Khảo sát khả năng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của cao chiết lá hương nhu tía (ocimum sanctum) trên chuột nhắt

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CẢI THIỆN SỰ SUY GIẢM TRÍ NHỚ<br /> CỦA CAO CHIẾT LÁ HƯƠNG NHU TÍA (OCIMUM SANCTUM)<br /> TRÊN CHUỘT NHẮT<br /> Trần Đình Năng*, Nguyễn Hoàng Giao*, Dương Phước An*, Nguyễn Thị Thu Vân*,<br /> Trần Phi Hoàng Yến*<br /> <br /> TÓMTẮT<br /> Đặt vấn đề: Hoạt tính chống oxy hóa và khả năng bảo vệ tế bào não của Hương nhu tía Ocimum<br /> Sanctum Lamiaceae đã được chứng minh in vivo(4). Tuy nhiên, cho đến nay sự khảo sát về khả năng bảo vệ<br /> sự suy giảm việc học tập và ghi nhớ của Hương nhu tía vẫn chưa được thực hiện.<br /> Mục tiêu: Đánh giá tác dụng bảo vệ sự suy giảm khả năng học tập và ghi nhớ của cao chiết toàn phần<br /> từ lá cây Hương nhu tía (HNT) trên chuột nhắt.<br /> Phương pháp: Sử dụng mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin (TMT) để đánh giá khả năng<br /> bảo vệ sự suy giảm việc học hỏi và ghi nhớ của cao chiết lá HNT thông qua mô hình Morris Water Maze<br /> (MWM) và việc xác định các chỉ số sinh hóa (acetylcholine và acetylcholinesterase).<br /> Kết quả: Hai liều cao chiết toàn phần từ cây HNT (50 mg/kg, và 100 mg/kg, p.o x 14 ngày) đều thể<br /> hiện khả năng bảo vệ tác dụng gây suy giảm việc học tập và ghi nhớ do TMT liều duy nhất (TMT 2,4 mg/kg,<br /> i.p) thông qua 3 thử nghiệm của mô hình MWM: Thử nghiệm ẩn chân đế (Hidden Platform Test, p < 0,001<br /> khi so giữa nhóm TMT với HNT1 + TMT hoặc nhóm HNT2 + TMT); thử nghiệm thăm dò (Probe Test, p <<br /> 0,01 khi so giữa nhóm TMT và HNT1 +TMT hoặc nhóm HNT2 +TMT); và thử nghiệm trí nhớ hoạt động<br /> (Working Memory Test, p < 0,05 khi so giữa nhóm TMT với HNT1 + TMT; p < 0,01 khi so giữa nhóm TMT<br /> với nhóm HNT2 + TMT). Kết quả định lượng acetylcholine (Ach) và acetylcholinesterase (AchE) trong<br /> vùng hải mã cũng tương ứng với kết quả đạt được từ các thử nghiệm hành vi. Cả hai liều thử nghiệm cao<br /> chiết HNT đều thể hiện khả năng phục hồi sự giảm nồng độ Ach (p < 0,01) và sự gia tăng AchE (p < 0,01)<br /> do TMT gây ra.<br /> Kết luận: cao chiết toàn phần từ lá HNT thể hiện khả năng bảo vệ sự suy giảm khả năng học tập và ghi<br /> nhớ qua mô hình MWM và hiệu quả này có liên quan đến hệ cholinergic, làm tăng hàm lượng Ach và giảm<br /> hoạt tính AchE trong vùng hải mã não chuột.<br /> Keywords: Trimethyltin, suy giảm học hỏi và ghi nhớ, acetylcholine, Hương nhu tía<br /> <br /> ABSTRACT<br /> STUDY ON AMELIORATE OF MEMORY IMPAIRMENTS<br /> OF HUONG NHU TIA (OCIMUM SANCTUM) EXTRACT IN MICE<br /> Tran Dinh Nang, Nguyen Hoang Giao, Duong Phuoc An, Nguyen Thi Thu Van, Tran Phi Hoang Yen<br /> *Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 124 - 129<br /> Background: Antioxidant activity and neuroprotective effect of Ocimum Sanctum was investigated in<br /> vivo . However, study on role of the leaf of Ocimum Sanctum in impairments of learning and memory is<br /> not carried out until now.<br /> (4)<br /> <br /> *<br /> <br /> Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: TS. Trần Phi Hoàng Yến ĐT: 0937878365<br /> <br /> 124<br /> <br /> Email: tranyen73@gmail.com<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Objective: Evaluate role of the leaf of Ocimum Sanctum extract of learning and memory impairments<br /> in mice.<br /> Methods: Trimethyltin (TMT) model for learning and memory impairments to evaluate the effect of<br /> Ocimum Sanctum extract (HNT) using Morris Water Maze (MWM) protocol and biochemical detection<br /> (Acetylcholine và Acetylcholinesterase).<br /> Results: Two doses of HNT (HNT1, 50 mg/kg and HNT2, 100 mg/kg, p.o x 14 days) prove the<br /> protective role in learning and memory impairments caused by TMT one dose exposure (2.4 mg/kg, i.p) by<br /> evaluation of MWM: Hidden Platform Test (p < 0.001 as compared between TMT and HNT1 + TMT or<br /> HNT2 + TMT group); Probe Test (p < 0.01 as compared between TMT and HNT1 +TMT or HNT2 +TMT<br /> group); and Working Memory Test (p < 0.05 as compared between TMT and HNT1 + TMT; p < 0.01 as<br /> compared between TMT and HNT2 + TMT). Results in acetylcholine (Ach) content and<br /> Acetylcholinesterase (AchE) activity are correlated to results in behavior study. Two doses of HNT<br /> ameliorate the decreases in Ach content and increases in AchE activity caused by TMT.<br /> Conclusion: Results demonstrated role of HNT in impairments of learning and memory using MWM<br /> test. This result correlates to cholinergic response, by increases in Ach content (p < 0.01) and decreases in<br /> AchE activity (p < 0.01) in hippocampus of mice.<br /> Keywords: Trimethyltin, learning and memory impairments, acetylcholine, Ocimum sanctum Lamiaceae<br /> <br /> ĐẶTVẤN ĐỀ<br /> <br /> VẬTLIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Hương nhu tía (HNT) còn gọi é tía có tên<br /> khoa<br /> <br /> học<br /> <br /> Ocimum<br /> <br /> tenuiflorum<br /> <br /> (Ocimum<br /> <br /> Cao chiết toàn phần HNT<br /> <br /> trong những dược liệu đã được sử dụng từ<br /> <br /> Cao chiết ethanol toàn phần từ cây HNT<br /> được chiết dựa trên phương pháp chiết ngấm<br /> kiệt theo tài liệu đã được công bố(3).<br /> <br /> rất lâu đời, có thành phần hóa học chủ yếu là<br /> <br /> Chuột thử nghiệm<br /> <br /> các polyphenol và flavonoid. HNT đã được<br /> <br /> Chuột nhắt trắng (đực) giống Swiss albino,<br /> trọng lượng 22 - 24 gam (khoảng 5 - 6 tuần<br /> tuổi), do Viện Vắc Xin và Sinh phẩm Y Tế Nha<br /> Trang cung cấp.<br /> <br /> sanctum) họ Hoa môi (Lamiaceae) là một<br /> <br /> chứng minh có các tác dụng chống oxy hóa,<br /> chống stress, kháng viêm, kháng khuẩn(1,2)…<br /> Đặc biệt, các tác dụng chống stress oxy hóa<br /> đã được thực hiện trên não, sử dụng mô hình<br /> gây stress bằng tiếng ồn, thông qua với kết<br /> quả khả quan do nhóm J. Samson và cộng sự<br /> thực hiện(4). Trên cơ sở đó, nghiên cứu này<br /> được thực hiện nhằm khảo sát khả năng cải<br /> <br /> Nguyên liệu, hóa chất khảo sát<br /> Coomassie [Bradford] (Thermo fisher<br /> Scientific); Amplex® Red Acetylcholine/<br /> Acetylcholinesterase Assay Kit (A12217InvitrogenTM/ Molecular Probe).<br /> <br /> (MWM) và thông qua việc xác định nồng độ<br /> <br /> Máy đo phổ hấp thu U-1900 UV/VIS<br /> Spectrophotometer 200V (HITACHI), máy<br /> Elisa (Thermo Electron) và máy nghiền đồng<br /> thể SONICATOR 3080 (USA).<br /> <br /> Ach và hoạt tính enzym AchE, các thông số<br /> <br /> Thử nghiệm Morris Water Maze<br /> <br /> liên quan đến hoạt động của hệ cholinergic,<br /> <br /> Là thử nghiệm dùng để đánh giá trí nhớ<br /> dài hạn trên chuột nhắt trắng. Hồ bơi có kích<br /> thước 1500 x 80 (cm) (đường kính x chiều cao),<br /> chân đế kích thước 10 x 25 (cm) (đường kính x<br /> <br /> thiện sự suy giảm trí nhớ thông qua mô hình<br /> thử nghiệm hành vi Morris Water Maze<br /> <br /> một hệ thống có vai trò rất quan trọng trong<br /> sự hình thành và duy trì trí nhớ.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> 125<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> chiều cao). Hồ bơi được đặt ở một nơi có màn<br /> che kín, trên tấm màn che này có đặt những<br /> hình vẽ với hình thù bất kỳ tại 4 góc hồ bơi.<br /> <br /> Nhiệt độ của hồ bơi phải nằm trong khoảng 27<br /> ± 2 0C trong suốt thử nghiệm(4). Thử nghiệm<br /> mê cung bơi gồm 8 ngày thử nghiệm như sau:<br /> <br /> Hình 1a. Sơ đồ bố trí thí nghiệm<br /> <br /> Hình 1b. Sơ đồ bố trí thử nghiệm mô hình Morris Water Maze<br /> - Chuột được chia làm 6 nhóm,, mỗi nhóm<br /> từ 8-10 con, thể tích tiêm hoặc uống thuốc là<br /> 0,1 µl/ 1 gam chuột):<br /> + Nhóm 1: Saline (Nước muối sinh lý, Sal.;<br /> n = 8)<br /> + Nhóm 2: TMT (2,4 mg/kg, i.p; liều duy<br /> nhất, n = 10)<br /> + Nhóm 3: HNT1 (50 mg/kg, p.o x 14 ngày;<br /> n = 10) + TMT 2,4 mg/kg, i.p<br /> + Nhóm 4: HNT2 (100 mg/kg, p.o x 14<br /> ngày; n = 10)+TMT 2,4 mg/kg, i.p<br /> + Nhóm 5: Memantine (MEM 2 mg/kg, i.p<br /> x 10 ngày; n = 10) + TMT 2,4 mg/kg, i.p<br /> + Nhóm 6: Galantamin (Gal. 10 mg/ kg x 10<br /> ngày, n = 10) + TMT 2,4 mg/kg, i.p<br /> <br /> 126<br /> <br /> Định lượng Ach và AchE<br /> Nguyên tắc<br /> Sử dụng kit Amplex Red™ để định lượng<br /> Ach và AchE thông qua trung gian enzyme<br /> choline oxidase xúc tác các phản ứng. Ach sẽ<br /> bị enzyme AchE chuyển thành choline, sau đó<br /> nó bị choline oxidase oxi hóa thành betain và<br /> H2O2. Dưới sự xúc tác của horseradish<br /> peroxidase (HRP), H2O2 phản ứng với 10–<br /> cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red<br /> reagent) tạo chất có màu hồng. Đo cường độ<br /> huỳnh quang ở 563 nmCường độ huỳnh<br /> quang của Amplex Red™ tỷ lệ thuận với nồng<br /> độ Ach và AchE. Kết quả được biểu diễn là số<br /> nmol Ach/ mg protein và số mU AchE hoạt<br /> động/ mg protein.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> Xử lý và phân tích số liệu<br /> Số liệu được biểu diễn dưới dạng Mean ±<br /> SEM. Sử dụng phương pháp phân tích<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> ANOVA 1 hoặc 2 yếu tố với Fisher’s PLST test.<br /> Ý nghĩa thống kê được xác định khi p < 0,05.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> <br /> Hình 2. Sự thay đổi về thời gian tìm thấy chân đế giữa nhóm chứng (Sal., n = 6) và các nhóm tiêm TMT<br /> (TMT 2,4 mg/kg, i.p, liều duy nhất, n = 6) có hoặc không có điều trị với cao chiết HNT (HNT1 50 mg/kg,<br /> p.o x 14 ngày + TMT2,4 mg/kg, i.p, liều duy nhất, HNT2 100 mg/kg, p.o x 14 ngày + TMT2,4 mg/kg, i.p,<br /> liều duy nhất, n = 6) hoặc memantine (MEM 2 mg/kg, i.p x 10 ngày + TMT 2,4 mg/kg, i.p, liều duy nhất).<br /> ap < 0,001 khi so với nhóm chứng. bp < 0,001 khi so với nhóm TMT (Sử dụng phương pháp phân tích<br /> phương sai 2 yếu tố với Fisher’s PLST test).<br /> <br /> Hình 3. Sự thay đổi về số lần chuột bơi qua chân đế (Hình 3A) và thời gian chuột tìm thấy chân đế (Hình<br /> 3B) giữa nhóm chứng (Sal., n = 6) và các nhóm tiêm TMT (sau 7 ngày, n = 6) có hoặc không có điều trị với<br /> cao chiết HNT (HNT1 50 mg/kg, p.o + TMT, HNT2 100 mg/kg, p.o + TMT, n = 6) hoặc memantine (MEM<br /> 2 mg/kg, i.p x 10 ngày). ap < 0,01 khi so với nhóm chứng, bp < 0,05, bbp < 0,01 khi so với nhóm TMT (Sử<br /> dụng phương pháp phân tích phương sai 1 yếu tố với Fisher’s PLST test).<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> 127<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> Nhận xét<br /> <br /> Sử dụng mô hình MWM để đánh giá vai<br /> trò của cao chiết lá HNT đối với sự suy giảm<br /> việc học tập và ghi nhớ do TMT gây ra, một số<br /> kết quả đã được ghi nhận:<br /> Khi so với nhóm Sal., nhóm TMT làm suy<br /> giảm khả năng học và nhớ của chuột thông<br /> qua sự gia tăng thời gian tìm thấy chân đế<br /> trong thử nghiệm ẩn chân đế (HPT) và thử<br /> nghiệm trí nhớ hoạt động (WMT). Ngoài ra,<br /> nhóm TMT còn làm giảm số lần chuột bơi qua<br /> chân đế trong thử nghiệm đánh giá (Probe<br /> Test).<br /> Điều trị với HNT 7 ngày trước và sau khi<br /> tiêm TMT, cả 2 liều 50 mg/kg và 100 mg/kg<br /> đều làm giảm thời gian tìm thấy chân đế so với<br /> <br /> nhóm TMT trong HPT và WMT. Tuy nhiên,<br /> chưa có sự gia tăng tuyến tính giữa 2 liều thử<br /> nghiệm.<br /> Nhóm đối chứng dương được điều trị với<br /> MEM, một chất đã được sử dụng trong điều trị<br /> bệnh alzheimer từ mức độ nhẹ tới nặng, sử<br /> dụng liều 2 mg/kg, 3 ngày trước và 7 ngày sau<br /> khi tiêm TMT cho thấy có khả năng bảo vệ sự<br /> tổn thương hoạt động học và nhớ trên chuột<br /> thực nghiệm do TMT gây ra.<br /> Khi so với khả năng hồi phục trí nhớ của<br /> MEM, nhóm điều trị với HNT gần như không<br /> có sự khác biệt, điều này chứng tỏ khả năng<br /> hồi phục sự tổn thương trí nhớ của cao chiết<br /> HNT gần tương đương với nhóm chứng<br /> dương trong điều kiện thử nghiệm.<br /> <br /> 4<br /> <br /> B. Acetylcholinesterase<br /> <br /> bb<br /> <br /> 3.5<br /> 3<br /> 2.5<br /> <br /> b,cc<br /> <br /> 2<br /> 1.5<br /> <br /> b,cc<br /> <br /> a<br /> <br /> 1<br /> 0.5<br /> 0<br /> <br /> Hoạt tính AchE (mU/mg protein)<br /> <br /> Nồng độ Ach (nmole/mg protein)<br /> <br /> A. Acetylcholine<br /> 25<br /> <br /> a<br /> <br /> 20<br /> 15<br /> 10<br /> <br /> b,c<br /> <br /> 5<br /> <br /> b,c<br /> <br /> bb<br /> <br /> 0<br /> <br /> S al.<br /> <br /> TMT<br /> <br /> Gal.<br /> <br /> HNT1 HNT2<br /> <br /> S al.<br /> <br /> TMT<br /> <br /> Gal.<br /> <br /> HNT1 HNT2<br /> <br /> Hình 4. Ảnh hưởng của cao chiết HNT trên sự thay đổi nồng độ Ach (hình 4A) và nồng độ AchE (hình 4B),<br /> sử dụng mô hình TMT. ap < 0,001 khi so với nhóm chứng. bp < 0,01, bbp < 0,001 khi so với nhóm TMT, cp <<br /> 0,05, ccp < 0,001 khi so với nhóm Gal.<br /> giảm hoạt tính enzyme AchE tương đương với<br /> Nhận xét<br /> nhóm chứng.<br /> TMT làm giảm nồng độ Ach và tăng nồng<br /> Có sự khác biệt có ý nghĩa khi so giữa<br /> độ AchE khi so với nhóm chứng.<br /> nhóm Gal. và các nhóm có điều trị bằng cao<br /> Nhóm HNT1 và HNT2 đều làm tăng nồng<br /> chiết toàn phần HNT.<br /> độ Ach giảm nồng độ AchE khi so với nhóm<br /> Bàn luận<br /> TMT.<br /> Cao chiết lá Hương nhu tía (HNT) (7 ngày<br /> Nhóm chứng dương Gal., là chất đối<br /> trước và sau khi tiêm TMT liều duy nhất) có<br /> chứng dương Gal., chất ức chế cholinesterase,<br /> khả<br /> năng bảo vệ sự suy giảm việc học hỏi và<br /> thể hiện khả năng làm tăng nồng độ Ach và<br /> ghi nhớ trên chuột thực nghiệm qua mô hình<br /> <br /> 128<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br />