br /> 52,8% (n=19)<br /> lượng allele mang đột biến