intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Khảo sát sự ảnh hưởng của mật độ Tilapia Lake Virus (TiLV) đến khả năng phân lập và nuôi cấy TiLV trên dòng tế bào E-11

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:11

Thêm vào BST
Báo xấu
4
lượt xem 2
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Khảo sát sự ảnh hưởng của mật độ Tilapia Lake Virus (TiLV) đến khả năng phân lập và nuôi cấy TiLV trên dòng tế bào E-11 khảo sát mật độ virus TiLV trong các mẫu mô cá rô phi nhiễm bệnh và khả năng duy trì được sự tồn tại của các chủng TiLV này khi nuôi cấy bằng dòng tế bào E-11.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khảo sát sự ảnh hưởng của mật độ Tilapia Lake Virus (TiLV) đến khả năng phân lập và nuôi cấy TiLV trên dòng tế bào E-11

  1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MẬT ĐỘ TILAPIA LAKE VIRUS (TiLV) ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TiLV TRÊN DÒNG TẾ BÀO E-11 Trần Hạnh Triết1, Nguyễn Hoàng Thụy Vy1, Ngô Huỳnh Phương Thảo1* TÓM TẮT Tilapia Lake Virus (TiLV) được xem là mối đe dọa cho ngành nuôi cá rô phi ở nhiều quốc gia. Hiện nay đã có một số nghiên cứu đầu tiên về TiLV phân lập tại Việt Nam nhưng thông tin vẫn còn hạn chế. Trong nghiên cứu hiện tại, sự tác động giữa mật độ TiLV trong các mẫu cá nhiễm bệnh và khả năng phân lập được TiLV bằng cách nuôi cấy với tế bào E-11 được khảo sát. Năm mẫu TiLV phân lập tại Việt Nam cùng với một mẫu TiLV Thái Lan được xác định mật độ bằng phương pháp real-time RT-PCR trước khi dùng để cảm nhiễm tế bào E-11. Bốn mẫu (VL160, VL167, HB188 và HD189) có mật độ virus thấp (22-66 bản sao/µL), trong khi đó mật độ của mẫu HB196 là cao nhất (2,95 x 107 bản sao/µL) và của mẫu Thái Lan (TiLV-TL) là 3,32 x 102 bản sao virus/µL. Kết quả nuôi cấy virus bằng tế bào cho thấy chỉ có mẫu HB196 và TiLV-TL là duy trì được khả năng ly giải tế bào qua nhiều đợt cấy chuyền, còn bốn mẫu TiLV với mật độ thấp có sự ly giải tế bảo giảm dần và mất hẳn qua các đợt cấy chuyền. Điều này cho thấy mật độ virus (≥ 3,32 x 102 bản sao virus/µL) trong mẫu mô ban đầu có thể đảm bảo sự thành công của việc phân lập và duy trì virus TiLV trên dòng tế bào E-11. Bên cạnh đó, nghiên cứu này cũng đưa ra quy trình chẩn đoán TiLV bằng kỹ thuật real-time RT-PCR dùng Sybr green có giới hạn phát hiện ở mức 11,8 bản sao/µL, có khả năng ứng dụng trong các phòng thí nghiệm kiểm soát dịch bệnh do TiLV gây ra. Từ khóa: cá rô phi, phản ứng real-time RT-PCR, tế bào E-11, Tilapia Lake virus. I. ĐẶT VẤN ĐỀ khác ở Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ Latin Cá rô phi là một trong những loài quan trọng (Aich, 2022). TiLV là virus có vỏ bọc, mang và hiện đã được nuôi ở hơn 90 quốc gia, trong RNA sợi âm với 10 đoạn trình tự trong bộ gen đó Trung Quốc, Indonesia và Ai Cập là những (10.323 kb) với kích thước khoảng 55-100 nm. quốc gia nuôi nhiều nhất (Wang et al., 2021) Mỗi đoạn trình tự đều có vùng đọc mở, có thể we compared newly developed quantitative mã hóa cho 14 protein khác nhau. TiLV thuộc real-time PCR (qPCR. Sản lượng cá rô phi toàn họ Amnoonviridae, chi Tilapinevirus and loài cầu khoảng 6,4 triệu tấn vào năm 2018 và được Tilapia tilapinevirus. TiLV có thể lây lan theo kỳ vọng đạt 7,3 triệu tấn vào năm 2030 (FAO, chiều ngang và chiều dọc. Hiện chưa có phương 2019). Tuy nhiên, tình hình dịch bệnh do virus pháp điều trị hay vắc-xin thương mại để phòng đang gia tăng, trong đó có bệnh do Tilapia Lake trị bệnh do TiLV gây ra (Aich, 2022). Phương virus (TiLV) gây ra đang đe dọa ngành nuôi cá pháp phòng và kiểm soát dịch bệnh chủ yếu dựa rô phi toàn cầu. TiLV được phát hiện đầu tiên vào các biện pháp quản lý tốt điều kiện ao trại ở cá rô phi nuôi và cá rô phi hoang dại ở Israel và đảm bảo an toàn sinh học. Chính vì vậy, việc (Eyngor et al., 2014). Trong vài năm sau đó, phát hiện sớm TiLV rất cần thiết để kịp thời đưa dịch bệnh TiLV đã được ghi nhận ở 16 nước ra giải pháp xử lý dịch bệnh. 1 Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh * Email: nhpthao.snn@tphcm.gov.vn TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 22 - THÁNG 6/2022 45
  2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Tại Việt Nam, sau tôm và cá tra, cá rô phi và thời gian cấy chuyền virus. Chính vì vậy, được kỳ vọng là một trong những động vật nuôi trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi muốn khảo thủy sản chủ lực vào năm 2030 với sản lượng sát mật độ virus TiLV trong các mẫu mô cá rô hàng năm 400.000 tấn bao gồm 50-60% dùng phi nhiễm bệnh và khả năng duy trì được sự tồn cho xuất khẩu (VASEP, 2016). Một vài báo cáo tại của các chủng TiLV này khi nuôi cấy bằng gần đây cho thấy sự hiện diện của TiLV tại một dòng tế bào E-11. số ao nuôi cá rô phi ở Việt Nam ở mức 3,9% II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 26,43% (Ngô Huỳnh Phương Thảo và ctv., NGHIÊN CỨU 2020; Chi cục Chăn nuôi, Thú y và Thủy sản 2.1. Các mẫu virus TiLV tỉnh Bình Dương, 2017). Thông tin năm mẫu mô cá rô phi nhiễm Tiêu chuẩn vàng để nhận diện TiLV được TiLV (VL160, VL167, HB188, HD189 và Tổ chức Sức khỏe Động vật Thế giới (World HB196) được sử dụng trong nghiên cứu này Organization for Animal Health, OIE) đề nghị được trình bày ở Bảng 1. Trong đó, mẫu VL160 là phân lập virus bằng nuôi cấy tế bào sau khi và VL167 được thu từ bè nuôi cá rô phi đỏ (hay đã tiến hành chẩn đoán bằng phản ứng PCR còn gọi là cá điêu hồng, Oreochromis spp.) phiên mã ngược (RT-PCR) (Pitchaporn et al., tại An Bình, Long Hồ, Vĩnh Long vào tháng 2018)”ISSN”:”0044-8486”,”abstract”:”Tilapia 06/2020. Ba mẫu HB188, HD189 và HB196 lake virus disease (TiLVD. Việc cảm nhiễm tế được thu từ bè nuôi cá rô phi vằn (Oreochromis bào E-11 với dịch đồng nhất mẫu cá nghi nhiễm niloticus) ở Hòa Bình và Hải Dương vào tháng TiLV được cho là một phương pháp chẩn đoán 03-08/2020 bởi Học viện Nông nghiệp Việt TiLV có độ chính xác tương đương phản ứng Nam. Sự hiện diện của virus TiLV trong năm nested RT-PCR (Tsofack et al., 2017). Tuy mẫu cá rô phi này được khẳng định bằng phản nhiên, Ngô Huỳnh Phương Thảo và ctv. (2020) ứng semi-nested RT-PCR với bộ mồi khuếch đã đề cập ba yếu tố có thể ảnh hưởng đến khả đại đoạn trình tự số 3 với một số điều chỉnh bởi năng thành công của việc nuôi cấy TiLV trên Ngô Huỳnh Phương Thảo và ctv. (2020). dòng tế bào E-11 là độc lực virus, mật độ virus Bảng 1. Năm mẫu cá rô phi nhiễm TiLV sử dụng trong nghiên cứu. Thời Loại cá/ Dấu hiệu Nguồn gốc gian Nguồn TT Ký hiệu Loại mô Kích cỡ bệnh lý mẫu thu tham khảo mẫu 1 VL160 Gan, lách Cá rô phi Mắt lồi An Bình, 06/2020 đỏ, 350 g Long Hồ, Ngô Huỳnh Vĩnh Long Phương 2 VL167 Gan, lách Cá rô phi Không có dấu An Bình, 06/2020 Thảo và đỏ, 70 g hiệu bệnh rõ Long Hồ, ctv. (2020) Vĩnh Long 3 HB188 Gan, lách Cá rô phi Không có dấu Hoà Bình 04/2020 vằn, 70 g hiệu bệnh rõ 4 HD189 Gan, lách Cá rô phi Không có dấu Hải Dương 03/2020 Nghiên cứu vằn, 24 g hiệu bệnh rõ hiện tại 5 HB196 Gan, lách Cá rô phi Xuất huyết Hoà Bình 08/2020 vằn, 42 g mang 46 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 22 - THÁNG 6/2022
  3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Ngoài ra, chủng TiLV-TL phân lập tại Thái cDNA, 0,33 μM mỗi mồi, 1X SYBRTM Green Lan được cung cấp bởi Khoa Khoa học và Công PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) nghệ, trường Đại học Suan Sunandha Rajabhat, trong tổng thể tích 25 μL. Chương trình nhiệt Thái Lan để làm mẫu đối chứng dương trong gồm một chu kỳ 94oC trong 2 phút, 50 chu kỳ các thí nghiệm liên quan đến chẩn đoán và nuôi với 94°C trong 30s, 60°C trong 30s, 72°C trong cấy TiLV. 30s, và một chu kỳ 72oC trong 5 phút. 2.2. Quy trình real-time RT-PCR định Mẫu chứng âm là nước siêu sạch (Mili-Q, Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) trong tổng thể tích 25 μL. Chươn lượng TiLV Merk Millipore). Vector pJET1.2 (Thermo o Để thu virus từ mẫu cá dương tính vớimột chu kỳ 94 C trong 2 phút, mang đoạn trình tự khuếch nhiệt gồm TiLV, Fisher Scientific) 50 chu kỳ với 94°C trong 30s, 60°C trong 30s các mẫu mô được đồng nhất trong 30s, vàdịch chu kỳ bởiC trong 5 phút. ext-1 và ME1 (415 bp, trong dung một đại 72o cặp mồi Nested Hank’s balanced salt solution (Thermo Fisher PhusaBiochem) được dùng làm mẫu chuẩn để Mẫu chứng âm là nước siêu sạch (Mili-Q, Merk Millipore). Vector pJET1.2 (T Scientific) và sau đó ly tâm ở 3.000 xg trong xây dựng đường chuẩn trong trong quy trình 10 phút ở 4oC (Tattiyapong et al., 2017). Dịch mang đoạn trình tự định lượngbởi cặp mồi Nested ext-1 và ME1 (4 Fisher Scientific) real-time PCR khuếch đại TiLV. Nồng độ của nổi chứa virus được lọc qua màng lọc 0,22 μm vector làm mẫu chuẩn để xây dựngđể tạo chuẩn trong trong qu PhusaBiochem) được dùng được pha loãng 10 lần đường ra tám (Corning), định lượng bằng phản ứng real-time mẫu chuẩn có số lượng bản sao TiLV từ 1,18 real-time PCR định lượng TiLV. Nồng độ của vector được pha loãng 10 lần để tạo ra tá RT-PCR và dùng cho mục đích nuôi cấy TiLV x 101 đến 1,12 x 108 bản sao theo công thức bằng dòng tế bào E-11 ở mục 2.3.chuẩn có số lượng bản sao TiLV từ 1,18 x 101 đến 1,12 x 108 bản sao theo côn (http://www.scienceprimer.com/copy-number- X ng x 6,0221 x 1023 phân tử/mole Quy trình tách chiết RNA (http://www.scienceprimer.com/copy-number-calculator-for-realtime-pcr): từ dịch nghiền calculator-for-realtime-pcr): tổng hợp cDNA được thực hiện theo mô tả của Số bản sao = (N x 660 g/mole x 1 x 109 ng/g mẫu mô cá rô phi dương tính TiLV và phản ứng Ngô Huỳnh Phương Thảo và ctv. (2020). Tóm lược như sau, RNA virus được tách chiết từ mẫu X = hàm lượng mẫu (ng) Trong đó Trong đó: cá bằng dung dịch Trizol và bảo quản ở -80oC N = chiều hàmđoạn DNA sợi đôi X = dài lượng mẫu (ng) N = chiều dài đoạn DNA sợi đôi cho đến khi sử dụng. Nồng độ và chất lượng 660 g/mole = trọng lượng phân tử trung bình của 1 bp DNA sợi đô RNA sau khi tách được kiểm tra bằng máy 660 g/mole = trọng lượng phân tử trung Các mẫu chuẩn, mẫu virusbp DNA sợi đôi định lượng lặp lại hai lần trong m và chứng âm được Nanodrop (Thermo Scientific). Phản ứng tổng bình của 1 hợp cDNA được tiến hành với bộ kit real-time PCR. HàmCác mẫu chuẩn, tính thông qua giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct chạy RevertAid lượng virus được mẫu virus và chứng âm First Strand cDNA Synthesissuất khuếch đại (E) của phản ứnglượng lặpPCRhai lần trong mỗi lần E = 10–1/slo Kit (Thermo được định real-time lại được tính bằng công thức Scientific) và cặp mồi Random hexamer (5´ – chạy real-time PCR. Hàm lượng virus được tính dữ liệu real-time PCR được xử lý bằng phần mềm LightCycler® 96 SW1.1 (Roche). d (NNNNNN) –3´ N = G, A, T or C) (Thermo thông qua giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct). Hiệu suất Scientific) và OligodT (5´-d (TTT TTT TTT TiLV trên dòng tếcủa phản ứng real-time PCR 2.3. Nuôi cấy virus khuếch đại (E) bào E-11 TTT TTT TTT)-3´) (Bioline). Mẫu cDNA đượccá rô phi dươngbằng với TiLV (Bảng 1), hai mẫu VL160 và VL167 đ Trong năm mẫu được tính tính công thức E = 10–1/slope. Các dữ bảo quản ở -20oC. liệu real-time PCR được xử lý bằng phần mềm chúng tôi công bố trong nghiên cứu trước đây của nhóm về khả năng nuôi cấy và cấy Quy trình real-time PCR khuếch đại đoạn LightCycler® 96 SW1.1 (Roche). trên dòng tế bào E-11 (Ngô Huỳnh Phương Thảo và ctv., 2020). Do đó, trong nghiên cứ 2.3. Nuôi cấy virus TiLV trên dòng tế bào trình tự thứ 3 của TiLV với cặp mồi Nested ext- 1 (5’-TAT GCA GTA CTT TCC CTG CC-3’) tiếnE-11 nuôi cấy ba mẫu HB188, HD189 và HB196 và khảo sát kh tại, chúng tôi chỉ hành và ME1 (5’-GTT GGG CAC AAGtrì sự tồn tại của các mẫu nàynăm nhữngcá rô phi dương tính với bào E-11. duy GCA TCC Trong qua mẫu đợt cấy chuyền bằng dòng tế TA-3’) (Eyngor et al., 2014; Kembou Tsofack TiLV (Bảng 1), hai mẫu VL160 và VL167 Dòng tế bào E-11 (tế bào từ cá lóc Ophicephalus striatus là dòng tế bào nhạy c et al., 2017; Dong et al., 2017) được dùng để đã được chúng tôi công bố trong nghiên cứu xác định hàm lượng virus TiLV trong các mẫu trước đây của nhóm về khả năng nuôi cấyĐại học Suan Su TiLV và được cung cấp bởi Khoa Khoa học và Công nghệ, trường và mô cá bằng máy Lightcycler® Rajabhat, Thái Lan. Quy chuyền trên dòng tế nhiễm tế bào E-11 với các mẫu mô cá 96 (Roche Life cấy trình nuôi cấy và cảm bào E-11 (Ngô Huỳnh Science). Phản ứng real-time PCR gồmTiLVμL thực hiệnThảo môctv., 2020). Do đó, Phương Thảo và ctv. (2020 tính với 1,5 được Phương theo và tả của Ngô Huỳnh trong nghiên lược như sau, tế bào E-11 được bảo quản ở -80oC với mật độ 106 tế bào/mL và nuôi cấ TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 22 - THÁNG 6/2022 47 môi trường Liebovitz L-15 (Bioind) bổ sung 5% huyết thanh bò (fetal bovine serum Sigma) và 2 mM L-glutamine (Sigma) với mật độ 3 x 105 tế bào/cm2 ở 25oC trong điề
  4. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II cứu hiện tại, chúng tôi chỉ tiến hành nuôi cấy tế bào E-11 và ủ ở 25oC trong 14 ngày. Dịch ba mẫu HB188, HD189 và HB196 và khảo sát virus được lọc và cấy chuyền sang bình tế bào khả năng duy trì sự tồn tại của các mẫu này qua E-11 mới khi hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE, những đợt cấy chuyền bằng dòng tế bào E-11. cytopathic effect) đạt ở mức 50%. CPE của dịch Dòng tế bào E-11 (tế bào từ cá lóc virus được theo dõi qua các đợt cấy chuyền để Ophicephalus striatus là dòng tế bào nhạy cảm đánh giá khả năng duy trì sự tồn tại của các mẫu với TiLV và được cung cấp bởi Khoa Khoa học TiLV bằng phương pháp nuôi cấy tế bào. và Công nghệ, trường Đại học Suan Sunandha III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Rajabhat, Thái Lan. Quy trình nuôi cấy và cảm 3.1. Định lượng TiLV bằng phản ứng nhiễm tế bào E-11 với các mẫu mô cá dương real-time RT-PCR tính với TiLVqua các thực hiện theođể đánh giá khả năng Đườngsự tồn tại của ứngmẫu TiLV PCR được theo dõi được đợt cấy chuyền mô tả của duy trì chuẩn phản các real-time bằng Ngô Huỳnh Phương Thảo và ctv. (2020). Tóm tạo ra bằng cách so sánh số bản sao virus và giá phương pháp nuôi cấy tế bào. lược như sau, tế bào E-11 được bảo quản ở trị Ct của mỗi nồng độ pha loãng cho giá trị độ III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN -80oC với mật độ 106 tế bào/mL và nuôi cấy dốc là − 3.667. Hiệu suất khuếch đại (E) được bằng môi Định lượng TiLV bằng phản ứng real-time RT-PCR (Hình 1). Ngưỡng phát hiện TiLV 3.1. trường Liebovitz L-15 (Bioind) bổ tính là 1.9 sung 5% huyết thanh bò (fetal bovine serum, tạo của phản ứng real-time PCR là 11,8 bản sao/ Đường chuẩn phản ứng real-time PCR được ra bằng cách so sánh số bản sao virus và giá FBS, Sigma) vàmỗi nồng độ pha loãng cho giá vớiđộ dốc là − 3.667. Hai lần lặp lại đều khẳng định tính trị Ct của 2 mM L-glutamine (Sigma) trị μL (Bảng 2). Hiệu suất khuếch đại (E) được mật độ 3 x 10 (Hình 1). Ngưỡng phát hiện TiLV của phản ứng real-time PCR là 11,8PCRsao/μL đối tính là 1.9 tế bào/cm ở 25 C trong điều ổn định của kết quả real-time bản và mẫu 5 2 o kiện không có CO2lần lặp lại đềuthu ở mục 2.2 ổnchứngcủa kết quả real-time PCRkhuếch đại trong (Bảng 2). Hai . Dịch virus khẳng định tính định âm không có tín hiệu và mẫu đối được bổ sung 0,5 – 1 mL vào bình nuôi cấy mỗi lần chạy. chứng âm không có tín hiệu khuếch đại trong mỗi lần chạy. A B C Hình 1. A) Đường chuẩn (standard curve) được tạo ra từ phản ứng real-time PCR dùng để định Hình 1. A) Đường chuẩn (standard curve) được tạo ra từ phản ứng real-time PCR dùng để định lượng bản sao virus TiLV. B) Tín hiệu huỳnh quang theo thời gian của mẫu TiLV và các mẫu chuẩnlượng bản sao 101 đến 1,12 x Tín8 hiệu sao virus. C)theo thời gian của mẫu TiLV và các mẫu có từ 1,18 x virus TiLV. B) 10 bản huỳnh quang Phân tích đường cong nóng chảy (melting chuẩncurve) 1,18 đoạn1trình 1,12 x 108 bản sao virus. C) Phân tích đườngứng PCR. chảy có từ của x 10 đến tự Nested ext-1 và ME1 (415 bp) sau phản cong nóng (melting curve) của đoạn trình tự Nested ext-1 và ME1 (415 bp) sau phản ứng PCR. 48 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 22 - THÁNG 6/2022 Quy trình chẩn đoán TiLV bao gồm các phương pháp tổng hợp bệnh lý (Jansen et al., 2018), mô học (Tattiyapong et al., 2017a), nuôi cấy virus (Behera et al., 2018; Tsofack et al.,
  5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Quy trình chẩn đoán TiLV bao gồm các 2018), RT-LAMP (Yin et al., 2019). Độ nhạy phương pháp tổng hợp bệnh lý (Jansen et al., của các phương pháp chẩn đoán TiLV này dao 2018), mô học (Tattiyapong et al., 2017a), động tùy theo kỹ thuật ứng dụng và thấp nhất nuôi cấy virus (Behera et al., 2018; Tsofack et là 2 bản sao virus/µL (SYBR-Green RTqPCR, al., 2017; Wang et al., 2018) và huyết thanh Tattiyapong et al., 2017b). Trong nghiên cứu học (Hu et al., 2020). Các kỹ thuật sinh học hiện tại, độ nhạy của phản ứng real-time RT- phân tử hiện đang là phương pháp chẩn đoán PCR của chúng tôi là 11,8 bản sao virus/ TiLV phổ biến nhất, gồm RT-PCR (Eyngor et µL, kém hơn 6 lần so với nghiên cứu của al., 2014), semi-nested RT-PCR (Dong et al., Tattiyapong et al. (2017b). Tuy nhiên, đây 2017), nested PCR after RT-PCR (Tsofack et cũng là giới hạn chẩn đoán phù hợp và đáng al., 2017), SYBR-Green and TaqMan RTqPCR tin cậy cho phản ứng PCR định lượng virus khi (Tattiyapong et al., 2017b; Waiyamitra et al., dùng trong giám sát tình hình dịch bệnh. Bảng 2. Số bản sao virus TiLV trung bình trong các mẫu chuẩn và dịch nghiền mô cá rô phi nhiễm bệnh. Mẫu Chu kỳ ngưỡng trung bình (Ct) Số bản sao virus TiLV trung bình (bản sao/µL) Mẫu chuẩn 1 40,15 1,18 x 101 Mẫu chuẩn 2 36,03 1,56 x 102 Mẫu chuẩn 3 33,51 7,6 x 102 Mẫu chuẩn 4 30,01 6,86 x 103 Mẫu chuẩn 5 25,69 1,05 x 105 Mẫu chuẩn 6 21,98 1,06 x 106 Mẫu chuẩn 7 18,42 9,89 x 106 Mẫu chuẩn 8 14,54 1,12 x 108 VL160 38,08 4,73 x 101 VL167 38,87 2,66 x 101 HB188 37,55 6,04 x 101 HD189 39,16 2,20 x 101 HB196 16,85 2,95 x 107 TiLV-TL 34,83 3,32 x 102 Trước khi cảm nhiễm tế bào E-11, mật độ RT-PCR khi mà chỉ có mẫu HB196 có kết quả virus của năm mẫu TiLV Việt Nam (VL160, dương tính ở cả hai bước, trong khi các mẫu còn VL167, HB188, HD189 và HB196) cùng với lại chỉ dương tính ở bước PCR thứ hai (dữ liệu mẫu TiLV-TL của Thái Lan được xác định bằng này không được trình bày trong bài báo này) phản ứng real-time RT-PCR (Bảng 2). Trong đó, (Ngô Huỳnh Phương Thảo và ctv., 2020). 04/05 mẫu TiLV Việt Nam có hàm lượng virus 3.2. Khả năng nuôi cấy và duy trì các thấp từ 22-60 bản sao/µL, chỉ có mẫu HB196 có mẫu TiLV bằng dòng tế bào E-11 số bản sao TiLV cao ở mức 2,95 x 107, và mẫu Ba mẫu TiLV (HB188, HD189 và HB196) TiLV Thái Lan chứa 3,32 x 102 bản sao virus/ đều tạo CPE 50% trong vòng 1 đến 7 ngày sau µL. Điều này phù hợp với kết quả semi-nested cảm nhiễm (Hình 2). Qua các đợt cấy chuyền, TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 22 - THÁNG 6/2022 49
  6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II hai chủng HB188 và HD189 có tốc độ ly giải vậy, mặc dù mật độ virus của bốn mẫu VL160, tế bào ngày càng yếu dần và mất hoàn toàn khả VL167, HB188 và HD189 tương tự nhau (22- năng ly giải tế bào lần lượt ở đợt cấy chuyền thứ 66 bản sao/µL) nhưng số đợt cấy chuyền duy 7 và 6. Trong khi đó, chỉ có chủng HB196 vẫn trì được sự ly giải tế bào của HB188 và HD189 duy trì được khả năng ly giải tế bào E-11 ổn định (3-6 lần) nhiều hơn so với VL160 và VL167 đến lần cấy chuyền thứ 6 với thời gian của mỗi (1-2 lần). Mặt khác, nghiên cứu này cũng chứng đợt cấy chuyền kéo dài từ 2 đến 3 ngày (Hình tỏ mật độ virus trong mẫu mô ban đầu rất quan 3). Kết quả semi-nested RT-PCR khẳng định có trọng cho việc phân lập và duy trì virus TiLV sự tồn tại của TiLV trong dịch ly giải tế bào sau trên dòng tế bào E-11. Điều này được minh khi cảm nhiễm ở cả tất cả các mẫu (Hình 4). chứng bằng mẫu TiLV HB189 có mật độ virus Tuy nhiên, cả hai mẫu HB188 và HD189 đều cao (2,95 x 107 bản sao/µL) và tốc độ ly giải tế có mức độ nhiễm TiLV thấp, được phát hiện bào E-11 ổn định qua 6 đợt cấy chuyền. Mẫu ở PCR bước 2 của quy trình semi-nested RT- đối chứng TiLV-TL có mật độ virus thấp hơn PCR. Mặc dù hai chủng TiLV này được nuôi (3,32 x 102 bản sao virus/µL) cũng có khả năng cấy thành công trên tế bào E-11 nhưng qua các tồn tại rất ổn định trên dòng tế bào E-11 qua rất đợt cấy chuyền, nhóm nghiên cứu nhận có sự nhiều đợt cấy chuyền kể từ khi chúng tôi nhận suy giảm về khả năng ly giải tế bào cho đến được mẫu này từ Thái Lan vào năm 2019. Các khi sự ly giải không xảy ra nữa. Ngược lại, mẫu kết quả hiện tại của nghiên cứu này khuyến cáo HB196 có mức độ nhiễm TiLV nặng với kết quả mật độ TiLV cần thiết để đảm bảo khả năng semi-nested PCR dương tính ở cả hai bước. nuôi cấy thành công TiLV là 3,32 x 102 bản sao/ Tương tự nghiên cứu của Ngô Huỳnh µL. Tuy nhiên, yếu tố độc lực của TiLV đối với Phương Thảo và ctv. (2020), trong nghiên cứu tế bào E-11 cũng cần xem xét thêm trong các trước đây, chúng tôi ghi nhận sự suy giảm khả nghiên cứu tiếp theo vì đây cũng là yếu tố quyết năng ly giải tế bào của mẫu VL160 và VL167 định khả năng ly giải tế bào ổn định của chủng sau 1-2 lần cấy chuyền trên dòng tế bào E-11. virus. Bên cạnh đó, phương pháp nuôi cấy đối Điều này cho thấy có ba yếu tố có thể ảnh hưởng với các mẫu mô cá nhiễm TiLV ở mức thấp cần đến khả năng duy trì sự tồn tại của các chủng được nghiên cứu và tối ưu để có thể phân lập TiLV bằng nuôi cấy tế bào, bao gồm độc lực được nguồn mẫu TiLV đa dạng, phong phú hơn. virus, mật độ virus và quy trình nuôi cấy. Trong Ngoài dòng tế bào E-11, nhiều dòng tế bào khác nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã tối ưu quy cũng đã được dùng để nuôi cấy TiLV, như tế trình cấy chuyền TiLV trên dòng tế bào E-11 bào não cá rô phi ban sơ (Eyngor et al., 2014), thông qua cách chọn thời điểm CPE thích hợp OmB, TmB (Kembou Tsofack et al., 2017), CFF (50%) để cấy chuyền, thay vì chọn mốc CPE (Behera et al., 2018), OnlB và OnlL (Thangaraj khoảng 80-90% như nghiên cứu trước. Chính vì et al., 2018). 50 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 22 - THÁNG 6/2022
  7. Ngoài dòng tế bào E-11, nhiều dòng tế bào khác cũng đã được dùng để nuôi cấy TiLV, như tế bào não cá rô phi ban sơ (Eyngor et al., 2014), OmB, TmB (Kembou Tsofack et al., 2017), VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II CFF (Behera et al., 2018), OnlB và OnlL (Thangaraj et al., 2018). Hình 2. Hình ảnh sau 1-7 ngày cảm nhiễm tế bào E-11 với dịch đồng nhất mẫu HB188, HD189 Hình 2. Hình ảnh sau 1-7 ngày cảm nhiễm tế bào E-11 với dịch đồng nhất mẫu HB188, HD189 và HB196. Dấu (*): vệt tan trên tế bào, dấu hiệu ly giải tế bào đặc trưng ở vật kính 4X. Dấu và HB196. Dấu (*): vệt tan trên tế bào, dấu hiệu ly giải tế bào đặc trưng ở vật kính 4X. Dấu (→): tế bào bị co tròn và bong tróc ở vật kính 20x. Mẫu TiLV-TL được dùng làm mẫu đối chứng dương. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 22 - THÁNG 6/2022 51
  8. (): tế bào bị co tròn và bong tróc ở vật kính 20x. Mẫu TiLV-TL được dùng làm mẫu đối VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II chứng dương. A P1-P5 P6-P7 B P1-P3 P4-P6 C P1-P6 Hình 3. Khả năng ly giải tế bào E-11 quả các đợt cấy chuyền (P, passage) của mẫu virus TiLV Hình 3. Khả năng ly giải tế bào E-11 quả các đợt cấy chuyền (P, passage) của mẫu virus TiLV HB188 (A), HD189 (B) và HB196 (C). Mũi tên xanh dương đại diện cho khả năng ly giải từ 40%- HB188 (A), HD189 (B) và HB196 (C). Mũi tên xanh dương đại diện cho khả năng ly giải từ 80% tế bào; mũi tên màu cam đại diện cho khả năng ly giải từ 0-40% tế bào. dpi: số ngày sau khi 40%-80% tế bào; mũi cảmmàu cam đại vào tế bào (day(s) post infection). tế bào. dpi: số ngày tên nhiễm virus diện cho khả năng ly giải từ 0-40% sau khi cảm nhiễm virus vào tế bào (day(s) post infection). 52 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 22 - THÁNG 6/2022
  9. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 4. Kiểm tra sự hiện diện của TiLV trong các dịch nuôi cấy mẫu HB188 (đợt cấy chuyền thứ Hình 4. Kiểm tra sự hiện diện của TiLV trong các dịch nuôi cấy mẫu HB188 (đợt cấy chuyền thứ 2), HD189 (đợt cấy chuyền thứvà HB196 (đợt cấy cấy chuyền thứ 3) bằng quy trình semi- 2), HD189 (đợt cấy chuyền thứ 2) 2) và HB196 (đợt chuyền thứ 3) bằng quy trình semi-nested nested RT-PCR. M:M: thang DNA O’Generuler 1kb (Thermo); (+): mẫu virus TiLV-TL RT-PCR. thang DNA O’Generuler 1kb (Thermo); (+): mẫu virus TiLV-TL V. KẾT LUẬN V. KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Virus TiLV đã được phát hiện tại nhiều Tài liệu tiếng Việt Virus TiLV đã được phát hiện tại nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Mặc dù Chi cục Chăn nuôi, Thú y và Thủy sản tỉnh Bình quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. tình hình nhiễm TiLV ở các trại nuôi cá rô phi tại Việt Nam 2017. Phòng,công bố nhiều và còn Dương, chưa được chống bệnh mới do Tilapia Mặc dù tình hình nhiễm TiLV ở các trại nuôi cá lake virus (TiLV) trên cá rô phi tại Việt Nam. rôtỷ lệtại Việt thấp, nhưng TiLV vẫnbố nhiềuđối tượng cần được nghiên cứuTrần Hạnh Triết,pháp ở phi nhiễm Nam chưa được công là một và Ngô Huỳnh Phương Thảo, để tìm ra giải Nguyễn Hoàng Thụy Vy, Lê Thị Thu Thảo, Bùi Nguyễn còn ở tỷ lệ nhiễm thấp, nhưng TiLV vẫn là một Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi ghi nhận hiệu quả để phòng trị dịch bệnh do TiLV gây ra. đối tượng cần được nghiên cứu để tìm ra giải 2 Chí Hiếu, Trần Thị Thanh Hương, Nguyễn Hoàng mẫu mô có mật độ nhiễm TiLV ở mức 3,32 x 10 bảnChi Mai, Lê Hoàng Thế Huy, Trần Nhựtvà sao virus/µL là thích hợp để phân lập Linh, pháp hiệu quả để phòng trị dịch bệnh do TiLV 2020. Điều chỉnh quy trình semi-nested RT-PCR gây ra. chủng TiLV bằng cách tại, chúng tôidòng tế bào E-11. Ngoài ra, quy trình real-time và bước duy trì Trong nghiên cứu hiện nuôi cấy với ghi chẩn đoán Tilapia Lake Virus (TiLV) RT- nhận mẫuSybr Greenđộ nhiễm lượngởTiLV 3,32 các mẫuphân lập TiLV cũngrô phi Việt Nam. Tạp chí PCR với mô có mật để định TiLV mức trong đầu bệnh phẩm từ cá được thiết lập với x 102hạn phát virus/µL là thíchsao virus/µL. lập trìnhNghề có sông Cửu Long, 18, 45–60. đoán giới bản sao hiện là 11,8 bản hợp để phân Quy cá này thể được ứng dụng để chẩn VASEP, 2016. Quyết định 1639/QĐ-BNN-TCTS và duy trì chủng TiLV bằng cách nuôi cấy với TiLV nhanh và chính xác tại các phòng thí nghiệm kiểm soát dịch bệnh thủy Nông nghiệp và Phát ngày 06/5/2016 của Bộ sản. dòng tế bào E-11. Ngoài ra, quy trình real-time triển Nông thôn về Quy hoạch phát triển nuôi cá LỜI CẢM ƠN RT-PCR với Sybr Green để định lượng TiLV rô phi đến năm 2020, định hướng đến năm 2030. trong các mẫu bệnhcứu trong bàiđược này đều thuộc nhiệm vụ Anh Các kết quả nghiên phẩm cũng báo thiết lập Tài liệu tiếngkhoa học công nghệ “Phân tích Behera, B. K., Pradhan, P. K., Swaminathan, T. vớigen phiênphát (transcriptome) của virus/µL. đỏ (Oreochromis spp.) nhằm sàng lọc các chỉ hệ giới hạn mã hiện là 11,8 bản sao cá rô phi R., Sood, N., Paria, P., Das, A., Verma, D. K., Quy trình này có thể được ứng dụng để chẩn thị phân tử tiềm năng có liên quan đến tính kháng virus TiLV (Tilapia LakeDev, A. K., Parida, P. Kumar, R., Yadav, M. K., virus)” (Mã số: đoán TiLV nhanh và chính xác tại các phòng thí K., Das, B. K., Lal, K. K., & Jena, J. K., (2018). TS01/19-21) do Sở Nông nghiệp sản. nghiệm kiểm soát dịch bệnh thủy và Phát triển Nông thôn Tp. HCM cấp kinh phí. associated with Emergence of Tilapia Lake Virus LỜI LIỆU ƠN TÀI CẢM THAM KHẢO mortalities of farmed Nile Tilapia Oreochromis niloticus (Linnaeus 1758) in India. Aquaculture, Tài liệu tiếng Việt nghiên cứu trong bài báo này Các kết quả 484, 168–174. https://doi.org/https://doi. đều cục Chăn nuôi, vụ khoa Thủycông nghệ “Phân 2017. Phòng, chống bệnh mới do Tilapia lake virus Chi thuộc nhiệm Thú y và học sản tỉnh Bình Dương, org/10.1016/j.aquaculture.2017.11.025 tích hệ gen trên cá rô phi tại Việt Nam. của cá rô Dong, H. T., Siriroob, S., Meemetta, W., (TiLV) phiên mã (transcriptome) phi đỏ (Oreochromis spp.) Hạnh Triết, Nguyễn Hoàng Thụy Vy, Lê Thị Thu Thảo, BùiGangnonngiw, W., Ngô Huỳnh Phương Thảo, Trần nhằm sàng lọc các Santimanawong, W., Nguyễn Chí Hiếu, Pirarat, N., Khunrae, P., Rattanarojpong, T., chỉ thị phân tử tiềm năng có liên Hoàng đến Mai, Lê Hoàng Thế Huy, Trần Nhựt Linh, 2020. Điều chỉnh Trần Thị Thanh Hương, Nguyễn quan Chi tính Vanichviriyakit, R., & Senapin, S. (2017a). kháng virus TiLV (Tilapia Lake chẩn đoán Tilapia Lake Virus (TiLV) và bước đầu phân lập TiLV từ cá rôand quy trình semi-nested RT-PCR virus)” (Mã số: Emergence of tilapia lake virus in Thailand TS01/19-21) do Sở Nông nghiệp và Phát triển an alternative semi-nested RT-PCR for detection. phi Việt Nam. Tạp chí Nghề cá sông Cửu Long, 18, 45–60. Nông thôn Tp. HCM cấp kinh phí. Aquaculture, 476, 111–118. https://doi.org/https:// VASEP, 2016. Quyết định 1639/QĐ-BNN-TCTS ngày 06/5/2016 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn doi.org/10.1016/j.aquaculture.2017.04.019 về Quy hoạch phát triển nuôi cá rô phi đến năm 2020, định hướng đến năm 2030. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 22 - THÁNG 6/2022 53
  10. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Dong, H. T., Siriroob, S., Meemetta, W., chain reaction for tilapia lake virus detection in Santimanawong, W., Gangnonngiw, W., clinical samples and experimentally challenged Pirarat, N., Khunrae, P., Rattanarojpong, T., fish. Journal of Fish Diseases, 41(2), 255–261. Vanichviriyakit, R., & Senapin, S. (2017b). https://doi.org/10.1111/jfd.12708 Emergence of tilapia lake virus in Thailand Thangaraj, R. S., Ravi, C., Kumar, R., Dharmaratnam, and an alternative semi-nested RT-PCR for A., Valaparambil Saidmuhammed, B., Pradhan, P. detection. Aquaculture, 476, 111–118. https://doi. K., & Sood, N. (2018). Derivation of two tilapia org/10.1016/J.AQUACULTURE.2017.04.019 (Oreochromis niloticus) cell lines for efficient Eyngor, M., Zamostiano, R., Kembou Tsofack, J. propagation of Tilapia Lake Virus (TiLV). E., Berkowitz, A., Bercovier, H., Tinman, S., Aquaculture, 492, 206–214. https://doi.org/https:// Lev, M., Hurvitz, A., Galeotti, M., Bacharach, doi.org/10.1016/j.aquaculture.2018.04.012 E., & Eldar, A. (2014a). Identification of a Novel Tsofack, J. E. K., Zamostiano, R., Watted, S., RNA Virus Lethal to Tilapia. Journal of Clinical Berkowitz, A., Rosenbluth, E., Mishra, N., Briese, Microbiology, 52(12), 4137–4146. https://doi. T., Lipkin, W. I., Kabuusu, R. M., Ferguson, org/10.1128/JCM.00827-14 H., Pozo, J. del, Eldar, A., Bacharacha, E., Eyngor, M., Zamostiano, R., Kembou Tsofack, J. Department, Japhette Esther Kembou Tsofack, a E., Berkowitz, A., Bercovier, H., Tinman, S., Rachel Zamostiano, a Salsabeel Watted, b Asaf Lev, M., Hurvitz, A., Galeotti, M., Bacharach, Berkowitz, B., Ezra Rosenbluth, B., Nischay E., & Eldar, A. (2014b). Identification of a Novel Mishra, C., Thomas Briese, C., W. Ian Lipkin, RNA Virus Lethal to Tilapia. Journal of Clinical c Richard M. Kabuusu, D., … Bacharach, E. Microbiology, 52(12), 4137–4146. https://doi. (2017). Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical org/10.1128/JCM.00827-14 Samples by Culturing and Nested. Journal of FAO. (2019). FAO Global Fishery and Aquaculture Clinical Microbiology, 55(3), 759–767. Production Statistics 1950–2017 v2019.1.0. Waiyamitra, P., Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., FishStatJ. Mongkolsuk, S., Nicholson, P., & Surachetpong, Hu, H., Zeng, W., Wang, Y., Wang, Q., Bergmann, S. W. (2018). A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia M., Yin, J., Li, Y., Chen, X., Gao, C., Zhang, D., lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture, Liu, C., REN, Y., & Shi, C. (2020). Development 497, 184–188. https://doi.org/https://doi. and application of a recombinant protein-based org/10.1016/j.aquaculture.2018.07.060 indirect ELISA for detection of anti-tilapia lake Wang, Y., Wang, Q., Bergmann, S. M., Li, Y., Li, virus IgM in sera from tilapia. Aquaculture, 520, B., Lv, Y., Yin, J., Yang, G., Qv, Y., Wang, Y., & 734756. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j. Zeng, W. (2021). Development and comparative aquaculture.2019.734756 evaluation of real-time PCR and real-time RPA Jansen, M. D., Dong, H. T., & Mohan, C. V. (2018). assays for detection of tilapia lake virus. Molecular Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia and Cellular Probes, 60, 101776. https://doi.org/ industry? Reviews in Aquaculture, 1–15. https:// https://doi.org/10.1016/j.mcp.2021.101776 doi.org/10.1111/raq.12254 Wang, Y., Wang, Q., Zeng, W., Yin, J., Li, Y., Ren, Saha, N. A. A.-N. A. A.-A. P. A.-T. G. C. A.-H. Y., Shi, C., Bergmann, S. M., & Zhu, X. (2018). (2022). Tilapia Lake Virus (TiLV) disease: Establishment and characterization of a cell line Current status of understanding. Aquaculture and from tilapia brain for detection of tilapia lake Fisheries, v. 7(1), 7-17–2022 v.7 no.1. https://doi. virus. Journal of Fish Diseases, 41(12), 1803– org/10.1016/j.aaf.2021.04.007 1809. https://doi.org/10.1111/jfd.12889 Tattiyapong, P., Dachavichitlead, W., & Surachetpong, Yin, J., Wang, Q., Wang, Y., Li, Y., Zeng, W., Wu, J., W. (2017). Experimental infection of Tilapia Ren, Y., Tang, Y., Gao, C., Hu, H., & Bergmann, Lake Virus (TiLV) in Nile tilapia (Oreochromis S. M. (2019). Development of a simple and rapid niloticus) and red tilapia (Oreochromis spp.). reverse transcription-loopmediated isothermal Veterinary Microbiology, 207, 170–177. https:// amplification (RT-LAMP) assay for sensitive doi.org/10.1016/j.vetmic.2017.06.014 detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., & Surachetpong, Diseases, 42(6), 817–824. https://doi.org/10.1111/ W. (2018). Development and validation of a jfd.12983 reverse transcription quantitative polymerase 54 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 22 - THÁNG 6/2022
  11. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II INVESTIGATING THE EFFECTS OF THE AMOUNT OF TILAPIA LAKE VIRUS (TiLV) ON VIRAL ISOLATION USING E-11 CELL LINE Tran Hanh Triet1, Nguyen Hoang Thuy Vy1, Ngo Huynh Phuong Thao1* ABSTRACT Tilapia Lake Virus (TiLV) is considered as a threat to tilapia aquaculture in many countries and continents. Although there are several studies on TiLV isolated from Vietnam, the information is still limited. In the current study, the effects of the TiLV amount in diseased fish tissues on the isolation of TiLV using the E-11 cell line were investigated. Five TiLV samples from Vietnam and one sample from Thailand were quantified by real-time RT-PCR before being used for the cell infection. Four samples (VL160, VL167, HB188 va HD189) had low viral loads (22-66 copies/ µL), while the sample HB196 had the highest TiLV amount of 2.95 x 107 copies/µL and the viral load in Thailand sample (TiLV-TL) was 3.32 x 102 copies/µL. Viral culture results showed that only two samples HB196 and TiLV-TL exhibited consistently the cytopathic effect after many passages, while the four remaining samples with the low TiLV copies lost their cell cytopathogenic effects after a few passages. These findings indicate that the viral load (minimum at 3.32 x 102 copies/µL) is very important for the TiLV isolation and culture using the E-11 cell line. Moreover, our study established a TiLV detection protocol using Sybr green based real-time RT-PCR with a detection limit of 11.8 copies/µL, which could be used by the diagnostic laboratory to manage the TiLV outbreaks at the farms. Keywords: Tilapia Lake virus, tilapia, real-time RT-PCR, E-11 cell line. Người phản biện: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Phước Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước Ngày nhận bài: 14/5/2022 Ngày nhận bài: 14/5/2022 Ngày thông qua phản biện: 30/5/2022 Ngày thông qua phản biện: 27/5/2022 Ngày duyệt đăng: 15/6/2022 Ngày duyệt đăng: 15/6/2022 1 Biotechnology Center of Ho Chi Minh City * Email: nhpthao.snn@tphcm.gov.vn TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 22 - THÁNG 6/2022 55
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
7=>1