intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chi42 vào cây lạc (Arachis hypogaea L.) qua trung gian Agrobacterium tumefaciens

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:14

Thêm vào BST
Báo xấu
9
lượt xem 2
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này, lá mầm chứa phôi của cây lạc được sử dụng làm mẫu vật chuyển gen từ chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang vector pMVY719/chi42. Sự tích hợp gen chuyển vào bộ gen cây lạc được đánh giá bằng PCR.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chi42 vào cây lạc (Arachis hypogaea L.) qua trung gian Agrobacterium tumefaciens

  1. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 22, Số 2 (2023) KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CHUYỂN GEN Chi42 VÀO CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) QUA TRUNG GIAN Agrobacterium tumefaciens Nguyễn Hoàng Tuệ1, Lục Hoàng Linh1, Lê Thị Hằng1, Huỳnh Thị Quỳnh Trang1, Nguyễn Xuân Huy2, Phùng Thị Bích Hòa1,3* 1 Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế 2 Ban Khoa học Công nghệ và Quan hệ Quốc tế, Đại học Huế 3 Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế *Email: ptbhoa@hueuni.edu.vn Ngày nhận bài: 02/8/2022; ngày hoàn thành phản biện: 29/8/2022; ngày duyệt đăng: 4/4/2023 TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, lá mầm chứa phôi của cây lạc được sử dụng làm mẫu vật chuyển gen từ chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang vector pMVY719/chi42. Sự tích hợp gen chuyển vào bộ gen cây lạc được đánh giá bằng PCR. Kết quả cho thấy các mẫu vật được tiền nuôi cấy 3 ngày, có bổ sung acetosyringone ở nồng độ 200 µM và thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày thích hợp cho sự biến nạp gen vào lá mầm chứa phôi của giống lạc L14. Mật độ vi khuẩn ở OD600 = 1,0 cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất. Cefotaxime 250 mg/L thích hợp cho việc loại bỏ Agrobacterium khỏi mô lá mầm và và kanamycin 100 mg/L thích hợp cho việc sàng lọc mô chuyển gen. Kết quả này là tiền đề để hoàn thiện quy trình chuyển gen chi42 vào giống lạc L14 nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Arachis hypogaea, biến nạp gen, gen chi42, Trichiderma asperellum. 1. MỞ ĐẦU Lạc (Arachis hypogaea L.) là loại cây trồng kinh tế, lấy dầu và thức ăn chăn nuôi quan trọng trên thế giới [1, 2]. Việc trồng lạc mặc dù mang lại nguồn thu lớn cho nông dân nhưng cũng gặp không ít khó khăn do các loại nấm bệnh gây ra. Trong những năm gần đây, bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm Sclerotium rolfsii đã trở thành một mối đe dọa lớn đối với sản xuất lạc, đây là một loại bệnh lây truyền qua đất có sức tàn phá mạnh ở các vùng trồng lạc trên khắp thế giới. S. rolfsii chủ yếu gây hại phần gốc thân của cây lạc làm cho toàn bộ cây bị héo và chết. Trong thời kỳ lây nhiễm, S. rolfsii hình thành một 103
  2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chi42 vào cây lạc (Arachis hypogaea L.) … số lượng lớn các sợi nấm màu trắng và hạch nấm màu nâu sẫm làm lây lan nhanh chóng trên đồng ruộng, làm giảm năng suất lạc từ 10% – 80% [3-5]. Hơn nữa, S. rolfsii là một vật chủ có phổ gây bệnh rộng có thể lây nhiễm cho hơn 500 loại cây trồng khác nhau [6- 9]. Hiện nay, nhiều quy trình chuyển gen đã được áp dụng đối với cây lạc để tạo ra giống lạc có khả năng kháng nấm [10-12]. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen thay đổi phụ thuộc vào giống cây nhận gen, gen chỉ thị chọn lọc và chủng Agrobacterium [13], nên việc nghiên cứu tối ưu hóa để xác định các thông số thích hợp để chuyển gen trên một giống lạc cụ thể trước khi tiến hành là thực sự cần thiết. Quá trình biến nạp gen qua trung gian Agrobacterium tumifaciens muốn có hiệu quả cao đòi hỏi phải tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình biến nạp của T-DNA. Mục đích của nghiên cứu này nhằm tối ưu hóa một số yếu tố chính như thời gian tiền nuôi cấy, thời gian đồng nuôi cấy, thời gian lây nhiễm, mật độ vi khuẩn, nồng độ acetosyringone, nồng độ cefotaxime và nồng độ kanamycin ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chi42 mã hóa chitinase 42 kDa từ Trichoderma asperellum qua trung gian vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang pMYV719/Chi42 có sử dụng gen đánh dấu nptII trên giống lạc L14, làm tiền đề để hoàn thiện quy trình chuyển gen tạo ra giống lạc có khả năng kháng nấm S. rolfsii trong các nghiên cứu tiếp theo. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Giống lạc (Arachis hypogaea L.) L14 do Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 chứa vector biểu hiện thực vật pMYV719 mang gen Chi42 mã hóa chitinase 42 kDa [14] (Hình 1). Gen Chi42 (NCBI: HM191683.1) mã hóa chitinase 42 kDa là gen hoang dại từ T. asperellum SH16 [15] có chèn trình tự peptide tín hiệu, tổng chiều dài khoảng 1,3 kb được tổng hợp và tạo dòng trong vector pUC19 [16] bởi Công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam). Hình 1. Cấu trúc của vector pMYV719/chi42. LB và RB: biên trái và phải của vùng T-DNA, NosP: promoter của gen nopaline synthase, NPTII: gen neomycin từ T. asperellum SH16 104
  3. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 22, Số 2 (2023) 2.2. Phương pháp nghiên cứu Biến nạp thông qua Agrobacterium Chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang vector pMYV719/chi42 được nuôi trên môi trường LB (Luria–Bertani) rắn có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 µg/mL spectinomycin và 100 µg/mL kanamycin trong tối, ở 280C, 2 ngày. Tạo dịch huyền phù A. tumefaciens bằng dung dịch ½ MS OD600 0,5 – 1,5. Tiếp đó bổ sung 200 µM acetosyringone và ủ trong tối khoảng 1 giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ trước khi tiến hành chuyển gen vào cây lạc. Hạt lạc khô được rửa sạch dưới dòng nước chảy trong 10 – 15 phút, sau đó khử trùng bề mặt bằng sodium hypochlorite (NaOCl) 65% (w/v) trong 10 phút. Mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần và ngâm trong nước cất vô trùng 24 giờ trong tối. Sau đó hạt được loại bỏ vỏ lụa và tách đôi theo chiều dọc để lấy phần lá mầm có phôi. Các thí nghiệm tái sinh được tiến hành trên môi trường TDT có thành phần là môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) [17] bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, 66,6 µM BAP và 9,1 µM 2,4-D, pH 5,8. Mẫu lá mầm có phôi được tiền nuôi cấy 0 – 3 ngày trên môi trường TDT trong tối. Sau đó, mẫu được lây nhiễm với dung dịch huyền phù A. tumefaciens LBA4404 mang vector pMYV719/chi42 trong 10 – 30 phút ở OD600 từ 0,5 – 1,5 có lắc nhẹ bằng tay. Sau đó các mẫu cấy được thấm khô trên giấy thấm vô trùng và đồng nuôi cấy trên môi trường TDT có bổ sung 25 – 250 µM acetosyringone ở 25 ± 20C trong 1 – 5 ngày trong tối. Sau khi đồng nuôi cấy, các mẫu cấy được chuyển sang môi trường TDT có bổ sung 50 – 150 mg/L kanamycin để sàng lọc các mẫu chuyển gen và 100 – 300 mg/L cefotaxime để loại vi khuẩn Agrobacterium. Các chồi sau khi sàng lọc được nhân lên trên môi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, 8,9 µM BAP và 0,6 µM IAA. Trừ giai đoạn xử lý vi khuẩn Agrobacterium, tất cả các bước đều được nuôi cấy trong ống nghiệm và duy trì ở 25 ± 20C trong 4 tuần ở cường độ ánh sáng 2000 – 3000 lux và 16 giờ chiếu sáng/ngày. Ở mỗi nghiệm thức theo dõi 50 mẫu, đánh giá tỉ lệ mẫu tạo chồi (%), tỉ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc và sạch khuẩn bằng phương pháp đếm. Khuếch đại PCR DNA tổng số từ lá cây lạc chuyển gen in vitro được tách chiết bằng phương pháp CTAB [18]. Khuếch đại PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho gen Chi42 (Bảng 1). Thành phần phản ứng PCR gồm có 20 ng DNA tổng số 10 pmol mỗi mồi, 1 µL PCR Master Mix (Thermo Scientific), bổ sung nước cất để đạt thể tích phản ứng cuối cùng là 12 µL. Phản ứng PCR được thực hiện với chu trình nhiệt như sau: biến tính gen ở 95°C/15 phút; 30 chu kỳ tiếp theo: 95°C/1 phút, 55°C/1 phút và 72°C/1 phút; hoàn chỉnh sản phẩm PCR ở 72°C/10 phút. 105
  4. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chi42 vào cây lạc (Arachis hypogaea L.) … Bảng 1. Trình tự nucleotide của các mồi đặc hiệu của gen Chi42 dùng trong khuếch đại PCR Primer Trình tự nucleotide 5’- 3’ Kích thước sản phẩm PCR (bp) Chi42-F TGGTACTATGCAGCTTGACCT 505 Chi42-R GTACTCCCAGTCGACGTCAA Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng chương trình thống kê trong Excel 2010 và phương pháp phân tích Duncan’s test (p 3 ngày đã làm giảm tỷ lệ mẫu tạo chồi (16,3%) (Hình 2-a). Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Athmaram và cs (2006) [21], Mayavan và cs (2013) [20] và Subramanyam và cs (2013) [22] đều cho rằng thời gian tiền nuôi cấy 3 ngày cho hiệu quả biến nạp gen cao nhất. 3.2. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn Mật độ vi khuẩn ở OD600 = 1,0 cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (80,5%), tỷ lệ mẫu sống sót và sạch khuẩn (70,12%) cao nhất (Hình 2-b). Mật độ vi khuẩn Agrobacterium trong dịch huyền phù đóng vai trò quan trọng trong biến nạp gen. Theo Rohini và Rao (2000), OD600 = 1,0 là giá trị tối ưu cho sự biến nạp của toàn bộ hạt lạc khử phôi của giống lạc TMV-2 [23]. 106
  5. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 22, Số 2 (2023) a. Thời gian tiền nuôi cấy (ngày) b. Mật độ vi khuẩn (OD600) c. Thời gian lây nhiễm (phút) d. Thời gian đồng nuôi cấy (ngày) e. Nồng độ acetosyrigone (µM) f. Nồng độ kanamycin (mg/L) Hình 2. (a-f) Ảnh hưởng của các yếu tố đến tỉ lệ lá mầm có phôi tạo chồi và sống sót ở giống lạc L14 qua biến nạp trung gian A. tumfaciens. 3.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian lây nhiễm cũng ảnh hưởng rõ rệt đến sự sống sót và tái sinh chồi của các mẫu vật. Thời gian lây nhiễm 20 phút có tỉ lệ mẫu sống 107
  6. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chi42 vào cây lạc (Arachis hypogaea L.) … sót trên môi trường chọn lọc cao nhất, đạt 31,8% (Hình 2-c). Mặc dù thời gian lây nhiễm dài cho phép nhiều vi khuẩn bám vào bề mặt vết thương hơn, do đó cải thiện cơ hội đưa gen chuyển vào bộ gen mẫu. Tuy nhiên, việc tăng thời gian lây nhiễm kéo dài hơn 20 phút làm mẫu cấy bị nhiễm quá nhiều vi khuẩn và mẫu sẽ bị chết trong thời gian đồng nuôi cấy, dẫn đến không thể tái sinh chồi, từ đó giảm hiệu suất biến nạp (Hình 3-f) [24]. Do đó, chúng tôi đã sử dụng thời gian lây nhiễm 20 phút trong các thí nghiệm tiếp theo. 3.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy Ba ngày đồng nuôi cấy cho tỉ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc đạt 24,3% và tỉ lệ mẫu tạo chồi cao nhất (32,6%) (Hình 2-d). Trong quá trình đồng nuôi cấy, T-DNA giải phóng từ vi khuẩn Agrobacterium và tích hợp vào bộ gen của tế bào thực vật trong một thời gian quy định và thời gian này phụ thuộc vào các loài thực vật và chủng vi khuẩn Agrobacterium được sử dụng để lây nhiễm [25]. Hiệu quả biến nạp gen ở cây lạc tăng thêm 9,8 – 13,8% khi đồng nuôi cấy trong 3 ngày so với đồng nuôi cấy trong thời gian 1 – 2 ngày (Hình 2-d). Tuy nhiên, sau 3 ngày đồng nuôi cấy, mật độ cao của vi khuẩn Agrobacterium dẫn đến hóa nâu các mô, hạn chế sự nảy mầm của mẫu cấy và phục hồi không thành công các tế bào đã biến nạp. Các nghiên cứu tương tự đã được thực hiện bởi Mayavan và cộng sự (2013) ở cây mía, kết quả cho thấy hiệu suất biến nạp tăng dần lên và hiệu suất biến nạp cao nhất (24,2%) sau khi đồng cấy mẫu cấy trong 3 ngày; tuy nhiên, thời gian đồng nuôi cấy hơn 3 ngày, hiệu suất biến nạp giảm do sự phát triển quá mức của vi khuẩn Agrobacterium [20]. Manickavasagam và cộng sự (2015) cũng báo cáo tầm quan trọng của việc tối ưu thời gian (3 ngày) đồng nuôi cấy để nâng cao hiệu quả biến nạp gen cho đậu bắp [26]. Park và cộng sự (2005), Chen và cộng sự (2010) cũng báo cáo rằng nuôi cấy trong 3 ngày đã cải thiện hiệu quả biến nạp gen ở củ cải và cỏ [27, 28]. 3.5. Ảnh hưởng của acetosyringone (AS) Lựa chọn nồng độ acetosyringone tối ưu đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu suất biến nạp gen. Trong nghiên cứu này, các nồng độ AS khác nhau (25 – 250 µM) đã được thử nghiệm. Kết quả cho thấy, tỷ lệ mẫu tạo chồi (27,3 – 36,5%), tỷ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc (15,3 – 24,6%) được cải thiện khi tăng đều đặn nồng độ AS từ 0 – 200 µM (Hình 2-e). Ở nồng độ 200 µM AS cho tỉ lệ mẫu tạo chồi và sống sót cao nhất (lần lượt là 36,5% và 24,6%) (Hình 2-e). Bổ sung AS trong môi trường xâm nhiễm và đồng nuôi cấy vượt quá 200 µM dẫn đến giảm dần hiệu suất biến nạp (Hình 2-e). Nghiên cứu của Ashutosh và cộng sự (2012) cho rằng, nồng độ AS thích hợp nâng cao hiệu quả biến nạp gen ở các loài thực vật [29]. Tiwari và cộng sự (2015) đã cho rằng, nồng độ 200 µM AS là tối ưu cho hiệu quả biến nạp và tái sinh chồi cao ở mẫu lá mầm khử phôi của cây lạc [30]. 108
  7. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 22, Số 2 (2023) Hình 3. Chuyển cấu trúc mang gen Chi42 qua A. tumefaciens và hệ thống tái sinh lá mầm có phôi. A: Hạt lạc sau khi khử trùng, tách bỏ vỏ lụa, tách đôi hạt lấy phần lá mầm có phôi làm vật liệu chuyển gen, B: Lá mầm có phôi trên môi trường TDT có bổ sung 100 mg/L kanamycin và 250 mg/L cefotaxime sau 1 tuần biến nạp gen, C: Cụm chồi hình thành từ lá mầm có phôi sau 2 tuần biến nạp gen, D: Chồi sống sót trên môi trường kéo dài chồi, E: Chồi chết trên môi trường chọn lọc có bổ sung 125 mg/L kanamycin, F: Lá mầm có phôi chết trên môi trường có bổ sung 100 mg/L cefotaxime. 109
  8. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chi42 vào cây lạc (Arachis hypogaea L.) … Hình 4. Khuếch đại PCR gen Chi42 mã hóa chitinase 42 kDa ở cây lạc chuyển gen. M: thang chuẩn kích thước DNA (GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, Thermo Scientific), PC: vector pMYV719 chứa gen Chi42 làm đối chứng dương, NC: cây lạc không chuyển gen làm đối chứng âm, 1-6: các cây lạc tái sinh từ lá mầm có phôi sống sót trên môi trường chọn lọc. 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh kanamycin (Kan) Sau 3 ngày đồng nuôi cấy, các mẫu cấy được cấy vào môi trường TDT với các nồng độ khác nhau (50 – 150 mg/L) của Kan (Hình 2-f). Tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo chồi cùng với số chồi/mẫu cấy bị giảm khi tăng nồng độ Kan. Hơn 64% lá mầm có phôi bị ức chế cảm ứng ở nồng độ 100 mg/L Kan trong mẫu cấy được chuyển gen Chi42 và ở nồng độ này cho hiệu suất biến nạp gen cao nhất (33,6%) (Hình 2-f, Hình 4). Vượt quá nồng độ đó của Kan cho thấy mẫu cấy bị hoại tử (Hình 3-E). Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Marka và cộng sự (2022), nồng độ 100 mg/L Kan phù hợp cho chọn lọc chồi biến nạp ở mẫu lá mầm khử phôi của giống lạc cv ICG 7827, nồng độ 125 mg/L Kan làm chồi bị hoại tử [10]. Vì vậy nồng độ 100 mg/L Kan được lựa chọn cho các thí nghiệm sàng lọc cây lạc chuyển gen. 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ cefotaxime Sau ba ngày đồng nuôi cấy, các mẫu cấy được rửa bằng môi trường lỏng ½ MS vô trùng có chứa 250 mg/L cefotaxime để ngăn chặn sự phát triển quá mức của vi khuẩn Agrobacterium trong mẫu cấy bị nhiễm. Sau đó, những mẫu bị nhiễm vi khuẩn này được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc TDT có bổ sung 100 mg/L Kan và 100 – 300 mg/L cefotaxime trong 4 tuần. Ở nồng độ 100 mg/L cefotaxime, tỉ lệ mẫu tạo chồi, tỉ lệ mẫu sống sót và sạch khuẩn khá thấp lần lượt là 12% và 3,4% (Hình 5). Điều này là do lượng kháng sinh cefotaxime thấp không đủ để tiêu diệt Agrobacterium, Agrobacterium phát triển quá mức làm chết mẫu. Ở nồng độ 250 mg/L cefotaxime tiêu diệt hoàn toàn sự phát triển quá mức của Agrobacterium, dẫn đến tỉ lệ mẫu tạo chồi, tỉ lệ mẫu sống sót và sạch khuẩn đạt cao nhất (lần lượt 100% và 80,7%) (Hình 5, Hình 3-B). Nồng độ cefotaxime quá cao (300 mg/L) làm ức chế sự tái sinh chồi của mẫu (6%) (Hình 5). Theo nghiên cứu của Sharma và Anjaiah (2000), sử dụng 250 µg/mL cefotaxime cho hiệu quả biến nạp gen lớn (55%) vào lá mầm của cây đậu phộng [31]. Nghiên cứu của Marka và cộng sự (2022) khi chuyển gen Tc chitiI để tăng cường khả năng kháng nấm ở giống lạc (Arachis 110
  9. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 22, Số 2 (2023) hypogaea L.) cv ICG 7827 qua trung gian A. tumefaciens LBA4404 sử dụng môi trường chọn lọc chứa 250 mg/L cefotaxime cho hiệu suất biến nạp ở thế hệ T0 là 70% [10]. Hình 5. Ảnh hưởng của nồng độ cefotaxime (mg/L) đến tỉ lệ lá mầm có phôi tạo chồi, sống sót và sạch khuẩn của giống lạc L14 qua trung gian A. tumfaciens 4. KẾT LUẬN Nghiên cứu này đã xác định được các điều kiện thích hợp cho việc chuyển gen vào lá mầm có phôi của giống lạc L14 qua trung gian vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404. Trong đó, mẫu lá mầm có phôi được tiền nuôi cấy 3 ngày trước khi lây nhiễm vi khuẩn, lây nhiễm 20 phút ở OD600 = 1,0 và đồng nuôi cấy với vi khuẩn trong tối 3 ngày trên môi trường có bổ sung 200 µM AS; mẫu chuyển gen được khử khuẩn với 250 mg/L cefotaxime và sàng lọc ở môi trường có chứa 100 mg/L kanamycin cho hiệu quả biến nạp cao. Việc tối ưu hóa các yếu tố trong biến nạp gen giúp cải thiện hiệu suất biến nạp gen mã chitinase 42 kDa ở giống lạc L14 nhằm tăng cường khả năng kháng nấm. LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu này được tài trợ từ Đại học Huế qua đề tài khoa học và công nghệ cấp Đại học Huế với mã số DHH2020-03-136. Phùng Thị Bích Hòa và Nguyễn Hoàng Tuệ được cấp học bổng bởi Tập đoàn Vingroup-Công ty CP thông qua chương trình đào tạo thạc sĩ, tiến sĩ trong nước của Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF) và Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn (VinBigdata) với mã số lần lượt VINIF.2020.TS.111 và VINIF.2021.ThS. 46. 111
  10. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chi42 vào cây lạc (Arachis hypogaea L.) … TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Chen, L., Wu, Y. D., Chong, X. Y., Xin, Q. H., Wang, D. X., & Bian, K. (2020). Seed‐borne endophytic Bacillus velezensis LHSB1 mediate the biocontrol of peanut stem rot caused by Sclerotium rolfsii. Journal of applied microbiology, 128(3), 803-813. [2]. Guclu, V., Aydogdu, M., Basak, M., Kizil, S., Uzun, B. Ü. L. E. N. T., & Yol, E. N. G. İ. N. (2020). Characterization of a groundnut collection to stem rot disease caused by Sclerotium rolfsii. Australasian Plant Pathology, 49(6), 691-700. [3]. Xie, C., Huang, C. H., & Vallad, G. E. (2014). Mycelial compatibility and pathogenic diversity among Sclerotium rolfsii isolates in the southern United States. Plant Disease, 98(12), 1685-1694. [4]. Chen K.R. , Ren L. , Xu L. , Chen W. , Liu F. , Fang X.P. Research progress on peanut southern stem rot caused by Sclerotium rolfsii. Chin. Oil Crop Science, 40 (2018), 302-308. [5]. Yan, L., Wang, Z., Song, W., Fan, P., Kang, Y., Lei, Y., ... & Liao, B. (2021). Genome sequencing and comparative genomic analysis of highly and weakly aggressive strains of Sclerotium rolfsii, the causal agent of peanut stem rot. BMC genomics, 22(1), 1-15. [6]. Chen, Q., Li, J., Miao, Y., Wang, H., Chen, L., & Liu, D. (2020). First report of southern blight on Chrysanthemum morifolium caused by Sclerotium rolfsii in China. Plant Disease, 104(2), 585. [7]. Sharf, W., Javaid, A., Shoaib, A., & Khan, I. H. (2021). Induction of resistance in chili against Sclerotium rolfsii by plant-growth-promoting rhizobacteria and Anagallis arvensis. Egyptian Journal of Biological Pest Control, 31(1), 1-11. [8]. Sun, S., Sun, F., Deng, D., Zhu, X., Duan, C., & Zhu, Z. (2020). First report of southern blight of mung bean caused by Sclerotium rolfsii in China. Crop Protection, 130, 105055. [9]. Yi, R. H., Long, G. G., Li, K. Y., Wang, X. Y., Huang, Y., & Li, D. (2021). First Report of Southern Blight of Manglietia decidua caused by Sclerotium rolfsii in China. Plant Disease, 105(4), 1217-1217. [10]. Marka, R., Malothu, G. S., & Nanna, R. S. (2022). Transgenic Peanut (Arachis hypogaea L.) Plants Conferring Enhanced Protection Against Fungal Pathogens by Expressing Tc chitinase-I Gene. Journal of Scientific Research, 14(2), 625-640. https://doi.org/10.3329/jsr.v14i2.56542 [11]. Marka, R., & Nanna, R. S. (2021). Expression of Tcchitinase-I gene in transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) confers enhanced resistance against leaf spot and rust diseases. Plant Growth Regulation, 93(1), 53-63. [12]. Vasavirama, K., & Kirti, P. B. (2012). Increased resistance to late leaf spot disease in transgenic peanut using a combination of PR genes. Functional & integrative genomics, 12(4), 625-634. [13]. Nyaboga, E., Tripathi, J. N., Manoharan, R. & Tripathi, L. (2014). Agrobacterium-mediated genetic transformation of yam (Dioscorearotundata):animportant tool for functional study of genes and crop improvement. Frontiers in plant sciennce, 5(463), 1-14. [14]. Hoa, P. T. B., Tue, N. H., Trang, H. T. Q., Trang, P. T. H., Tuong, T. G. C., Huy, N. X., & Loc, N. H. (2022). Cloning genes encoding chitinase 42 kDa of Trichoderma asperellum into the 112
  11. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 22, Số 2 (2023) plant expression vector pMYV719 for genetic transformation. Hue University Journal of Science, Accept Submission. [15]. Loc, N. H., Quang, H. T., Hung, N. B., Huy, N. D., Phuong, T. T. & Ha, T. T. (2011). Trichoderma asperellum Chi42 genes encode chitinase. Mycobiol, 39(3), 182-186. [16]. Luong, N. N., Tien, N. Q. D., Huy, N. X., Man, L. Q., Sinh, D. D. H., Tue, N. H., Thanh, D. V., Chi, D. T. K., Hoa, P. T. B. & Loc, N. H. (2021). Expression of 42 kDa chitinase (Ta-CHI42) of Trichoderma asperellum from a synthetic gene in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett, 368:fnab110. [17]. Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15, 473-497. [18]. Clarke, J. D. (2009). Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harbor Protocols, 2009(3), pdb-prot5177. [19]. Mariashibu, T. S., Subramanyam, K., Arun, M., Mayavan, S., Rajesh, M., Theboral, J., Manickavasagam, M. & Ganapathi, A. (2013). Vacuum infiltration enhances the Agrobacterium-mediated genetic transformation in Indian soybean cultivars. Acta Physiologiae Plantarum, 35(1), 41-54. [20]. Mayavan, S., Subramanyam, K., Arun, M., Rajesh, M., Kapil Dev, G., Sivanandhan, G., Jaganath, B., Manickavasagam, M., Selvaraj, N. & Ganapathi, A. (2013). Agrobacterium tumefaciens-mediated in planta seed transformation strategy in sugarcane. Plant cell reports, 32(10), 1557-1574. [21]. Athmaram, T. N., Bali, G., & Devaiah, K. M. (2006). Integration and expression of Bluetongue VP2 gene in somatic embryos of peanut through particle bombardment method. Vaccine, 24(15), 2994-3000. [22]. Subramanyam, K., Rajesh, M., Jaganath, B., Vasuki, A., Theboral, J., Elayaraja, D., Karthik, S., Manickavasagam, M. & Ganapathi, A. (2013). Assessment of factors influencing the Agrobacterium-mediated in planta seed transformation of brinjal (Solanum melongena L.). Applied biochemistry and biotechnology, 171(2), 450-468. [23]. Rohini, V. K., & Rao, K. S. (2000). Transformation of peanut (Arachis hypogaea L.): a non- tissue culture based approach for generating transgenic plants. Plant science, 150(1), 41-49. [24]. Orlikowska, T. K., Cranston, H. J., & Dyer, W. E. (1995). Factors influencing Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation and regeneration of the safflower cultivar ‘Centennial’. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 40(1), 85-91. [25]. Uranbey, S., Sevimay, C. S., Kaya, M. D., Ipek, A., Sancak, C. E. N. G. İ. Z., Başalma, D., Er, C. & Özcan, S. (2005). Influence of different co-cultivation temperatures, periods and media on Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer. Biologia Plantarum, 49(1), 53-57. [26]. Manickavasagam, M., Subramanyam, K., Ishwarya, R., Elayaraja, D., & Ganapathi, A. (2015). Assessment of factors influencing the tissue culture-independent Agrobacterium- mediated in planta genetic transformation of okra [Abelmoschus esculentus (L.) Moench]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 123(2), 309-320. 113
  12. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chi42 vào cây lạc (Arachis hypogaea L.) … [27]. Park, B. J., Liu, Z., Kanno, A., & Kameya, T. (2005). Transformation of radish (Raphanus sativus L.) via sonication and vacuum infiltration of germinated seeds with Agrobacterium harboring a group 3 LEA gene from B. napus. Plant Cell Reports, 24(8), 494-500. [28]. Chen, X., Equi, R., Baxter, H., Berk, K., Han, J., Agarwal, S., & Zale, J. (2010). A high- throughput transient gene expression system for switchgrass (Panicum virgatum L.) seedlings. Biotechnology for biofuels, 3(1), 1-10. [29]. Ashutosh, V., Ritu, M., Asha, M., & Pushpa, R. (2012). Transformation of groundnut-Arachis hypogea L. var. GG20 with the cox gene-an attempt to develop salinity tolerance. International Journal of Pharma and Bio Sciences, 3(1B), 591-599. [30]. Tiwari, V., Chaturvedi, A. K., Mishra, A., & Jha, B. (2015). An efficient method of Agrobacterium-mediated genetic transformation and regeneration in local Indian cultivar of groundnut (Arachis hypogaea) using grafting. Applied biochemistry and biotechnology, 175(1), 436-453. [31]. Sharma, K. K., & Anjaiah, V. (2000). An efficient method for the production of transgenic plants of peanut (Arachis hypogaea L.) through Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation. Plant Science, 159(1), 7-19. 114
  13. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 22, Số 2 (2023) INVESTIGATION OF SOME FACTORS AFFECTING AGROBACTERIUM- MEDIATED GENETIC TRANSFORMATION IN PEANUT (Arachis hypogaea L.) Nguyen Hoang Tue1, Luc Hoang Linh1, Le Thi Hang1, Huynh Thi Quynh Trang1, Nguyen Xuan Huy2, Phung Thi Bich Hoa1,3* 1 Faculty of Biology, University of Sciences, Hue University 2 Department of Science, Technology and International Relations, Hue University 3 Faculty of Biology, University of Education, Hue University *Email: ptbhoa@hueuni.edu.vn ABSTRACT In this study, embryonal cotyledons were used as a material for transgenic from Agrobacterium tumefaciens LBA4404 carrying the pMVY719/chi42 vector through co- culture. Stable integration of the transgenes in peanuts was confirmed by using PCR analysis. The results showed that 3 days of pre-cultured explants, 200 µM acetosyringone and 3 days of co-culture suitable for the genetic transformation into embryonal cotyledons of peanut cultivar L14. The highest shoot regeneration rate was achieved using explants for infection with an Agrobacterium culture corresponding to OD600 = 1.0. Cefotaxime 250 mg/L was suitable for eliminating Agrobacterium from cotyledons and kanamycin 100 mg/L was suitable for screening transgenic tissues. This result was premise to complete the chi42 gene transfer process into peanut cultivar L14 for subsequent applications. Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Arachis hypogaea, chi42 gene, genetic transformation, Trichiderma asperellum. Nguyễn Hoàng Tuệ sinh ngày 02/11/1996 tại Thừa Thiên Huế. Năm 2019, ông tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Hiện tại, ông đang là học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Lĩnh vực nghiên cứu: Protein tái tổ hợp. 115
  14. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chi42 vào cây lạc (Arachis hypogaea L.) … Lục Hoàng Linh sinh ngày 08/09/1998 tại Quảng Trị. Năm 2021, ông tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Hiện tại, ông đang là quản lý công ty phần mềm tại Quảng Trị. Lĩnh vực nghiên cứu: Công nghệ sinh học thực vật. Lê Thị Hằng sinh năm 1996 tại Nghệ An. Năm 2019, bà tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Hiện tại, bà đang là nhân viên phòng Đảm bảo chất lượng Công ty Vita, Bình Dương. Lĩnh vực nghiên cứu: Công nghệ sinh học thực vật. Huỳnh Thị Quỳnh Trang sinh ngày 06/01/1998 tại Thừa Thiên Huế. Năm 2021, bà tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Hiện tại, bà đang là nhân viên phòng Đảm bảo chất lượng của Công ty Cổ phần Đại Tân Việt. Lĩnh vực nghiên cứu: Sinh học phân tử. Nguyễn Xuân Huy sinh năm 1979 tại Quảng Trị. Năm 2001, ông tốt nghiệp Cử nhân Sinh học tại Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế. Năm 2007, ông tốt nghiệp Thạc sĩ Sinh học tại Đại học Quốc Gia Chunbuk, Hàn Quốc. Năm 2012, tốt nghiệp Tiến sĩ Sinh học tại trường Đại học Quốc Gia Chunbuk, Hàn Quốc. Hiện nay, ông công tác tại Đại học Huế. Lĩnh vực nghiên cứu: Công nghệ Sinh học phân tử; Vaccine thực phẩm; Protein tái tổ hợp; Nematodes gây bệnh tuyến trùng nốt sưng (Meloidogyne graminicola) trên lúa. Phùng Thị Bích Hòa sinh ngày 14/04/1985 tại Thừa Thiên Huế. Năm 2007, bà tốt nghiệp Cử nhân Sinh học tại Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế. Năm 2009, bà tốt nghiệp Thạc sĩ Thực vật học tại Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế. Hiện nay, bà là nghiên cứu sinh chuyên ngành Sinh lý học Thực vật, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, và đang công tác tại Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế. Lĩnh vực nghiên cứu: Sinh lý học thực vật, Hóa sinh thực vật, Các hợp chất thứ cấp ở thực vật, Protein tái tổ hợp. 116
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2