Khảo sát tác dụng chống ung thư từ các cao chiết của lá bình bát nước (Annona glabra L. Annonaceae) với các phương pháp chiết xuất khác nhau

Chia sẻ: Mộ Dung Vân Thư | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

6
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài "Khảo sát tác dụng chống ung thư từ các cao chiết của lá bình bát nước (Annona glabra L. Annonaceae) với các phương pháp chiết xuất khác nhau" tiến hành khảo sát hoạt tính kháng ung thư của cao toàn phần thu được từ các phương pháp chiết xuất trên các dòng tế bào ung thư và đánh giá kết quả. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khảo sát tác dụng chống ung thư từ các cao chiết của lá bình bát nước (Annona glabra L. Annonaceae) với các phương pháp chiết xuất khác nhau

KHẢO SÁT TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƯ TỪ CÁC CAO CHIẾT CỦA LÁ BÌNH BÁT NƯỚC (ANNONA GLABRA L. ANNONACEAE) VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT KHÁC NHAU Phạm Hồng Thái, Trương Đỗ Quyên Khoa Dược, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh GVHD: ThS.DS. Trương Đỗ Quyên TÓM TẮT Mục tiêu: (i) Tiến hành thu hái, xử lý dược liệu lá của cây Bình bát nước (Annona glabra L,. Annonaceae), thử tinh khiết và định tính dược liệu. (ii) Thực hiện chiết xuất cao toàn phần bằng nhiều phương pháp như ngấm kiệt cổ điển (NKCĐ), ngấm kiệt ngược dòng gián đoạn (NDGĐ), chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn (CO2 STH). (iii) Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng ung thư của cao toàn phần thu được từ các phương pháp chiết xuất trên các dòng tế bào ung thư và đánh giá kết quả. Phương pháp nghiên cứu: Thử độ tinh khiết và định tính dược liệu theo DĐVN V và giáo trình bộ môn dược liệu của Đại học Y dược TP.HCM. Chiết xuất cao toàn phần từ dược liệu lá Bình bát nước bằng các phương pháp như: chiết bằng CO2 STH, chiết bằng phương pháp NKCĐ với hai dung môi khác nhau là cồn 70%, 50% và chiết bằng phương pháp NDGĐ với dung môi cồn 96%. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp Sulforhodamine B (SRB ) của các cao toàn phần trên các dòng tế bào ung thư gồm: tế bào ung thư vú (MCF-7), ung thư phổi (NCI-H460), ung thư gan (Hep-G2), ung thư máu (Jurkat), nguyên sợi bào (Fibroblast) và kết quả được đánh giá bằng thực nghiệm. Kết quả: Dược liệu lá Bình bát nước được thu hái, xử lý và chiết xuất thu được bốn loại cao toàn phần từ các phương pháp chiết xuất khác nhau. Các cao toàn phần chiết xuất từ lá Bình bát nước đều cho hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư rõ rệt, trong đó hoạt tính từ cao chiết bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn có kết quả đáng chú ý trên dòng tế bào ung thư vú và ung thư gan và cho hoạt tính kém hơn đáng kể so với mẫu chứng dương là Camptothecin trên tế bào thường. Từ khoá: Bình bát nước, phương pháp CO2 siêu tới hạn, thử độc tế bào. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bình bát nước (Annona glabra L. Annonacae) là một loài thực vật mọc hoang ven biển phổ biến tại Việt Nam (Bân, 2000). Loài cây này được công bố có nhiều hoạt tính hấp dẫn, điển hình như là tác dụng chống ung thư trên tế bào bạch cầu người (Cochrane và cs, 2008) đã được ghi nhận. Tuy nhiên, để khai thác được hoạt tính sinh học, đến nay vẫn là một thử thách lớn cho ngành nghiên cứu thực vật, khi mà việc sử dụng lá Bình bát nước trong điều trị bệnh ở nước ta là không có. Nắm bắt được tìềm năng đó và nhận thấy các kỹ thuật chiết xuất trong nghiên cứu dược liệu ngày càng phát triển đa dạng Nhằm khảo sát và đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết toàn phần lá Bình bát nước và tìm kiếm một phương pháp chiết xuất tiềm năng cho quá trình nghiên cứu lâu dài trên loài cây này, nhóm nghiên 368
cứu đã lựa chọn đề tài: “Khảo sát tác dụng chống ung thư từ các cao chiết của lá Bình bát nước (Annona glabra L. Annonaceae) với các phương pháp chiết xuất khác nhau”. 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu và thiết bị Nguyên liệu: Lá bình bát nước (thu hái tại Long An); cồn 96% (khoa Dược Hutech – TCCS); nước cất (Khoa Dược Hutech – TCCS); khí CO2 (Trung tâm Thông tin và Ứng dụng KHCN Hậu Giang – TCCS); các dòng tế bào ung thư (ATCC - TCCS); Trichloroacetic acid (ĐH KHTN – TCCS); Sulforhodamine B (ĐH KHTN – TCCS); Dimethyl sulfoxide (ĐH KHTN – TCCS); Camptothecine (ĐH KHTN – TCCS). Thiết bị: Bình ngấm kiệt hình nón cụt; hệ thống các thiết bị cho phương pháp chiết xuất CO2 siêu tới hạn; tủ sấy; bếp cách thuỷ; bếp hồng ngoại; máy cô quay chân không; cân phân tích; tủ lạnh; máy ELISA reader, cân sấy ẩm hồng ngoại A&D MX-50. 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thu hái và xử lý nguyên liệu Mẫu nghiên cứu lá cây Bình bát nước được thu hái tại huyện Cần Giuộc, Long An vào tháng 08/2022. Dược liệu khi thu hái đạt độ tươi tốt, không héo, không dập, không sâu bệnh, thu hái dược liệu không mang các ký sinh thực vật. Sau khi thu hái, dược liệu được rửa sạch, phơi khô và bảo quản trong túi kín và được dùng làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu. 3.2. Thử độ tinh khiết Độ ẩm: Xác định bằng cân sấy ẩm hồng ngoại A&D MX-50; Độ tro: xác định tro toàn phần theo phương pháp 1 PL 9.8 DĐVN V, xác định tro không tan trong acid theo phương pháp 1 PL 9.7 DĐVN V; Tạp chất lẫn trong dược liệu: theo PL 12.11 DĐVN V. 3.2.1. Định tính Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học dược liệu: Chất béo, Carotenoid, Tinh dầu, Triterpenoid tự do, Steroid, Alkaloid, Coumarin, Anthraglycosid, Flavonoid, Glycosid tim, Anthocyanosid, Proanthocyanin, Tannin, Saponin, Acid hữu cơ, Chất khử (Bộ môn dược liệu, 2020). 3.2.2. Các phương pháp chiết xuất dược liệu -Phương pháp ngấm kiệt cổ điển Nguyên liệu bột mịn lá Bình bát nước (900 g) được tận trích với dung môi cồn 70% (6 x 7 lít) trong bình ngấm kiệt hình nón cụt bằng phương pháp ngấm kiệt cổ điển, tốc độ dòng của dịch chiết khoảng 3 giọt/giây, lọc tạp chlorophyll bằng than hoạt tính và cô quay để loại bỏ dung môi thu được cao đặc toàn phần (453 g), ký hiệu là B7. Thực hiện chiết xuất tương tự theo quy trình chiết cao B7 với dung môi có nồng độ cồn 50%, thu được cao đặc toàn phần (418 g), ký hiệu là B5. -Phương pháp ngấm kiệt ngược dòng gián đoạn 369
Nguyên liệu bột mịn lá Bình bát nước (8 kg) được chia thành 5 phần bằng nhau và cho vào các bình ngấm kiệt. Dung môi dùng để chiết xuất là cồn 96% và được chiết xuất theo nguyên tắc: dịch chiết lần 1 sau khi rút từ bình I thì được để riêng, dịch chiết lần 2 từ bình I được dùng làm dung môi để ngâm dược liệu và trở thành dịch chiết 1 ở bình II, dịch chiết lần 3 từ bình I được dùng làm dung môi để ngâm dược liệu và trở thành dịch chiết 2 ở bình II và sau đó được dùng để chiết dịch chiết 1 của bình III cứ tiếp tục như vậy cho đến các bình chiết tiếp theo. Sau cùng gộp các dịch chiết đậm đặc lần 1 của các bình lại với nhau, lọc và cô quay loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm để thu cao đặc toàn phần (685 g), ký hiệu là B96. -Phương pháp chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn (Tú, 2014) Nguyên liệu bột mịn lá Bình bát nước (1,2 kg) được đưa vào một hệ thống khép kín gồm các thiết bị chuyên dụng để thực hiện chiết xuất bằng CO2 lỏng siêu tới hạn, với các thông số phù hợp đã được tinh chỉnh để chiết xuất trên lá. Sản phẩm thu được sẽ là cao toàn phần (105 g), sẽ hoàn toàn không còn tồn dư CO2 STH lẫn cao vì CO2 đã chuyển sang trạng thái khí và bay hơi toàn bộ sau khi được làm giảm áp suất. Cao toàn phần chiết xuất bằng phương pháp này ký hiệu là C2. 3.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học Sulforhodamine B (SRB) SRB (Sulforhodamine B) là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính trên tế bào của một chất bằng cách xác định hàm lượng protein tế bào thông qua đo mật độ quang học. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (Monks và cs,1991). Các dòng tế bào ung thư sẽ được nuôi cấy trong môi trường chuẩn và được cung cấp bởi ATCC (Hoa kỳ). Quy trình thực hiện (Tâm và cs, 2007) Các tế bào đơn sẽ được cấy trên đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ khoảng 104 tế bào/giếng (đối với các dòng tế bào Hep G2 và MCF-7); 7,5.103 tế bào/giếng (đối với dòng NCI H460) và 5.104 tế bào/giếng đối với dòng tế bào Jurkat. Sau 1 ngày, các tế bào phát triển nhanh tạo thành một quần thể tế bào. Quần thể này tiếp tục được ủ với các chất khảo sát ở nồng độ trong 2 ngày tiếp theo. Sau đó dùng dung dịch Trichloroacetic acid 50% lạnh (riêng đối với Jurkat là 70%) để cố định các protein tổng từ các tế bào thử nghiệm và thực hiện nhuộm với dung dịch Sulforhodamine B 0,2%. Kết quả được đọc bằng máy ELISA reader ở hai bước sóng 492 nm và 620 nm. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1. Chiết xuất cao toàn phần từ các phương pháp 370
Bảng 1: Kết quả thử độ tinh khiết dược liệu Hình 1: (Từ trái qua phải) A. Cao chiết bằng NKCĐ; B. Cao chiết bằng NDGĐ; C. Cao chiết bằng CO2 STH Nhận xét: Phương pháp NKCĐ chiết cao toàn phần có màu xanh đen, khi cắn có trạng thái dẻo. Phương pháp NDGĐ thu được cao toàn phần có màu nâu đen, khi cắn trang thái không dẻo bằng so với cao được chiết xuất bằng phương pháp NKCĐ. Cuối cùng, phương pháp chiết xuất bằng CO2 STH thu được cao toàn phần có màu nâu vàng và khi cắn cao tồn tại ở trạng thái dẻo (Hình 1). Kết luận: Về mặt cảm quan ban đầu, nhận thấy cao toàn phần lá Bình bát nước khi được chiết xuất bằng CO2 STH không có màu xanh đen như các cao toàn phần được chiết bằng các phương pháp khác, hạn chế được sự xuất hiện của chlorophyll (diệp lục) có trong cao, thể hiện được khả năng chọn lọc các nhóm hợp chất chiết xuất được và loại bỏ phần lớn tạp chất. 4.2. Thử độ tinh khiết và định tính Nhận xét: Trung bình phần trăm độ ẩm dược liệu là 11,80%, tro toàn phần 6,42%, tro không tan trong acid 2,97% và tạp chất lẫn trong dược liệu 1,03% (Bảng 1). Bảng 2: Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hoá học dược liệu 371
Ghi chú: (-): Không có (+): Có ít (++): Có (+++): Có nhiều Kết luận: Cao cồn 96%, 70%, 50% và bằng CO2 STH đều có chứa nhóm chất béo, tinh dầu, alkaloid, flavonoid, saponin, acid hữu cơ và chất khử. Cao cồn 96% và bằng CO2 STH còn chứa thêm nhóm triterpenoid tự do, steroid, glycosid tim. Các cao cồn 96%, 70% và 50% đều chứa tanin. Anthraglycosid có trong cao cồn 70% và 50%. Coumarin chỉ được tìm thấy trong cao cồn 96% (Bảng 2). 4.3. Thử hoạt tính sinh học - Kết quả thử hoạt tính sinh học trên cao B5 và B7: Bảng 3. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học củaNhận xét: Kết quả khảo sát tác dụng độc tế bào của hai cao chiết toàn phần B5 và B7 mẫu cao chiết B5 và B7 cho thấy ở nồng độ 100 mcg/mL khả năng gây độc ở dòng tế bào Hep-G2 (ung thư gan) là 46,97% và 49,47% so với mẫu chứng dương camptothecine 0,07 mcg/mL là 50,93%. Khả năng gây độc ở dòng tế bào MCF-7 (ung thư vú) là 40,52% và 43,46% so với mẫu chứng dương camptothecine 0,05 mcg/mL là 60,64%. Khả năng gây độc ở dòng tế bào NCI-H460 (ung thư phổi) là 40,02% và 33,44% so với mẫu chứng dương camptothecine 0,007 mcg/mL là 70,10%. Khả năng gây độc ở dòng tế bào Jurkat (ung thư máu) là 43,43% và 42,75% so với mẫu chứng dương camptothecine 0,05 mcg/mL là 74,01%. Khả năng gây độc trên dòng tế bào Fibroblast (nguyên bào sợi) là gần như không có (Bảng 3). - Kết quả thử hoạt tính sinh học trên cao B96 : Nhận xét: Kết quả khảo sát tác dụng độc tế bào của cao chiết toàn phần cho thấy ở nồng độ 100 mcg/mL khả năng gây độc ở dòng tế bào Jurkat (ung thư máu) là 52,61% so với mẫu chứng dương camptothecine 0,05 mcg/mL là 68,18%. Khả năng gây độc ở dòng tế bào Hep-G2 (ung thư gan) là 51,54% so với mẫu chứng dương camptothecine 0,07 mcg/mL là 51,08%. Khả năng gây độc ở dòng tế bào MCF-7 (ung thư vú) là 54,00% so với mẫu chứng dương camptothecine 0,01 mcg/mL là 44,15%. Khả năng gây độc ở 372
dòng tế bào NCI-H460 (ung thư phổi) là 56,74% so với mẫu chứng dương camptothecine 0,007 mcg/mL là 71,01%. Khả năng gây độc trên dòng tế bào Fibroblast (nguyên bào sợi) là không có (Bảng 4). - Kết quả thử hoạt tính sinh học trên cao C2: Bảng 5. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết toàn phần C2 Nhận xét: Kết quả khảo sát tác dụng độc tế bào của hai mẫu cao chiết C2 cho thấy ở nồng độ 100 mcg/mL khả năng gây độc ở dòng tế bào Hep-G2 (ung thư gan) là 60,53% so với mẫu chứng dương camptothecine 0,07 mcg/mL là 51,43%. Khả năng gây độc ở dòng tế bào MCF- 7 (ung thư vú) là 64,93% so với mẫu chứng dương camptothecine 0,05 mcg/mL là 59,30%. Khả năng gây độc ở dòng tế bào NCI-H460 (ung thư phổi) là 42,20% so với mẫu chứng Chú thích: TB: trung bình; ĐLC: độ lệch dương camptothecine 0,007 mcg/mL là 64,93%. chuẩn. Khả năng gây độc trên dòng tế bào Fibroblast (nguyên bào sợi) là 31,36%, tuy nhiên vẫn cho ảnh hưởng yếu hơn so với mẫu chứng dương camptothecine 2,5 mcg/mL là 47,89% (Bảng 5). Lưu ý: Cao bình bát toàn phần được pha loãng với dung môi dimethyl sulfoxide (DMSO). Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và dữ liệu. Camptothecine ở nồng độ khảo sát là mẫu chứng dương cho quy trình thử nghiệm hoạt tính sinh học. 5. KẾT LUẬN Qua quá trình nghiên cứu nhận thấy được tiềm năng rất lớn đối với việc chiết xuất cao lá Bình bát nước bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn. Cao chiết xuất từ phương pháp này có sự chọn lọc mạnh mẽ các hợp chất có hoạt tính nổi bật trên các dòng tế bào ung thư vú và ung thư gan so với mẫu chứng, có khả năng loại bỏ được phần lớn các tạp chất trong quá trình chiết xuất. Đây là một phát hiện nổi bật được ghi nhận của công trình nghiên cứu này, đặt tiền đề cho quá trình nghiên cứu phân lập hợp chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu lá cây Bình bát nước trong tương lai. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bân, N.T. (2000). Thực vật chí Việt Nam, Quyển 2, Họ Na (Annonaceae). Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật: Hà Nội. 2. Bộ môn Dược liệu (2020). Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Khoa Dược Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. 3. Cochrane, C.B., Nair, P.K., Melnick, S.J., Resek, A.P., & Ramachandran, C. (2008). Anticancer effects of Annona glabra plant extracts in human leukemia cell lines. Anticancer research, 28, 965-972. 4. Monks, A., Scudiero, D., Skehan, P.,…,& Boyd, M. (1991). Feasibility of a High-Flux Anticancer Drug Screen Using a Diverse Panel of Cultured Human Tumor Cell Lines. JNCI Journal of the National Cancer Institute, 83(11), 757–766. DOI:10.1093/jnci/83.11.757 373
5. Tâm, N.T.H., Vy, N.T., Trinh, T.T., Giang, N.T.T., Hạnh, N.N., & Dương, H.H.T. (2007). Chuẩn hóa thử nghiệm Sulforhodamin B (SRB) để xác định tính gây độc tế bào của hợp chất tự nhiên. Hội nghị khoa học toàn quốc 2007 - Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống - Quy Nhơn 10/08/2007 (tr. 809). 6. Tú, N.V. (2014). CO2 siêu tới hạn và ứng dụng. Báo cáo seminar nhiệt động kĩ thuật học. Trường Đại học Bách Khoa, Khoa Kỹ thuật hoá học. 374