Khóa luận tốt nghiệp: Sàng lọc in silico các hợp chất polyphenol có tác dụng ức chế enzym HMGCoA reductase định hướng điều trị rối loạn lipid máu

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:74

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn "Sàng lọc in silico các hợp chất polyphenol có tác dụng ức chế enzym HMGCoA reductase định hướng điều trị rối loạn lipid máu" nghiên cứu sàng lọc các hợp chất polyphenol có tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase bằng phương pháp docking phân tử; đánh giá các đặc điểm giống thuốc và phân tích các thông số dược động học và độc tính của các hợp chất tốt nhất thu được sau quá trình sàng lọc.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Sàng lọc in silico các hợp chất polyphenol có tác dụng ức chế enzym HMGCoA reductase định hướng điều trị rối loạn lipid máu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC --------- VŨ THỊ THU THỦY SÀNG LỌC IN SILICO CÁC HỢP CHẤT POLYPHENOL CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM HMG-COA REDUCTASE ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID MÁU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2022
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC --------- Người thực hiện: VŨ THỊ THU THỦY SÀNG LỌC IN SILICO CÁC HỢP CHẤT POLYPHENOL CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM HMG-COA REDUCTASE ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID MÁU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (DƯỢC HỌC) Khóa : QH.2017.Y Người hướng dẫn : PGS. TS. Vũ Mạnh Hùng ThS. Nguyễn Thị Huyền Hà Nội – 2022
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy PGS.TS. Vũ Mạnh Hùng công tác tại Học viện Quân y và cô ThS. Nguyễn Thị Huyền công tác tại trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, động viên em hoàn thành khóa luận này. Em xin đặc biệt gửi lời cảm ơn đến PGS.TS. Bùi Thanh Tùng, trưởng bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, góp ý giúp em kịp thời sửa chữa, hoàn thiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn tới bạn Tạ Thị Thu Hằng, cùng các bạn nhóm nghiên cứu sàng lọc ảo, sinh viên lớp K62 Dược học, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình hỗ trợ em trong quá trình thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo, thầy cô Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để em được học tập, nghiên cứu, rèn luyện tại đây trong suốt 5 năm qua và thực hiện đề tài này. Sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em và bạn bè luôn sát cánh, đồng hành, ủng hộ, động viên tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu hoàn thành khóa luận. Mặc dù đã có nhiều cố gắng, song với kiến thức, kỹ năng và thời gian còn hạn chế, luận văn của em khó tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 31 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Vũ Thị Thu Thủy
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng anh Tiếng việt RLLPM Rối loạn lipid máu HMGCR HMG-CoA reductase TC Total cholesterol Cholesterol toàn phần Low density lipoprotein - Cholesterol của lipoprotein tỉ LDL -c Cholesterol trọng thấp High density lipoprotein- Cholesterol của lipoprotein tỉ HDL-c Cholesterol trọng cao Very low density lipoprotein - Cholesterol của lipoprotein tỉ VLDL-c Cholesterol trọng rất thấp Intermediate density lipoprotein - Cholesterol của lipoprotein tỉ IDL-c Cholesterol trọng trung gian Non- High density lipoprotein- Cholesterol không lipoprotein non- HDL- c Cholesterol tỉ trọng cao TG Triglycerid CM Chylomicron 3-hydroxy-3-methylglutaryl HMG-CoA coenzyme A Absorption, Distribution, Hấp thu, Phân bố, Chuyển ADMET Metabolism, Excretion, Toxicity hóa, Thải trừ, Độc tính CSDL Cơ sở dữ liệu Độ lệch bình phương trung RMSD Root mean square deviation bình
DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Vị trí hoạt động của HMGCR người phức hợp với HMG, CoA và NADP .... 7 Hình 1.2. Biểu diễn liên kết của Fluvastatin với HMGCR tại vị trí hoạt động ............... 8 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của HMG-CoA và các statin ............................................... 9 Hình 2.1. Cấu trúc 3D của 1HWI được tải về từ CSDL Protein Data Bank ................. 17 Hình 3.1. Minh họa quá trình sàng lọc in silico ............................................................ 21 Hình 3.2. RMSD của fluvastatin đồng kết tinh trước và sau khi re-dock ..................... 21 Hình 3.3. Minh họa hai chiều các tương tác của chứng dương tại vị trí hoạt động. ..... 24 Hình 3.4. Tương tác của 5 hợp chất với HMGCR ........................................................ 36
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại RLLPM theo Fredrickson ............................................................... 3 Bảng 3.1. Kết quả docking các phân tử vào đích HMGCR........................................... 25 Bảng 3.2. Kết quả đánh giá quy tắc 5 tiêu chí Lipinski ................................................. 28 Bảng 3.3. Kết quả phân tích các đặc tính hấp thu, phân bố và chuyển hóa .................. 31 Bảng 3.4. Kết quả phân tích các đặc tính thải trừ và độc tính ....................................... 32 Bảng 3.5. Kết quả phân tích mô phỏng docking ........................................................... 37
MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về bệnh rối loạn lipid máu ................................................................... 2 1.1.1. Bệnh rối loạn lipid máu ................................................................................... 2 1.1.2. Điều trị rối loạn lipid máu ............................................................................... 4 1.2. Tổng quan về enzym HMG-CoA reductase .......................................................... 5 1.2.1. Sinh tổng hợp cholesterol và vai trò của HMG-CoA reductase ...................... 5 1.2.2. Cấu trúc của HMG-CoA Reductase ................................................................ 6 1.2.3. Một số chất ức chế HMG-CoA Reductase ...................................................... 8 1.3. Tổng quan về nhóm hợp chất polyphenol ........................................................... 11 1.4. Tổng quan về nghiên cứu in silico ....................................................................... 12 1.4.1. Kỹ thuật docking phân tử .............................................................................. 13 1.4.2. Quy tắc Lipinski về các hợp chất giống thuốc .............................................. 15 1.4.3. Dự đoán các thông số dược động học và độc tính (ADMET) ...................... 15 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 17 2.1. Nguyên liệu và thiết bị ......................................................................................... 17 2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................................ 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 18 2.3.1. Sàng lọc bằng docking phân tử ..................................................................... 18 2.3.2. Nghiên cứu các đặc điểm giống thuốc .......................................................... 20 2.3.3. Nghiên cứu các đặc tính dược động học và độc tính (ADMET) .................. 20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ .............................................................................................. 21 3.1. Đánh giá quy trình docking ................................................................................. 21 3.2. Tìm kiếm các chất tiềm năng từ kết quả docking ................................................ 22 3.3. Sàng lọc các hợp chất giống thuốc ...................................................................... 27 3.4. Dự đoán các thông số ADMET ........................................................................... 31 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ........................................................................................... 39 4.1. Về kết quả ............................................................................................................ 39 4.1.1. Silidianin (ID: 11982272) ............................................................................. 39 4.1.2. 11-Hydroxytephrosin (ID: 155725) .............................................................. 40 4.1.3. Sanggenol L (ID: 11796489) ......................................................................... 40 4.1.4. Sanggenon N (ID: 42608044) ....................................................................... 41 4.1.4. Kuwanon E (ID: 6440408) ............................................................................ 41 4.2. Về phương pháp ................................................................................................... 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn lipid máu (RLLPM) là thách thức lớn đối với sức khỏe cộng đồng do tỷ lệ mắc bệnh cao và có mối quan hệ mật thiết với các bệnh tim mạch. Theo thống kê năm 2018 của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ người trưởng thành mắc RLLPM là 39%, tỷ lệ này ở châu Âu là 54%, châu Mĩ là 48%, châu Phi là 22,6% và ở Đông Nam Á là 29% [4]. Tại Việt Nam, theo thống kê năm 2015 của Bộ Y tế, có khoảng 30,2% người có tổng cholesterol trong máu ≥ 5,0 mmol/L hoặc đang điều trị bằng thuốc điều trị tăng cholesterol [7]. RLLPM là nguyên nhân chính góp phần hình thành và phát triển vữa xơ động mạch và là yếu tố nguy cơ hàng đầu của các bệnh tim mạch. Thống kê của Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ cho thấy, những người bị RLLPM có nguy cơ phát triển bệnh tim mạch tăng gấp đôi so với những người có mức lipid bình thường [41]. Điều trị RLLPM trở thành mục tiêu trong các biện pháp dự phòng tiên phát và thứ phát các bệnh tim mạch. Enzym HMG-CoA reductase (HMGCR) là enzym giới hạn tốc độ quá trình tổng hợp cholesterol, do đó được coi là một mục tiêu quan trọng trong các nghiên cứu phát triển thuốc điều trị RLLPM. Nhiều dược chất đã được phát triển với mục tiêu ức chế HMGCR như lorvastatin, simvastatin, fluvastatin...Tuy nhiên, các thuốc này có một số tác dụng không mong muốn khi sử dụng lâu ngày như gây đau cơ, độc tính cho gan, thận, đái tháo đường ....[42]. Do đó, việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có độc tính thấp hơn, tác dụng tốt hơn và dung nạp rộng thay thế cho statin trong điều trị RLLPM là rất cần thiết. Trong số các hợp chất chiết xuất từ thực vật, polyphenol cho thấy nhiều lợi ích trong việc bảo vệ sức khỏe tim mạch người. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy tiềm năng của polyphenol trong làm giảm cholesterol, đặc biệt là tác dụng ức chế enzym HMGCR [3, 65]. Tuy nhiên, các nghiên cứu tập trung thực hiện in vitro, chưa nhiều nghiên cứu cụ thể về tương tác ở cấp độ phân tử của các hợp chất polyphenol với HMGCR. Trên cơ sở đó, đề tài “Sàng lọc in silico các hợp chất polyphenol có tác dụng ức chế enzym HMG- CoA reductase định hướng điều trị rối loạn lipid máu” được tiến hành với 2 mục tiêu chính: 1. Sàng lọc các hợp chất polyphenol có tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase bằng phương pháp docking phân tử. 2. Đánh giá các đặc điểm giống thuốc và phân tích các thông số dược động học và độc tính của các hợp chất tốt nhất thu được sau quá trình sàng lọc. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh rối loạn lipid máu 1.1.1. Bệnh rối loạn lipid máu Theo hướng dẫn chẩn đoán và điều trị của Bộ Y tế, rối loạn lipid máu (RLLPM) là tình trạng bệnh lý khi có một hoặc nhiều thông số lipid bị rối loạn (tăng cholesterol toàn phần (TC) hoặc tăng triglicerid (TG), hoặc tăng LDL-cholesterol (LDL-c), hoặc giảm HDL-cholesterol (HDL-c)…). RLLPM thường được phát hiện cùng lúc với mội số bệnh lý tim mạch - nội tiết - chuyển hóa. Đồng thời RLLPM cũng là yếu tố nguy cơ của bệnh lý này [1]. Khoảng 60-70% trường hợp RLLPM là do đột biến gen làm tăng sản xuất hoặc giảm đào thải TG, cholesterol, hoặc giảm sản xuất hoặc tăng đào thải HDL-c (RLLPM nguyên phát), và có khoảng 30-40% trường hợp là do các nguyên nhân thứ phát (RLLPM thứ phát), trong đó hay gặp nhất là do lối sống ít vận động với chế độ ăn giàu chất béo bão hòa, cholesterol và mỡ động vật [14, 58]. Các nguyên nhân thứ phát phổ biến khác có thể kể đến như: đái tháo đường, uống nhiều rượu bia, bệnh thận mạn tính, suy giáp trạng, xơ gan mật nguyên phát, sử dụng các thuốc như thiazid, chẹn β giao cảm, estrogen, progestin, glucocorticoid, thuốc chống loạn thần không điển hình (clozapine, olanzapine), tacrolimus và cyclosporine [14]. RLLPM được nghi ngờ ở những bệnh nhân có dấu hiệu đặc trưng của RLLPM trên lâm sàng như thể trạng béo phì, ban vàng, hoặc các biến chứng ở một số cơ quan như tai biến mạch máu não, bệnh mạch vành…[1]. RLLPM nguyên phát được nghi ngờ khi bệnh nhân có dấu hiệu như u vàng ở gân (tendon xanthomas), khởi phát bệnh xơ vữa động mạch sớm ( nam < 55 tuổi, nữ < 60 tuổi), tiền sử gia đình bị bệnh xơ vữa động mạch, hoặc cholesterol máu > 190 mg / dL (> 4.9 mmol/L) [38]. Chẩn đoán RLLPM bằng cách định lượng lipid huyết thanh. Các thông số thường được khảo sát gồm: cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-c, HDL-c. Chẩn đoán xác định khi có một hoặc nhiều rối loạn như sau:  Cholesterol máu > 5,2 mmol/L (200mg/dL)  Triglycerid > 1,7 mmol/L (150mg/dL)  LDL-cholesterol > 2,58mmol/L (100mg/dL) 2
 HDL-cholesterol < 1,03mmol/L (40 mmol/L) [1] Có nhiều cách phân loại RLLPM. Năm 1956, dựa trên đặc điểm tăng nồng độ lipid và lipoprotein máu, Fredrickson đã chia RLLPM thành 5 typ [18]. Phân loại này tương đối khó áp dụng trong thực hành lâm sàng. Phân loại của De Gennes đơn giản và dễ áp dụng trên lâm sàng hơn, chia RLLM thành 3 loại là: tăng cholesterol máu đơn thuần, tăng triglycerid máu đơn thuần và tăng lipid máu hỗn hợp [6]. Bảng 1.1. Phân loại RLLPM theo Fredrickson Typ I IIa IIb III IV V Đặc điểm Cholesterol (TC) + +++ ++ ++ BT/+ ++ Triglycerid (TG) +++ BT + ++ ++ +++ Loại lipoprotein LDL, CM, CM LDL IDL VLDL tăng VLDL VLDL BT: Bình thường ++: Tăng trung bình Chú thích + : Tăng nhẹ +++: Tăng cao Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ người mắc RLLPM năm 2008 là 37% ở nam và 40% ở nữ và được cho là nguyên nhân gây ra 2,6 triệu ca tử vong trên toàn cầu (chiếm 4,5% tổng số ca tử vong) [4]. Nhiều nghiên cứu lâm sàng đã đồng thuận: RLLPM là một trong các yếu tố nguy cơ hàng đầu của bệnh tim mạch (CVD), bao gồm bệnh mạch vành (nhồi máu cơ tim), tai biến mạch máu não (đột quỵ), bệnh thấp tim, nhồi máu cơ tim (MI), đau thắt ngực ổn định (SA), đau thắt ngực không ổn định (UA), bệnh động mạch ngoại biên [28, 31, 52]. Tác động của RLLPM làm tăng nguy cơ mắc các bệnh lý tim mạch thông qua cơ chế làm xơ vữa mạch máu. Khi nồng độ LDL-c trong huyết tương quá cao, nhất là các dạng LDL có kích thước nhỏ và đậm đặc, LDL có cơ hội chui vào lớp dưới nội mạch của thành mạch. Tại đây, LDL bị oxy hóa. Các dạng LDL đã bị oxy hóa dễ bị các tế bào bạch cầu đơn nhân thực bào một cách không có giới hạn. Việc thực bào không có giới hạn này tạo ra các tế bào bọt chứa đầy lipid, khởi đầu cho việc hình thành sang thương xơ vữa ở thành động mạch. Mảng xơ vữa ngày càng lớn lên, chiếm thể tích ngày càng nhiều trong lòng động mạch vành, làm hẹp lòng động mạch vành dẫn đến giảm lượng máu, oxy cung cấp cho tim và hậu quả là thiếu máu cơ tim cục bộ [63]. Trên toàn cầu vào năm 2019, thiếu máu cơ tim cục bộ (IHD) gây ra 3
8,54 triệu người chết, trong đó 3,78 triệu người được cho là do nồng độ LDL-c trong huyết tương cao, đột quỵ do thiếu máu cục bộ gây ra 2,73 triệu người tử vong, trong đó 0,61 triệu người được cho là do mức LDL-c trong huyết tương cao [46]. 1.1.2. Điều trị rối loạn lipid máu Điều trị RLLPM có vai trò quan trọng trong dự phòng tiên phát và thứ phát bệnh tim mạch. Trước khi tiến hành điều trị, cần phân tầng bệnh nhân theo nguy cơ bệnh tim mạch, kết hợp với kết quả xét nghiệm thành phần lipid máu, từ đó xác định được đích của mục tiêu điều trị và chiến lược điều trị thích hợp. Hầu hết những hướng dẫn thực hành điều trị RLLPM đều phân tầng nguy cơ dựa trên thang điểm SCORE hay Framingham. Khuyến cáo của Hội Tim mạch học Quốc gia Việt Nam 2015 sử dụng thang điểm SCORE để phân tầng nguy cơ. Khuyến cáo cũng chỉ ra LDL-c là mục tiêu điều trị giá trị nhất của RLLPM; non-HDL-c (non-HDL-c = CT - HDL-c) là mục tiêu tiếp theo, tùy theo phân tầng nguy cơ của bệnh nhân để xác định đích của các mục tiêu này cần đạt và quyết định thời điểm bắt đầu, cần điều trị bằng thay đổi lối sống hay bằng thuốc [2]. Thay đổi lối sống là biện pháp bắt buộc đối với mọi bệnh nhân điều trị RLLPM, bao gồm chế độ ăn uống và chế độ luyện tập. Đối với chế độ ăn, người bệnh cần thay thế chất béo bão hòa bằng chất béo không bão hòa đơn và chất béo không bão hòa đa có nguồn gốc thực vật, đồng thời khuyến khích sử dụng các thực phẩm như trái cây, rau, các loại đậu, các loại hạt, ngũ cốc nguyên hạt, bánh mì, cá để giảm lượng năng lượng tiêu thụ từ chất béo xuống < 35%, chất béo bão hòa xuống < 7%, chất béo dạng trans xuống < 1% và cholesterol xuống < 300 mg/ngày. Lượng carbohydrate nên nằm trong khoảng từ 45-55% tổng năng lượng, đồng thời hạn chế các thực phẩm có đường nhằm đảm bảo lượng đường bổ sung không được vượt quá 10% tổng năng lượng. Ngoài ra, người bệnh cũng cần hạn chế sử dụng đồ uống có cồn (≤ 10 g/ngày), tránh hút thuốc và tiếp xúc với thuốc lá. Về chế độ luyện tập, khuyến khích người bệnh nên tập thể dục thường xuyên ở cường độ vừa phải, ít nhất ≥30 phút/ngày [38]. Trong điều trị bằng thuốc, có thể sử dụng các nhóm thuốc như statin, ezetimibe, nhóm resin, nhóm fibrate, nhóm acid nicotinic, omega 3 để điều trị RLLPM theo từng loại: 4
Với bệnh nhân tăng LDL-c, sau khi xác định mức LDL-c mục tiêu, lựa chọn loại statin với liều thích hợp để đạt được mức LDL-c mục tiêu. Trường hợp không dung nạp statin có thể xem xét sử dụng thuốc ức chế hấp thu cholesterol. Nếu không đạt được mục tiêu điều trị thì phối hợp statin với thuốc ức chế hấp thu cholesterol (ezetimibe). Với bệnh nhân có triglycerid cao, nếu TG từ 150 – 200 mg/dl, chỉ cần sử dụng biện pháp điều chỉnh lối sống. Nếu TG từ 200 – 499 mg/dL, tính non-HDL-c và điều trị theo mục tiêu non-HDL-c như điều trị RLLM hỗn hợp. Nếu TG ≥ 500 mg/dl, dùng thuốc làm giảm TG như fibrate hoặc acid béo n-3 hoặc phối hợp statin với fibrate hoặc xem xét kết hợp fibrate với acid béo n-3, với mục tiêu ngừa viêm tụy cấp. Với bệnh nhân có RLLPM hỗn hợp, statin vẫn là liệu pháp hàng đầu cho cả mục tiêu LDL–c và non-HDL-c, tuy nhiên khi không đạt mục tiêu thì nên xem xét phối hợp thêm thuốc thứ hai. Phối hợp statin với fibrate có thể ưu tiên xem xét, đặc biệt khi có HDL-c thấp và TG tăng. Nếu TG vẫn chưa kiểm soát được bằng statin hoặc fibrate, có thể cho thêm omega 3 [2]. 1.2. Tổng quan về enzym HMG-CoA reductase 1.2.1. Sinh tổng hợp cholesterol và vai trò của HMG-CoA reductase LDL là lipoprotein chính vận chuyển cholesterol trong máu. Mức cholesterol trong huyết tương chủ yếu được kiểm soát bởi các LDL receptor, một glycoprotein trên bề mặt tế bào gan chịu trách nhiệm loại bỏ LDL khỏi tuần hoàn. Số lượng các LDL receptor này lại được điều chỉnh bởi hàm lượng cholesterol trong tế bào gan. Khi hàm lượng cholesterol trong tế bào gan tăng lên sẽ làm giảm biểu hiện của các LDL receptor dẫn đến tăng nồng độ LDL trong huyết tương. Ngược lại, các biện pháp làm giảm hàm lượng cholesterol trong tế bào gan như ức chế tổng hợp cholesterol sẽ kích thích sản xuất LDL receptor và làm giảm mức LDL trong huyết tương. Do đó tác động đến quá trình tổng hợp cholesterol ở gan có ý nghĩa lớn trong điều trị RLLPM [22]. Quá trình tổng hợp cholesterol diễn ra ở tất cả các loại tế bào. Tuy nhiên, gan đại diện cho cơ quan chính tổng hợp cholesterol nội sinh, đóng góp vào khoảng 80% tổng số cholesterol được sản xuất ở người [56]. Quá trình tổng hợp cholesterol ở gan gồm 4 giai đoạn: tổng hợp mevalonate; chuyển mevalonate thành isoprenes hoạt hóa; hình thành squalene; đóng vòng squalene tạo vòng sterol [9]. Ở giai đoạn tổng hợp mevalonate, ban đầu hai phân tử acetyl-CoA ngưng tụ tạo thành acetoacetyl-CoA nhờ 5
enzyme acetyl-CoA acetyltransferase (ACAT). Tiếp theo acetoacetyl-CoA phản ứng với acetyl CoA xúc tác bởi HMG-CoA synthase để tạo thành HMG-CoA, phân tử này sau đó bị khử tạo thành mevalonate. Trong động học hóa học, tốc độ phản ứng chung của một phản ứng nhiều giai đoạn nối tiếp được quyết định bởi tốc độ của bước chậm nhất, còn gọi là bước giới hạn tốc độ (rate-limiting step). Bước giới hạn tốc độ quyết định tốc độ của quá trình tổng hợp cholesterol ở gan là bước khử HMG-CoA thành mevalonate và enzym xúc tác cho phản ứng này là HMGCR [19]. ( S ) -HMG-CoA + 2 NADPH + 2 H + → ( R ) -mevalonate + 2 NADP + + CoA-SH. Phản ứng này gồm 3 ba giai đoạn trong đó giai đoạn 1 và 3 là hai giai đoạn khử, giai đoạn 2 là loại nhóm CoA thiol ra khỏi mevaldyl-CoA để tạo thành mevaldehyde:  Giai đoạn 1: HMG-CoA + NADPH + H + → [Mevaldyl-CoA] + NADP +  Giai đoạn 2: [Mevaldyl-CoA] → [Mevaldehyde] + CoA-SH  Giai đoạn 3: [Mevaldehyde] + NADPH + H + → Mevalonate + NADP + HMGCR là enzym xúc tác cho bước quyết định tốc độ tổng hợp cholesterol. Do đó, những thay đổi trong hoạt động của HMGCR song song với những thay đổi trong tổng hợp cholesterol. Tác động của enzym này đối với con đường mevalonat đã được đánh giá thông qua các công trình thử nghiệm khác nhau, chẳng hạn như công trình của Chappell và cộng sự, trong đó, sau khi đưa gen HMGCR từ chuột vào cây thuốc lá, hoạt động của enzyme trở nên không kiểm soát và sự tích tụ sterol tăng lên 3–10 lần [10]. Vì tầm quan trọng của HMGCR trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol nên enzym này được coi như là enzym đích chính để điều trị RLLPM. 1.2.2. Cấu trúc của HMG-CoA Reductase Thông tin cấu trúc của HMGCR người được Istvan và các cộng sự tìm ra đầu tiên vào năm 2000. HMGCR người là một chuỗi polipeptid gồm 888 acid amin bao gồm 3 miền: miền xuyên màng (các gốc từ 1-339) nằm trong màng lưới nội chất, miền xúc tác chứa vị trí hoạt động của enzym nằm trong tế bào chất (các gốc từ 460 - 888) và miền liên kết (các gốc từ 340 - 459) nối hai phần của enzym. Miền xúc tác của HMGCR là một tetramer được tạo ra bởi bốn monomer giống nhau. Mỗi monomer được cuộn quanh một monomer khác tạo thành dimer. Mỗi tetramer chứa bốn vị trí hoạt động, hai vị trí trong mỗi dimer, vị trí hoạt động được tạo thành từ các gốc acid amin của hai monomer khi liên kết với nhau [26]. 6
Vị trí hoạt động của enzym HMGCR là một khoang lớn nằm ở mặt phân cách giữa monomer-monomer, được chia thành ba vị trí liên kết khác nhau: vị trí liên kết HMG, CoA và NADPH. Vị trí liên kết NADPH gồm các gốc Ser626, Arg627, Phe628, Asp653, Met655, Gly656, Met657, Asn658, Val805, Asn870, Arg871. Vị trí liên kết CoA bao gồm các gốc Ser565, Asn567, Arg568, Lys722, Ser865, His866 và Tyr479. Và vị trí liên kết HMG được hình thành bởi các gốc Ser684, Asp690, Lys691, Lys692, Asp767 từ một monomer và Glu559, Lys735, Asn755, Leu853, His866 từ monomer khác. Đây cũng là vị trí xúc tác của enzyme [26]. (Hình 1.2). Trong đó, acid amin His866 tham gia vào quá trình proton hóa anion CoA thiol trong giai đoạn 2 của phản ứng khử HMG-CoA thành mevalonate. Lysine (Lys735 và Lys691) tạo liên kết hydro với nhóm cacbonyl của HMG-CoA và tham gia ổn định oxy tích điện âm của mevaldyl-CoA. Aspartate (Asp690, Asp767) tham gia vào hai giai đoạn phản ứng khử. Ở giai đoạn khử thứ hai, Asp767 làm tăng pKa của Glu559 giúp Glu559 bổ sung một proton cho mevaldehyde. Một số acid amin khác như Asn755, Ser864 liên kết với nhóm cacboxylat của HMG-CoA bằng liên kết hydro, tạo túi kỵ nước trên HMG-CoA và điều chỉnh hoạt tính xúc tác HMGCR [34]. Hình 1.1. Vị trí hoạt động của HMGCR người phức hợp với HMG, CoA và NADP Một monome có màu vàng, monome khác có màu xanh lam. HMG và CoA có màu tím; NADP có màu xanh lục. 7
Hình 1.2. Biểu diễn liên kết của Fluvastatin với HMGCR tại vị trí hoạt động Cấu trúc của phức hợp HMGCR- fluvastatin được sử dụng để xác định vị trí hoạt động của phân tử. Fluvastatin là một chất ức chế HMGCR bằng cách chiếm túi liên kết HMG và một phần vị trí liên kết CoA. Giống như hầu hết các statin, fluvastatin liên kết với HMGCR thông qua liên kết phân cực với các gốc Ser684, Asp690, Lys691, Lys692 và tạo liên kết hydro giữa nhóm O5-hydroxyl ở phần hydroxyglutartic acid của fluvastatin với Glu559 và Asp767 của HMGCR. Người ta cho rằng, sự liên kết chặt chẽ của fluvastatin có thể là do số lượng lớn các tương tác van der Waals giữa cấu trúc vòng kỵ nước của fluvastatin với các gốc Leu562, Val683, Leu853, Ala856 và Leu857 của HMGCR. Ngoài ra, với các statin loại 2 có chứa nhóm fluorophenyl như fluvastatin, còn có tương tác bổ sung giữa nguyên tử flo của nhóm fluorophenyl với nhóm guanidinium của Arg590. Những tương tác này giúp fluvastatin vượt qua HMG-CoA, cơ chất của HMGCR, liên kết với HMGCR (Hình 1.3). Từ đây có thể kết luận, một số acid amin như Glu559, Arg590, Ser684, Asp690, Asp767, Lys691, Lys692, Lys735, Asn755 đóng vai trò quan trọng, nhắm vào những acid amin này có thể ức chế hoạt tính HMGCR [25]. 1.2.3. Một số chất ức chế HMG-CoA Reductase Các chất ức chế HMGCR (thường được gọi là statin) là nhóm thuốc được khuyến cáo đầu tay trong điều trị RLLPM. Hiện nay, có 7 loại thuốc ức chế HMGCR lưu hành trên thị trường bao gồm: lovastatin, pravastatin và simvastatin có nguồn gốc từ các chất chuyển hóa nấm được gọi là các statin loại 1; atorvastatin, fluvastatin, pitavastatin và rosuvastatin là các hợp chất tổng hợp hoàn toàn, được gọi là các statin loại 2 [13]. Cấu 8
trúc của các statin được chia thành ba phần: 1) Phần cấu trúc tương tự cơ chất HMG- CoA có thể ở dạng chuỗi mở (pravastatin, pitavastatin, fluvastatin, atorvastatin, rosuvastatin) hoặc dạng lacton vòng kín (lovastatin, simvastatin); 2) Cấu trúc vòng kỵ nước cho phép liên kết chặt chẽ với enzym; 3) Một nhóm phụ được gắn trên cấu trúc vòng, xác định đặc tính dược động học của thuốc [20]. Lovastatin là thuốc ức chế HMGCR đầu tiên được sử dụng trên lâm sàng kể từ năm 1987. Sau đó, simvastatin và pravastatin lần lượt ra đời, có cấu trúc không khác nhiều so với cấu trúc lovastatin. Cả ba đều có cấu trúc vòng napthylene và nhóm phụ là nhóm butyryl. Simvastatin và lovastatin là những lactone không hoạt động phải được chuyển hóa thành các dạng hydroxy-acid hoạt động để ức chế HMGCR [23]. Các statin loại 2 đều ở dạng hydroxy-acid hoạt động và có nhóm phụ là nhóm fluorophenyl. Nhóm này tạo tương tác cực bổ sung với HMGCR, giúp các statin loại 2 liên kết chặt chẽ hơn với đích [25]. Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của HMG-CoA và các statin Tất cả các statin đều ức chế tổng hợp cholesterol tại gan, có chỉ định điều trị, tác dụng không mong muốn và chống chỉ định tương tự nhau. Sau khi uống, các statin hấp thu nhanh và chuyển hóa mạnh bước đầu ở gan. Ngoại trừ pitavastatin (80%), sinh khả dụng tuyệt đối của các statin tương đối thấp: atorvastatin (14%), fluvastatin (24%), 9
lovastatin (5%), pravastatin (17%), rosuvastatin (20%) và simvastatin (< 5%). Tất cả các statin được phân bố chủ yếu ở gan, tuy nhiên, một số statin (lovastatin, pravastatin, atorvastatin) còn được phân bố vào các mô ngoài gan (lách, thận, tuyến thượng thận). Khả năng liên kết với protein huyết tương nói chung rất cao (88 - 99%), trừ pravastatin là 50%. Hầu hết các statin được chuyển hóa bởi hệ cytochrom P450 ở gan, ngoại trừ pravastatin được chuyển hóa trong dịch bào tương bằng sulfat hóa. Atorvastatin, simvastatin, lovastatin dễ bị chuyển hóa bới CYP3A4, fluvastatin chủ yếu được chuyển hóa bởi CYP2C9. Rosuvastatin được chuyển hóa bởi CYP2C9 và CYP2C19 nhưng với tỷ lệ rất thấp. Pitavastatin rất ít được chuyển hóa bởi gan do có tuần hoàn gan ruột. Các thuốc fluvastatin, lovastatin, pravastatin và simvastatin có thời gian bán thải tương đối ngắn (dưới 5 giờ) do đó sử dụng tốt nhất vào buổi tối, khi tỷ lệ tổng hợp cholesterol nội sinh cao nhất. Ngược lại, pitavastatin (11 giờ), atorvastatin (14 giờ) và rosuvastatin (19 giờ) có thời gian bán thải dài hơn, có thể sử dụng bất cứ lúc nào trong ngày. Phần lớn statin thải trừ chủ yếu thông qua mật sau khi chuyển hóa bởi gan, ngoại trừ pravastatin và rosuvastatin được thải trừ bởi cả thận và gan, chủ yếu ở dạng không thay đổi [11]. Mặc dù có nhiều tác dụng tốt trên hệ tim mạch, các statin vẫn tồn tại một số tác dụng không mong muốn đáng quan tâm tuy tần số xuất hiện còn thấp. Đau cơ là tác dụng phụ phổ biến nhất của statin, xuất hiện ở 10% bệnh nhân [8]. Viêm cơ ít phổ biến hơn (0,1%). Tiêu cơ vân hiếm khi xảy ra (0,01%) nhưng là biến chứng nguy hiểm nhất của statin, gây tổn thương cơ nghiêm trọng, thường đi kèm với rối loạn chức năng thận, đôi khi suy thận và tử vong [16, 42]. Sử dụng statin cường độ trung bình và cường độ cao làm tăng nguy cơ mắc đái tháo đường tương ứng khoảng 10% và 20% [42]. Các tác dụng phụ như tăng transaminase gan (1-3%) [49], rối loạn cảm giác và trầm cảm cũng đã được quan sát thấy khi sử dụng kéo dài. Cần cân nhắc khi sử dụng statin trong thai kỳ do cholesterol và dẫn xuất từ cholesterol rất cần thiết đối với sự phát triển của thai nhi. Đã có các báo cáo về dị tật bẩm sinh ở bộ phận sinh dục, hậu môn, tim, khí quản, thực quản, thận, thiếu chi, thai chết ở phụ nữ dùng statin, đặc biệt là trong 3 tháng đầu thai kỳ [15]. Do tầm quan trọng của enzym HMGCR và tỉ lệ ngày càng gia tăng của bệnh tim mạch, các nghiên cứu liên tục được thực hiện để tìm kiếm các hợp chất mới có tiềm năng ức chế HMGCR với hoạt tính tốt hơn và hạn chế được các tác dụng không mong muốn cũng như chống chỉ định nhằm cải thiện hiệu quả điều trị RLLPM trên lâm sàng. 10
1.3. Tổng quan về nhóm hợp chất polyphenol Polyphenol là nhóm các hợp chất tự nhiên thường được tìm thấy ở thực vật bậc cao, có cấu trúc vòng benzen mang một hay nhiều nhóm thế hydroxyl đính trực tiếp trên nhân thơm [57]. Các phân tử này là chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật, thường tham gia vào quá trình bảo vệ chống lại bức xạ cực tím và sự xâm nhập của mầm bệnh, ngoài ra chúng còn góp phần tạo nên màu sắc, mùi vị của thực vật đặc biệt là vị đắng và cảm giác se trong quả xanh [44]. Polyphenol thường được chia thành 4 nhóm chính là: flavonoid, phenolic acid, stilbene và lignans [39]. Trong đó:  Flavonoid là polyphenol phong phú nhất bao gồm: flavonols, flavon, isoflavone, flavanones, anthocyanidins và flavanols  Phenolic acid bao gồm các dẫn xuất của benzoic acid và dẫn xuất của cinnamic acid.  Stibene có cấu trúc nhân 1,2-diphenylethylene với các hydroxyl được thay thế trên các vòng thơm, tồn tại ở dạng monome hoặc oligome.  Lignans có hai đơn vị propylbenzen (C6-C3) được liên kết với nhau giữa vị trí β trong C8 của chuỗi bên propan. Polyphenol đã được chứng minh có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe. Tác dụng được biết đến nhiều nhất của polyphenol là khả năng chống oxy hóa mạnh thông qua các cơ chế nội sinh và ngoại sinh, giúp cơ thể ngăn ngừa stress oxy hóa, các bệnh ung thư, tim mạch, các bệnh về mắt và làm chậm quá trình lão hóa, bảo vệ thần kinh [70]. Polyphenol còn cho thấy tác dụng chống viêm thông qua các hoạt động loại bỏ gốc tự do, điều chỉnh hoạt động trong các tế bào viêm và điều chỉnh hoạt động của các enzym liên quan đến chuyển hóa acid arachidonic (phospholipase A2, COX) và chuyển hóa arginine (NOS), cũng như điều chỉnh sản xuất các phân tử tiền viêm khác [50]. Các hoạt động chống viêm của nhiều polyphenol đã được báo cáo trong tình trạng viêm cấp tính và mãn tính ở mô hình động vật [47]. Polyphenol còn có khả năng chống ung thư thông qua một loạt các cơ chế (loại bỏ các tác nhân gây ung thư, điều chỉnh sự phát tín hiệu của tế bào ung thư, chu kỳ tế bào tiến triển, thúc đẩy quá trình chết theo chu trình và điều chỉnh các hoạt động enzyme) [70]. Sử dụng trà xanh (chứa nhiều polyphenol) đã được chứng minh là giảm tỷ lệ mắc bệnh ung thư đường mật [55], bàng quang [48], vú [35] và ruột kết [33]. Từ nhiều thập kỷ qua, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng việc tiêu 11
thụ polyphenol trong chế độ ăn giúp làm giảm cholesterol và cải thiện sức khỏe tim mạch ở người [17, 53]. Cơ chế được biết đến của polyphenol làm giảm LDL-c thông qua các mục tiêu phân tử như HMGCR, LDLR, PCSK9, IDOL, MTP, apoB, CYP7A1, CETP, SREBP, squalene synthase và ACLY,..[53]. Trên thực tế, nhiều nghiên cứu trên cả mô hình tế bào và động vật đã cho thấy polyphenol thể hiện khả năng ức chế hoạt động HMGCR [3, 32, 54, 62, 65, 67]. Trong nghiên cứu in silico, Islam và cộng sự cũng đã chứng minh polyphenol là tác nhân chống tăng lipid máu tiềm năng bằng cách ức chế HMGCR [24]. Xét đến tiềm năng dược lý to lớn như vậy, ngày càng nhiều hơn các nghiên cứu ở mức độ phân tử được công bố nhằm cung cấp hiểu biết về cơ chế của tương tác polyphenol - protein cũng như sàng lọc ra các hợp chất tiềm năng đáp ứng nhu cầu hỗ trợ điều trị RLLPM. 1.4. Tổng quan về nghiên cứu in silico Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới là quá trình đầy rủi ro, tốn thời gian, bao gồm nhiều giai đoạn: từ xác định và lựa chọn mục tiêu phân tử, tìm kiếm và tối ưu hóa hợp chất dẫn đường, đến các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng. Ngày nay, các phương pháp khám phá thuốc có sự hỗ trợ của máy tính (in silico) đã trở thành một phần quan trọng của quá trình khám phá thuốc hiện đại do chúng có thể tác động lên nhiều giai đoạn của quy trình này. Các phương pháp khám phá thuốc in silico giúp giảm thiểu các thử nghiệm in vivo, hỗ trợ thiết kế các loại thuốc an toàn hơn, xác định lại tác dụng các loại thuốc đã biết (drug repositioning) và hỗ trợ các nhà hóa dược ở nhiều bước (thiết kế, phát triển và tối ưu hóa) trong quá trình khám phá thuốc [59]. Phương pháp in silico được chia thành 2 hướng chính bao gồm sàng lọc dựa trên phối tử (LBVS) và sàng lọc dựa trên cấu trúc (SBVS). Hướng sàng lọc dựa trên phối tử sử dụng các dữ liệu tương quan cấu trúc - hoạt tính từ một tệp cơ sở dữ liệu các chất đã biết để lựa chọn chất tiềm năng cho đánh giá thực nghiệm. Hướng nghiên cứu này bao gồm việc tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc tương đồng (similarity searching), nghiên cứu tương quan cấu trúc - hoạt tính (QSAR) và xây dựng phần cấu trúc mang dược tính (pharmacophore). Hướng sàng lọc dựa trên cấu trúc SBVS sử dụng cấu trúc ba chiều của đích sinh học để mô phỏng tương tác ảo với các hợp chất tiềm năng và xếp hạng chúng dựa trên ái lực liên kết hoặc vùng liên kết [51]. 12