Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược học: Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ cây thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (thunb.) trevis.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ THÙY

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN MÔ HÌNH GÂY SA SÚT TRÍ NHỚ BẰNG SCOPOLAMIN CỦA CAO CHIẾT GIÀU ALCALOID TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2015.Y

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện:

NGUYỄN THỊ THÙY

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN MÔ HÌNH GÂY SA SÚT TRÍ NHỚ BẰNG SCOPOLAMIN CỦA CAO CHIẾT GIÀU ALCALOID TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(NGÀNH DƯỢC HỌC)

Khóa: QH.2015.Y

Người hướng dẫn: 1. ThS. Đặng Kim Thu

2. ThS. Bùi Sơn Nhật

Hà Nội – 2020

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới hai giảng

viên hướng dẫn là ThS. Đặng Kim Thu và Th.S Bùi Sơn Nhật - giảng viên Bộ môn Dược lý và Dược lâm sàng, Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã đưa ra

những lời khuyên hữu ích, luôn lắng nghe, động viên và dẫn dắt tôi từng bước chân

trên con đường thực hiện đề tài.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Bùi Thanh Tùng và các thầy cô thuộc bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia

Hà Nội đã chia sẻ những bài học kinh nghiệm quý báu, nhiệt tình giúp đỡ và động

viên tôi.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới DS. Nguyễn Thị Thu Hoài – Học viên

cao học khóa 22, đại học Dược Hà Nội đã cùng ở bên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài.

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới các thầy cô của

Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình chỉ bảo, quan tâm và truyền

dạy cho tôi những kiến thức quí báu trong suốt 5 năm học tập tại khoa cũng như tạo

mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được thực hiện trọn vẹn đề tài này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã

động viên và sát cánh bên tôi vượt qua những khó khăn trong quãng thời gian còn

ngồi trên ghế nhà trường.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Thùy

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

A Độ hấp thụ (Absorbance)

Amyloid beta A

ACh Acetylcholin

AChE Enzym Acetylcholinesterase

ACTI Acetylthiocholin iodid

APP Protein tiền thân amyloid (Amyloid Precursor Protein)

DL-30 Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg cân nặng

DL-60 Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 60 mg/kg cân nặng

FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug

Administration)

HFD Chế độ ăn giàu chất béo (High fat diet)

Hup A Huperzin A

IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%)

IU Đơn vị quốc tế (International Unit)

MDA Malondialdehyd

NMDA Thụ thể N-methyl-D-aspartat

LD50 Liều dùng gây chết 50% số động vật thử nghiệm

OBX Chuột mất vùng khứu giác (Olfactory bulbectomized)

SAM Chuột tăng tốc lão hóa

SAMP Chuột tăng tốc lão hóa nhạy cảm

SE Sai số chuẩn (Standard errror)

UV-Vis Quang phổ tử ngoại khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.2.1. Các hợp chất alcaloid của Thạch tùng răng cưa .................................... 8

Bảng 2.4.1. Thành phần của hỗn hợp phản ứng ..................................................... 28 Bảng 3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE in vitro của cao chiết

giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất chuẩn donepezil. .............................. 29

Bảng 3.1.2. Giá trị IC50 của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất

chuẩn quercetin ..................................................................................................... 30

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.2.1. Cấu trúc hóa học của Hup A ................................................................. 8

Hình 2.1.1. Cây Thạch tùng răng cưa Huperzia serrata (Thunb.) Trevis ............... 17

Hình 2.1.2. Phương pháp chiết alcaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm

.............................................................................................................................. 18

Hình 2.3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu ................................................................. 20

Hình 2.4.1. Phản ứng giữa các chất trong hỗn hợp phản ứng Ellman ..................... 21

Hình 2.4.2. Sơ đồ triển khai mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin in vivo .. 24

Hình 3.2.1. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến tỷ lệ

chuyển tiếp giữa các cánh ...................................................................................... 31

Hình 3.2.2. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến thời

gian tìm thấy bến đỗ ở bài tập có bến đỗ ................................................................ 32

Hình 3.2.3. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa tới thời

gian lưu tại góc phần tư có bến đỗ ở bài tập không có bến đỗ ................................ 34

Hình 3.2.4. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hoạt

độ AChE trên thể đồng nhất não chuột .................................................................. 35

Hình 3.2.5. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm

lượng malondialdehyd (MDA) trong mô não ......................................................... 36

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

Chương 1 - TỔNG QUAN ..................................................................................... 3

1.1. Tổng quan về bệnh ................................................................................... 3

1.1.1. Khái niệm về bệnh sa sút trí nhớ ................................................................ 3

1.1.2. Các thể sa sút trí nhớ và cơ chế bệnh sinh .................................................. 4 1.1.3. Các thuốc điều trị bệnh sa sút trí nhớ ......................................................... 6

1.2. Tổng quan về cây Thạch tùng răng cưa .................................................. 7

1.2.1. Đặc điểm thực vật ...................................................................................... 7

1.2.2. Phân bố ...................................................................................................... 7

1.2.3. Thành phần hóa học ................................................................................... 7

1.2.4. Tác dụng dược lý ....................................................................................... 9

1.2.5. Các nghiên cứu hiện nay về tác dụng cải thiện trí nhớ của Thạch tùng răng

cưa...... .................................................................................................................. 9

1.3. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng tăng cường trí nhớ .................... 11

1.3.1. Các mô hình động gây sa sút trí nhớ trên động vật thử nghiệm................. 11

1.3.2. Một số thử nghiệm hành vi đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ in vivo . 13

1.3.3. Một số phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE .............................. 14

1.3.4. Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa ........................... 15

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 17

2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 17

2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ............................................................................... 17 2.1.2. Mẫu nghiên cứu ....................................................................................... 17

2.2. Phương tiện nghiên cứu ......................................................................... 18

2.2.1. Động vật thí nghiệm ................................................................................. 18 1.2.2. Hóa chất, dung môi .................................................................................. 18

1.2.3. Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................... 19

2.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 19

2.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 20

2.4.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE và chống oxy hóa in vitro . 20

2.4.2. Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid

từ Thạch tùng răng cưa trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin. ........... 23

2.5. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 28

Chương 3 – KẾT QUẢ ........................................................................................ 29

3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE và khả năng dọn gốc tự do in

vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa .................................. 29

3.1.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro ........................... 29

3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro .......................... 30

3.2. Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid

từ Thạch tùng răng cưa trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin ...... 31

3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thông qua thử nghiệm mê

lộ Y..........................................................................................................................31

3.2.2. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thông qua thử nghiệm mê

lộ nước Morris..................................................................................................... 32

3.2.3. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hoạt độ

AChE trong não .................................................................................................. 34

3.2.4. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm lượng

malondialdehyd (MDA) trong mô não ................................................................. 36

Chương 4 – BÀN LUẬN ...................................................................................... 38

4.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AchE và chống oxy hóa in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa .................................. 38

4.1.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro ...................... 38 4.1.2. Về kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do in vitro ................................ 39

4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa . 40

4.2.1. Về kết quả của thử nghiệm hành vi .......................................................... 40 4.2.2. Về kết quả định lượng các marker sinh học .............................................. 42

Chương 5 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................. 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

Xã hội ngày càng phát triển, những áp lực của cuộc sống cũng ngày càng tăng

cao. Con người bị ảnh hưởng bởi môi trường và xuất hiện những vấn đề về sức khỏe. Ngoài những nhóm bệnh phổ biến như bệnh tim mạch và ung thư, sa sút trí nhớ cũng

là một bệnh lý mà nhiều người mắc phải.

Sa sút trí nhớ là một nhóm các rối loạn đặc trưng bởi sự suy giảm trí nhớ và

nhận thức, có ảnh hưởng đến các hoạt động sống hàng ngày và hoạt động xã hội của người bệnh. Trên thế giới, số lượng người mắc sa sút trí nhớ ngày càng tăng cao với

khoảng 50 triệu người mắc và có gần 10 triệu ca mắc mới mỗi năm [47]. Sa sút trí

nhớ là căn bệnh có tác động rất lớn đến nền kinh tế. Chi phí dành cho chăm sóc và

điều trị cho bệnh nhân sa sút trí nhớ hàng năm trên thế giới ước tính khoảng 800 tỷ

USD (tương đương 1% GDP toàn cầu) và sẽ đạt tới 2000 tỷ USD vào năm 2030 [47].

Sa sút trí nhớ là bệnh lý phổ biến thường gặp ở người cao tuổi. Bệnh diễn biến

từ từ tăng dần, suy giảm dần khả năng nhận thức, trí tuệ, dẫn đến mất dần khả năng

sinh hoạt độc lập và thường tử vong do mắc phải các bệnh nhiễm trùng, tiết niệu.

Mặc dù sa sút trí nhớ có tác động rất lớn đến sức khỏe người cao tuổi và đang có xu

hướng ngày càng gia tăng nhưng việc điều trị lại gặp nhiều khó khăn do hiểu biết về

bệnh còn hạn chế và việc lựa chọn thuốc điều trị bị giới hạn. Những thuốc dùng điều

trị sa sút trí nhớ gồm 2 nhóm thuốc ức chế cholinesterase và thuốc đối kháng thụ thể

N-methyl-D-aspartat (NMDA). Các thuốc kể trên cho thấy tác dụng kiểm soát triệu

chứng tốt nhưng không làm thay đổi diễn tiến bệnh. Ngoài ra, giá thành tương đối

cao và các tác dụng phụ không mong muốn là nhược điểm của các thuốc này. Do đó,

việc tiếp tục nghiên cứu tìm ra loại thuốc hiệu quả và an toàn hơn trong điều trị sa

sút trí nhớ và Alzheimer là rất cần thiết.

Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.) là một dược liệu đã

được dùng để điều trị bệnh sa sút trí nhớ tại Trung Quốc. Trong dược liệu, Huperzin A (Hup A) là hợp chất alcaloid nổi bật có tác dụng cải thiện trí nhớ [50,61]. Tuy

nhiên, ở nước ta mới chỉ có một số nghiên cứu dược lý về cao chiết cồn của Thạch tùng răng cưa trong khi chưa có nghiên cứu nào thực hiện trên đối tượng nghiên cứu là cao chiết alcaloid. Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa theo

1

2 mục tiêu sau:

1. Đánh giá được tác dụng ức chế enzym AChE và khả năng dọn gốc tự do

DPPH in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa.

2

2. Đánh giá được tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa.

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về bệnh

1.1.1. Khái niệm về bệnh sa sút trí nhớ

Bệnh sa sút trí nhớ được định nghĩa bởi Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm

1992 như sau: Sa sút trí nhớ là một hội chứng bệnh của não, có tính chất mạn tính

và tiến triển, có sự xáo trộn nhiều chức năng của não liên quan đến trí nhớ, suy nghĩ, định hướng, học tập, ngôn ngữ và phán đoán. Song, ý thức không bị suy giảm. Sự

suy giảm trong kiểm soát cảm xúc, hành vi xã hội hoặc động lực thường đi kèm, đôi

khi xuất hiện trước sự suy giảm chức năng nhận thức. Hội chứng xảy ra trong bệnh

Alzheimer, bệnh mạch máu não và trong các điều kiện nguyên phát hoặc thứ phát

khác ảnh hưởng đến não [66].

Sa sút trí nhớ là một hội chứng bệnh lý phổ biến ở người cao tuổi. Mặc dù

bệnh chủ yếu ảnh hưởng đến người già nhưng không phải là một phần bình thường

của quá trình lão hóa. Đa số các bệnh nhân rối loạn chức năng nhận thức đều do tổn

thương không hồi phục các neuron thần kinh hai bên bán cầu (đặc biệt ở vùng vỏ

não phối hợp) và/hoặc các cấu trúc dưới vỏ. Bệnh diễn biến từ từ tăng dần, suy giảm

dần khả năng nhận thức, trí tuệ, cuối cùng mất hết khả năng sinh hoạt độc lập, phải

lệ thuộc hoàn toàn vào người khác và thường tử vong do mắc phải các bệnh nhiễm

trùng, tiết niệu [1].

Theo báo cáo của hiệp hội Alzhiemer năm 2018, trên thế giới có khoảng 50

triệu người mắc sa sút trí nhớ (chiếm khoảng 5% tổng số người trên 60 tuổi của thế

giới). Ước tính cứ mỗi 3 giây sẽ có thêm 1 người mắc sa sút trí nhớ và số người mắc

bệnh dự kiến tăng lên đến 152 triệu người vào năm 2050 [47]. Trong đó, số ca mắc

mới ở châu Á chiếm gần 50% số ca trên thế giới và tập trung chủ yếu ở các nước thu

thập thấp – trung bình. Nguy cơ mắc sa sút trí nhớ tăng theo tuổi. Tỷ lệ mắc sa sút trí nhớ của một người tăng gấp đôi sau mỗi 6,3 năm [49].

Việt Nam có xu hướng già hóa dân số nhanh. Số người cao tuổi (trên 65 tuổi) chiếm hơn 10% tổng dân số [10]. Tuy nhiên, số người mắc sa sút trí nhớ trong nước chưa được đánh giá trên nghiên cứu quy mô lớn. Một số nghiên cứu được thực hiện với quy mô nhỏ tại địa phương từ năm 2009 – 2015 ước tính tỷ lệ mắc sa sút trí nhớ

3

chiếm khoảng 4,5 – 5% tổng số người cao tuổi (trên 60 tuổi) [4,9,12].

1.1.2. Các thể sa sút trí nhớ và cơ chế bệnh sinh

Sa sút trí nhớ bao gồm nhiều thể bệnh khác nhau. Sa sút trí nhớ trong bệnh

Alzheimer và trong bệnh mạch máu là hai thể bệnh thường gặp nhất:

1.1.2.1. Sa sút trí nhớ trong bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer là một bệnh thoái hóa não nguyên phát. Sự tích lũy của các

mảng bám amyloid  (A) ở ngoại bào và một dạng bất thường của protein tau ở

trong tế bào thần kinh là hai trong nhiều thay đổi ở não của bệnh nhân mắc Alzheimer.

Nguyên nhân gây bệnh và cơ chế bệnh sinh chưa được làm sáng tỏ do sự phức tạp của các yếu tố gây bệnh. Nhiều giả thuyết được hình thành để giải thích về nguyên

nhân gây bệnh cũng như cơ chế bệnh sinh, ví dụ như giả thuyết về amyloid  (A),

protein Tau, cholinergic,...

 Giả thuyết về cholinergic

Trong não, các tế bào thần kinh hệ cholinergic có mặt nhiều ở vùng vỏ não

và đồi hải mãi, chịu trách nghiệm về trí nhớ và học tập. Acetylcholin là chất dẫn

truyền thần kinh quan trọng của hệ cholinergic, có vai trò hoạt hóa thụ thể nicotinic

và muscarinic. Giả thuyết cholinergic là giả thuyết được đưa ra bởi hai nhà khoa học

Davies và Maloney vào năm 1976 [22]. Giả thuyết cho rằng nguyên nhân gây bệnh

Alzheimer có thể do giảm số lượng acetylcholin và suy yếu thụ thể nicotinic và

muscarinic dẫn đến suy giảm dẫn truyền thần kinh. Giả thuyết là cơ sở cho việc nghiên cứu phát triển thuốc hướng tăng cường hoạt động của chất dẫn truyền thần

kinh acetylcholin.

 Giả thuyết về amyloid  (A) và protein tau

Hardy John và cộng sự đã đưa ra giả thuyết về A để giải thích cho cơ chế

bệnh Alzheimer năm 1991 [31]. Những A là kết quả của quá trình biến đổi bất

thường của APP – một protein xuyên màng chưa rõ chức năng cụ thể. APP là protein

nằm trong màng, được phân cắt bởi 3 loại enzym -, - và -secretase. Một trong

những sản phẩm của quá trình phân cắt APP là một loại protein không tan tự kết tụ

(A40 và A42 ) từ đoạn cắt --. Dưới tác động của Apolipoprotein E (APOE) -

protein vận chuyển giúp phân bố cholesterol trong mô não, những peptid này kết tụ với nhau hình thành các mảng amyloid. Những mảng amyloid gây suy giảm trí nhớ

4

và nhận thức nhờ can thiệp vào sự giao tiếp của các nơ-ron tại synap. Các A kích

thích quá trình phosphoryl hóa protein tau và phát triển các đám rối tơ thần kinh

NFT.

Protein Tau là thành phần quan trọng của tế bào thần kinh có vai trò cố định

và ổn định cấu trúc của vi ống ở sợi trục. Trong Alzheimer, protein tau bị phosphoryl

hóa, tách ra và tích lũy thành các đám rối tơ thần kinh NFT, ngăn sự di chuyển của

dưỡng chất và các phân tử thiết yếu bên trong tế bào, gây chết tế bào thần kinh. Sự

tích lũy A góp phần khởi động quá trình phosphoryl hóa protein tau. Ngược lại,

một nghiên cứu khác cho thấy protein tau độc có thể tăng cường sản xuất A [33].

Sự hiện diện của A và tau độc kích hoạt các tế bào miễn dịch ở não (tế bào thần kinh đệm). Các tế bào này có nhiệm vụ loại bỏ các protein độc, song cũng làm chết

tế bào thần kinh. Viêm mạn tính được cho là xảy ra khi các tế bào thần kinh đệm

không còn đảm nhận được nhiệm vụ của chúng. Khi viêm xảy ra, các yếu tố miễn

dịch được kích hoạt kéo theo sự hình thành các gốc tự do phá hủy màng tế bào. Teo

não là kết quả do chết các tế bào thần kinh. Ngoài ra, A và tau độc cũng làm giảm

khả năng sử dụng glucose ở não gây suy yếu các chức năng bình thường [15].

 Giả thuyết về Glutamat

Glutamat là chất dẫn truyền thần kinh kích thích nhanh ở não đóng vai trò

quan trọng trong học tập, trí nhớ và vận động. Glutamat hoạt hóa ba loại thụ thể

chính là Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoazolepropionic acid (AMPA), N-

methyl-D-aspartat (NMDA) và thụ thể hướng chuyển hóa. Trong đó, thụ thể NMDA cho phép ion Na+ và Ca2+ đi vào tế bào. Quá trình exitotoxicity xảy ra khi kích thích quá mức các thụ thể NMDA bởi glutamat hoặc các acid amin có cấu trúc tương tự, làm nồng độ các ion Ca2+ trong tế bào tăng cao, gây tổn thương và chết tế bào [24].

1.1.2.2. Sa sút trí nhớ trong bệnh mạch máu

Sa sút trí nhớ trong bệnh mạch máu là thể bệnh phổ biến đứng thứ hai sau

bệnh Alzheimer, chiếm 10 – 20% các trường hợp mắc bệnh. Sa sút trí nhớ do nguyên nhân mạch máu làm giảm lượng máu tới não, gây tổn thương tế bào thần kinh và ít

hồi phục. Biểu hiện của bệnh thường đột ngột, nhanh (nếu bị tai biến mạch máu mới) hoặc tiến triển theo từng nấc (trong trường hợp tái phát tai biến nhiều lần) [57].

1.1.2.3. Các thể sa sút trí nhớ khác

Sa sút trí nhớ còn do các nguyên nhân hiếm gặp khác gây ra, có thể kể đến

5

như sa sút trí nhớ thể Lewy, sa sút trí nhớ thể thái dương, sa sút trí nhớ trong bệnh Parkinson, Huntington, Creutzfeldt-Jakob (CJD), sa sút trí nhớ trong bệnh suy giảm

miễn dịch ở người (ví dụ HIV), các bệnh chuyển hóa và nội tiết (ví dụ suy giáp, lupus

ban đỏ hệ thống, tăng calci huyết, thiếu vitamin B12) [66].

1.1.3. Các thuốc điều trị bệnh sa sút trí nhớ

Hiện nay chưa có thuốc nào có thể làm chậm hoặc dừng quá trình diễn tiến

của bệnh sa sút trí nhớ. Tổ chức FDA đã chấp nhận 6 thuốc trong điều trị sa sút trí

nhớ bao gồm: tacrin, rivastigmin, galantamin, donepezil, memantin và memantin

phối hợp donepezil [15].

1.1.3.1. Nhóm thuốc ức chế enzym Acetylcholinesterase (AChE)

Giả thuyết cholinergic được lấy làm trung tâm để phát triển các thuốc. Giả

thuyết cho rằng nguyên nhân gây bệnh Alzheimer có thể do giảm số lượng

acetylcholin và suy yếu thụ thể nicotinic và muscarinic dẫn đến suy giảm dẫn truyền

thần kinh [17]. Nhóm thuốc có tác dụng ức chế AChE có phục hồi, tăng thời gian tồn tại các chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholin từ đó cải thiện trí nhớ và nhận

thức.

Nhóm ức chế AChE gồm 4 thuốc đã được tổ chức FDA cấp phép sử dụng

(Tacrin, Donepezil, Rivastigmin và Galantamin). Tacrin ức chế không cạnh tranh

với enzym acetylcholinesterase nhưng gây độc cho gan nên hiện nay hiếm khi được

sử dụng [64]. Các thuốc thế hệ sau (Donepezil, Rivastigmin và Galantamin) được sử

dụng để thay thế cho Tacrin. Ngoài khả năng ức chế AChE, Rivastigmin có thể ức

chế cả BuChE, trong khi galantamin có tác dụng trong việc điều biến các thụ thể

nicotinic. Cả hai được sử dụng để điều trị Alzheimer mức độ nhẹ - trung bình.

Donepezil chỉ ức chế chọn lọc AChE nên ít có độc tính ngoại biên hơn, được sử dụng

để điều trị trong cả trường hợp nặng. Các tác dụng phụ thường gặp trên hệ tiêu hóa

(mệt mỏi, buồn nôn và tiêu chảy), hệ thần kinh (lo lắng, khó chịu) và hệ tim mạch

(nhịp tim chậm) [41].

1.1.3.2. Nhóm thuốc ức chế thụ thể NMDA

Thuốc duy nhất trong nhóm này được tổ chức FDA phê duyệt là Memantin. Memantin là chất ức chế thụ thể NMDA không cạnh tranh, có tác dụng bảo vệ thần kinh, ngăn cản việc mất tế bào thần kinh. Memantin dung nạp tốt hơn vào cơ thể [40]. Tác dụng phụ thường gặp trên hệ tiêu hóa (buồn nôn, tiêu chảy hoặc táo bón) và hệ thần kinh (lú lẫn và hưng phấn) [41]. Memantin phối hợp donepezil cho thấy

6

sự cải thiện lớn về chức năng nhận thức và ghi nhớ ở bệnh nhân sa sút trí nhớ [20].

Ngoài ra, người ta còn sử dụng các chất chống oxy hóa như vitamin E, vitamin

C, các dược liệu (bạch quả, đinh lăng,...), thuốc giảm đau không steroid để hỗ trợ điều trị sa sút trí nhớ.

1.2. Tổng quan về cây Thạch tùng răng cưa

1.2.1. Đặc điểm thực vật

Thạch tùng răng cưa có tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.

hay còn được biết đến là Lycopodium serratum thuộc họ Thông đất (Lycopodiaceae). Tên khác là Thạch tùng răng hoặc Chân sói.

Mô tả Cây thân thảo, thường mọc thành đám nhỏ trên đất hay trên gốc cây có nhiều

rêu trong rừng rậm thường xanh, trên đất ẩm có tầng dày và nhiều mùn, ở độ cao 300

– 1800m.

Thân đứng cao 15 – 40 cm, đơn hay lưỡng thân 1 – 2 lần, đường kính khoảng

2 mm, hình trụ. Lá hình bầu dục – mũi mác, dài 15mm, rộng 3mm, tương đối mỏng,

gân giữa rõ, mép có răng. Túi bao tử ở nách nhánh lá giống lá thường; túi bào tử

hình thận, màu vàng tươi [5,8,11].

1.2.2. Phân bố

Cây thường tìm thấy ở những nước nhiệt đới châu Á, Trung Quốc, Úc và vùng

Trung Mỹ. Ở nước ta, Thạch tùng răng cưa phân bố rải rác ở các tỉnh vùng trung du

và vùng núi cao ở Tây Bắc, miền Trung và Tây Nguyên [5,8,11].

1.2.3. Thành phần hóa học

Thạch tùng răng cưa có thành phần chính là alcaloid thuộc Lycopodium

alcaloid, được phân thành 4 nhóm theo cấu trúc bao gồm Lycodin alcaloid,

Lycopodin alcaloid, Fawcettimin alcaloid và dạng hỗn hợp [35]. Các hợp chất

alcaloid của Thạch tùng răng cưa được liệt kê trong bảng 1.2.1.

Trong đó, Huperzin A (Hup A) được coi là thành phẩn hóa học nổi bật được

7

phân lập và nghiên cứu nhiều nhất. Theo tác giả Vũ Thị Ngọc và cộng sự (2015), hàm lượng Hup A trong lá Thạch tùng răng cưa ở Đà Lạt vào mùa thu và mùa xuân lần lượt là 75,4 và 92,5 (g.g-1 mẫu khô) [13]. Theo tác giả Takuya Ohba và cộng sự

(2015), Hup A là alcaloid chính trong cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa

với hàm lượng đạt 0,5  0,003% [45].

Hình 1.2.1 Cấu trúc hóa học của Hup A

Ngoài ra, Thạch tùng răng cưa còn chứa saponin, glycosid, flavonoid, tanin,

đường khử, acid amin, polysaccharid, steroid và carotenoid [5].

Bảng 1.2.1 Các hợp chất alcaloid của Thạch tùng răng cưa

Các alcaloid

Phân nhóm Tên hợp chất

Clavolonin, serratidin, 4α-hydroxyserratidin, 4α,6α-

dihydroxyserratidin, 6α-hydroxyserratidin, lycoposerramin K,

Huperzin E,2-chlorohuperzin E, noxid huperzin E, Huperzin F,

N-oxid huperzin F, Huperzin G, 12-hydroxyhuperzin, Huperzin

O, 12-deoxyhuperzin O, Lycodolin, 12-epilycodolin N-oxid, Nhóm

4α,6α-dihydroxylycopodin, 6α-hydroxylycopodin, 7- lycopodin

hydroxylycopodin, lycoposseramin G, lycoposseramin L,

lycoposseramin M, lycoposseramin N, Serratezomin C,

Lucidiolin, lycoposerramin F lycoposerramin H lycoposerramin

I, lycoposerramin J, lycoposerramin O.

Huperzin A, NN-Dimethylhuperzin A, 6α-Hydroxyhuperzin A, 6β-Hydroxyhuperzin A, 6β-Hydeoxyhuperzin A, Phlegmariurin Nhóm

lycodin M, Huperzin U, Huperzin C, Huperzin D, Huperzinin, Isofordin, Huperzin B, N-Methylhuperzin B, De-N-methyl-βobscurin.

Huperzin P, Huperzin Q, N‐oxyhuperzin Q, Lycoflexin, lycothunin, 11α-hydroxyfawcettidin, 2α,11α- Nhóm

8

fawcettimin dihydroxyfawcettidin, 8α,11α-dihydroxyfawcettidin, macleanin, 11α-hydroxyphlegmariurin B, 7-hyroperoxyphlegmariurin B,

Neohuperzinin, Serratanidin, Serratezomin B, Serratinin,

Serratin, 8-deoxyserratinin, 8-deoxy-13-dehydroserratinin, Huperserratinin.

Nhóm các Huperzin J, Huperzin K, Huperzin L, Huperzin V, Huperzinin B, alcaloid Phlegmariurin N, Serratanin A, Serratanin B khác

1.2.4. Tác dụng dược lý

Thạch tùng răng cưa được biết đến là một dược liệu quý để chữa bệnh sa sút

trí nhớ. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, cao chiết của Thạch tùng răng cưa có tác dụng

ức chế chọn lọc enzym AChE và cải thiện trí nhớ trên động vật thử nghiệm [3,6,45]. Trong cây, Hup A là thành phần hóa học có tác dụng dược lý nổi trội, có khả năng

ức chế AChE, bảo vệ tế bào thần kinh và ty thể thông qua thay đổi chuyển hóa của

APP và giảm stress oxy hóa đồng thời ức chế biểu hiện của yếu tố gây viêm [26,62].

Cao chiết của Thạch tùng răng cưa còn cho thấy có tác dụng tiềm năng chống

khối u trên các tế bào ung thư bạch cầu HL-60 [30] và ức chế sự di căn của tế bào u

thần kinh đệm C6 (glicoma) [46].

Các tác dụng khác của loài cây này như kháng khuẩn [39] và chữa lành vết

thương [18] cũng đã được chứng minh. Bên cạnh đó, tác dụng chống nhược cơ, giải

độc organophosphat cũng được ghi nhận ở Hup A [28,38].

1.2.5. Các nghiên cứu hiện nay về tác dụng cải thiện trí nhớ của Thạch tùng

răng cưa

1.2.5.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Ở Nhật Bản, tác giả Takuya Ohba và cộng sự đã xác định hàm lượng Hup A

trong cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa là 0,5  0,003%. Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa có tác dụng ức chế chọn lọc AChE với IC50 là 5,96

µg/ml và không ức chế BuChE ở cùng dải nồng độ ức chế AChE. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg cho thấy tác dụng cải thiện trí nhớ ở chuột nhắt trắng thông qua các thử nghiệm hành vi (thử nghiệm mê lộ chữ Y và mê lộ nước Morris) [45].

Hup A là hợp chất được phân lập từ cao chiết của Thạch tùng răng cưa lần

9

đầu tiên vào năm 1986 bởi tác giả Liu JS và cộng sự [37]. Năm 1996, Cheng Dong Hang và cộng sự cho thấy Hup A là một chất ức chế chọn lọc AChE theo cơ chế đảo

ngược với IC50 là 82 nM và tỷ lệ ức chế BuChE/AChE là 884,57. Đồng thời, dùng

Hup A liều 0,1 – 0,4 mg/kg giúp cải thiện trí nhớ của chuột gây sa sút trí nhớ bằng

scopolamin [21]. Năm 2011, trong thử nghiệm lâm sàng pha 2, Hup A liều 400 g

thấy tác dụng cải thiện trí nhớ ở bệnh nhân mắc sa sút trí nhớ mức độ nhẹ đến trung

bình [50].

1.2.5.2. Các tác dụng lý được báo cáo tại Việt Nam

Năm 2013, tác giả Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự báo cáo kết quả đánh

giá tác dụng của cao chiết cồn từ Thạch tùng răng cưa trên mô hình gây sa sút trí nhớ ở chuột nhắt trắng bằng scopolamin. Kết quả cho thấy cao chiết cồn từ Thạch tùng

răng cưa liều 0,533 g/kg có tác dụng tăng cường trí nhớ trên chuột gây sa sút trí nhớ

bằng scopolamin và LD50 của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa là 5,33g/kg [3].

Năm 2016, tác giả Nguyễn Thị Kim Thu và cộng sự đã chứng minh cao chiết

cồn và các phân đoạn của cao chiết cồn từ lá và thân của Thạch tùng răng cưa thu

hái tại Sapa, Lào Cai có tác dụng ức chế AChE in vitro. Phân đoạn dịch chiết EtOAc

cho thấy hoạt tính ức chế AChE mạnh nhất với IC50 = 89,96 ± 3,42 µg/ml [6].

Cũng năm 2016, tác giả Vũ Thị Ngọc và cộng sự đã đánh giá sự có mặt của

Hup A trong mẫu cây Thạch tùng răng cưa thu hái tại Đà Lạt, Lâm Đồng vào mùa

Xuân và mùa Thu bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Kết quả cho thấy, hàm lượng Hup A trong 2 mẫu lần lượt là 0,0925 mg/g mẫu khô

(mẫu mùa Thu) và 0,0171 mg/g mẫu khô (mẫu mùa Xuân). Hàm lượng Hup A được

nhận định có sự thay đổi giữa các thời điểm trong năm, với hàm lượng cao nhất vào

giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân [13].

Tại Việt Nam có rất ít tài liệu nghiên cứu về Thạch tùng răng cưa và chưa có

nghiên cứu trên đối tượng cao chiết giàu alcaloid từ loài cây này. Vì vậy, trong

nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu sử dụng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng

cưa của Việt Nam để đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí

10

nhớ ở chuột nhắt trắng bằng scopolamin.

1.3. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng tăng cường trí nhớ

1.3.1. Các mô hình động gây sa sút trí nhớ trên động vật thử nghiệm

1.3.1.1. Mô hình gây sa sút trí nhớ tự phát

 Mô hình lão hóa tự nhiên

Suy giảm trí nhớ là đặc trưng đầu tiên và phổ biến của tuổi già. Vì vậy, những

động vật già có tiềm năng được dùng như những mô hình tự phát gây suy giảm trí

nhớ. Chuột là động vật thường được sử dụng trong các nghiên cứu do chi phí thấp, sẵn có, dễ thao tác và hành vi đặc trưng. Do không gây xâm lấn và không chịu tác

động của chất hóa học thần kinh nên những mô hình này được coi là công cụ hữu

ích để phản ánh sinh lý bệnh tự nhiên của bệnh Alzheimer.

 Mô hình tăng tốc độ lão hóa

Chuột tăng tốc độ lão hóa (SAM) là một mô hình lão hóa cấp tốc được hình

thành thông qua việc lựa chọn kiểu hình từ chủng chuột AKP/J, bao gồm 9 chủng

tăng tốc độ lão hóa nhạy cảm (SAMP) và 3 chủng tăng tốc độ lão hóa đề kháng

(SAMR). Trong đó, chủng SAMP8 là mô hình gây sa sút trí nhớ đáng tin cậy cho

thấy sự suy giảm khả năng học tập và trí nhớ liên quan đến lão hóa [59].

1.3.1.2. Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng tác nhân hóa học

 Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin

Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin là một trong những mô hình động

vật được sử dụng nhiều nhất do quy trình đơn giản và khả năng sống sót cao.

Scopolamin là một chất đối vận muscarinic có cấu trúc tương tự chất dẫn truyền thần

kinh acetylcholin. Do có ái lực cao, scopolamin gắn với các thụ thể muscarinic và

ngăn không cho acetylcholin gắn vào. Kết quả, nồng độ những chất dẫn truyền thần

kinh acetylcholin tự do tăng quá mức gây tổn thương các dây thần kinh dẫn đến suy giảm khả năng học tập và trí nhớ [65].

 Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng streptozotocin

Streptozotocin gây tổn hại tế bào thần kinh thông qua stress oxy hóa, tăng tích

lũy các A trong não, kích thích sự phosphoryl hóa protein tau. Chuột tiêm streptozotocin liều 3 mg/kg, 2 lần trong 48 giờ được báo cáo gây ra suy giảm trí nhớ

giống bệnh Alzheimer [52]. Hạn chế của mô hình này là tỷ lệ tử vong cao, yêu cầu

11

số lượng động vật thử nghiệm lớn.

 Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng Trimethyltin (TMT) clorid

TMT là một chất độc thần kinh mạnh, gây chết các tế bào thần kinh ở vùng

đồi thị của động vật. TMT gây mất tế bào thần kinh, suy giảm trí nhớ, co giật ở chuột nhờ gây được stress oxy hóa, kích thích các yếu tố tiền viêm [16]. Tuy nhiên, hiệu

quả của TMT có khác biệt giữa các loài và tùy từng nhóm sản xuất [43].

Ngoài ra, các tác nhân như L-methiomin, Colchicin, acid Okadaic,

Benzodiazepin, các kim loại nặng (Fe, Cu, Cr, Co,...) cũng được sử dụng để gây sa sút trí nhớ trên động vật thí nghiệm [43].

1.3.1.3. Mô hình gây tổn thương não

Mô hình gây sa sút trí nhớ trên chuột mất vùng khứu giác cũng là một trong

những mô hình được sử dụng nhiều để gây sa sút trí nhớ ở động vật thí nghiệm.

Chuột được tiến hành phá hủy vùng khứu giác và cầm máu bằng miếng bọt cầm máu gelatin. Các nghiên cứu chỉ ra rằng chức năng học tập và ghi nhớ đã suy giảm đáng

kể sau khi cắt bỏ vùng khứu giác của chuột, làm giảm sự tăng sinh tế bào trong đồi

hải mã và cholin acetyltransferase (ChAT) ở võ não và đồi hải mã [32,42].

1.3.1.4. Mô hình sử dụng động vật chuyển gen

Động vật được biến đổi gen để biểu hiện các protein tiền chất amyloid (APP)

tạo thành các đám rối A và gây sa sút trí nhớ. Các mô hình thường sử dụng như

chuột Tg2576, chuột APP23, JNLP3, ApoE… Ngoài ra còn có các mô hình chuyển

gen khác bằng cách gây đột biến trong presenilin, đột biến -symelein, mô hình

chuột biểu hiện quá mức eyelooxygenase-2, đột biến yếu tố chống tăng trưởng thần

kinh (NGF)... [55]

1.3.1.5. Mô hình gây sa sút trí nhớ do não thiếu oxy

Tình trạng thiếu oxy (hypoxia), tăng natri máu và thiếu máu cục bộ được báo

cáo làm giảm lượng máu cung cấp cho não và gây giảm trí nhớ ở loài gặm nhấm. Có thể gây thiếu oxy bằng cách cho chuột phơi nhiễm với khí CO2 tinh khiết, CO.

NaNO2 cũng được dùng để gây suy giảm khả năng học tâp và ghi nhớ nhờ làm giảm

12

khả năng mang oxy. Ngoài ra, người ta sử dụng mô hình gây sa sút trí nhớ do thiếu máu não cục bộ bằng cách thắt động mạch cảnh đồng thời chích máu đuôi chuột gây hạ huyết áp [55].

1.3.1.6. Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng chế ăn giàu chất béo (HFD)

Trong mô hình này, chuột được cho ăn chế độ ăn giàu chất béo (30-60% chất béo) trong 2-4 tháng. HFD làm tăng nồng độ cholesterol trong não. Vì cholesterol

ảnh hưởng đến việc thanh thải và lắng đọng A nên việc tăng nồng độ cholesterol

trong não thúc đẩy sự lắng đọng của peptit này và hình thành mảng bám A ở ngoài

tế bào thần kinh. HFD gây ra sự lắng đọng của peptid A, tăng các phản ứng viêm,

giảm tế bào thần kinh và tăng tốc độ suy giảm nhận thức thông qua căng thẳng oxy

hóa và đẩy nhanh quá trình apoptosis thần kinh [51]. Mô hình có một hạn chế là quá trình xây dựng mô hình tốn nhiều thời gian.

1.3.2. Một số thử nghiệm hành vi đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ in vivo

 Thử nghiệm nhận diện đồ vật (ORT)

Test nhận diện đồ vật ORT được thực hiện theo phương pháp của Yamada và

cộng sự (2011) để đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ ngắn hạn không liên quan đến

vị trí không gian của chuột [67]. Chuột có xu hướng khám phá vật thể lạ lâu hơn để

thu thập thông tin mới của môi trường, qua đó đảm bảo sự an toàn cho bản thân động

vật. Đánh giá thời gian chuột khám phá vật thể lạ so với thời gian khám phá vật thể

cũ cho biết khả năng nhớ của chuột. Chuột được coi là cải thiện trí nhớ nếu thời gian

khám phá vật thể mới của chuột lâu hơn so với thời gian khảm phá vật thể cũ.

 Thử nghiệm mê lộ chữ Y

Thử nghiệm mê lộ chữ Y được thực hiện nhằm đánh giá trí nhớ không gian

ngắn hạn của chuột. Thử nghiệm này được tiến hành dựa vào hành vi thích khám

phá của động vật gặm nhấm. Hành vi này giúp chúng thu thập thông tin về môi

trường mới, từ đó đảm bảo an toàn cho bản thân. Trong thử nghiệm mê lộ chữ Y,

chuột có xu hướng tìm đến cánh mà chúng chưa khám phá (hay có xu hướng khám phá lần lượng ba cánh tay liên tiếp). Chuột có trí nhớ tốt sẽ di chuyển thay đổi luân

phiên giữa các cánh và ngược lại [36].

 Thử nghiệm mê lộ nước Morris (Morris Water Maze – MWM)

Test mê lộ nước Morris để đánh giá khả năng học tập và trí nhớ không gian của chuột, dựa vào bản năng sinh tồn và khả năng nhớ vị trí không gian của chuột,

13

khi cho vào nước chuột sẽ bơi để tìm bến đỗ và nhớ vị trí của bến đỗ ở các lần tiếp theo. Thử nghiệm dựa vào bản năng sinh tồn của động vật sống trên cạn: khi chuột

bị đưa vào môi trường nước, chúng sẽ cố gắng bơi để tìm cách trốn thoát nhằm đảm

bảo an toàn cho bản thân. Đánh giá kết quả dựa trên các thông số: thời gian tìm thấy bến đỗ, quãng đường tìm thấy bến đỗ, vận tốc bơi trung bình, thời gian lưu lại góc

có bến đỗ [60].

 Thử nghiệm né tránh thụ động

Test né tránh thụ động được sử dụng để đánh giá trí nhớ dài hạn của động vật

thử nghiệm, dựa trên sự mâu thuẫn giữa bản năng sợ hãi vùng không gian mở, có ánh sáng của các loài gặm nhấm với phản xạ trốn tránh có điều kiện vùng không gian

nguy hiểm đã được nhận diện trước đó. Dựa trên đặc điểm sinh học này, người ta

thiết kế buồng tối (khu vực ưa thích của chuột) trở thành vị trí nguy hiểm (bị điện

giật), trong khi buồng sáng lại là vị trí an toàn (không bị điện giật) [34]. Trong thử

nghiệm, chuột được đưa vào buồng sáng, nếu chuột đi vào buồng tối sẽ bị điện giật. Sau một số lần tập luyện, chuột sẽ hạn chế vào buồng tối. Đánh giá kết quả dựa trên

thông số thời gian từ khi cho chuột vào buồng sáng đến khi chuột sang buồng tối.

Ngoài ra, còn có một số thử nghiệm hành vi khác như thử nghiệm sợ hãi có điều

kiện, thử nghiệm vận động tự nhiên, bài tập tìm thức ăn trong mê lộ, mê lộ hình chữ

thập, vận động trong rotarod…

1.3.3. Một số phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE

Acetylcholin là một chất dẫn truyền thần kinh thuộc hệ cholinergic, được tổng

hợp từ Ac-coenzym A và cholin dưới tác dụng của acetyltransferase. Sau khi được

giải phóng, acetylcholin tồn tại ở mô trong vài giây, sau đó bị AChE ở mô liên kết

tại chỗ phân giải thành ion acetat và cholin. AChE giữ vai trò quan trọng trong kiểm

soát biểu hiện của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin.

 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman

Phương pháp đánh giá hoạt tính của AChE dựa trên nguyên tắc: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ sự xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin. Thiocholin phản ứng

14

với thuốc thử DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic màu vàng. Hợp chất này có độ hấp thụ quang cực đại tại bước sóng 412 nm. Lượng hợp chất này được tạo thành tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được áp dụng phổ biến trong đánh giá hoạt độ của enzym do có ưu điểm là hợp chất được tạo thành có độ bền cao, độ nhạy và đơn giản của phương pháp [25].

 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

Phương pháp đánh giá hoạt tính của AChE sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công bố sau phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman nhưng ít được sử dụng

hơn. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất -naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym

esterase giải phóng chất -naphthol. Chất này phản ứng với thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản phẩm mà diazo. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ

hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm [29].

1.3.4. Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa

1.3.4.1. Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa in vitro

 Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH

Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH là phương pháp được

sử dụng nhiều nhất để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một hợp chất hoặc hồn

hợp các chất. Nguyên tắc của phản ứng là dựa vào phản ứng giữ các gốc tự do DPPH

với chất chống oxy hóa tạo thành sản phẩm có màu vàng không hấp thụ ánh sáng tử

ngoại tại bước sóng 517 nm. Phương pháp có nhiều ưu điểm như đơn giản, ít tốn

kém, độ nhạy cao và phạm vi ứng dụng lớn [14].

 Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do ABTS+

Khả năng dọn gốc tự do được xác định bằng phương pháp khử màu ABTS+ (2,2-azino-bis(2-ethylbenz-thiazolin-6-sulfonic acid)). ABTS+ phản ứng với chất chống oxy hóa tạo thành sản phẩm không màu, làm dung dịch mất màu xanh. Độ

hấp thụ quang được đo ở bước sóng 750 nm và được tính toán dựa vào đường chuẩn

của chất chuẩn Trolox [48].

Ngoài ra, còn nhiều phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa in vitro

khác được áp dụng trên thế giới như phương pháp dọn gốc tự do HO, nitric oxid,

peroxynitrit, superoxid,...

1.3.4.2. Phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa in vivo

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều phương pháp được đưa ra để đánh giá khả

năng chống oxy hóa trong mô hình thực nghiệm như phương pháp đánh giá khả năng làm giảm sắt trong huyết tương, phương pháp đánh giá khả năng làm giảm glutathion,... Trong đó, phương pháp định lượng hàm lượng peroxid hóa lipid màng

tế bào được sử dụng nhiều nhất do đơn giản và tiết kiệm chi phí. Khả năng ức chế

15

quá trình peroxy hóa lipid của các chất được đánh giá thông qua việc xác định hàm

lượng malonyldialdehyde (MDA) - sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng tế

bào.

 Định lượng MDA theo phương pháp của Wojciech Wasowicz

Phương pháp định lượng MDA theo Wojciech Wasowicz dựa trên phản ứng

của malondialdehyd (MDA) với acid thiobarbituric (TBA) trong môi trường acid,

tạo ra hợp chất trimethin màu hồng có cực đại hấp thụ tại 532nm. Do đó, có thể định

lượng MDA thông qua mật độ quang của phức hợp tạo thành .Sử dụng 1,1,3,3- tetramethoxypropan (TMP) để xây dựng đường chuẩn [63].

 Định lượng MDA theo phương pháp của Gérard-Monnier

Phương pháp định lượng MDA theo Gérard-Monnier dựa trên phản ứng của malonaldehyd (MDA) với 2 phân tử 1-methyl-2-phenylindol ở 450C. Sản phẩm tạo thành có cực đại hấp thụ ở bước sóng 586 nm [27]. Do đó, có thể định lượng MDA thông qua đo độ hấp thụ quang của phức hợp tạo thành. Sử dụng 1,1,3,3-

16

tetramethoxypropan (TMP) để xây dựng đường chuẩn.

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Dược liệu nghiên cứu

Thạch tùng răng cưa được thu hái vào

tháng 9 năm 2019 tại Đà Lạt, Lâm Đồng. Mẫu

cây được giám định thực vật học bởi Khoa Tài

nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Theo kết quả giám định, mẫu Thạch tùng răng cưa thu

hái tại Đà Lạt, Lâm Đồng có tên khoa học là

Huperzia serrata (Thunb.) Trevis. (Phụ lục

01). Mẫu tiêu bản số TB-7104, TB-8575, TB-

8919 được lưu trữ tại Phòng tiêu bản của Khoa tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Mẫu

nghiên cứu sau đó được chiết theo phương

pháp chiết alcaloid bằng dung môi hữu cơ

trong môi trường kiềm để thu cao chiết giàu

Hình 2.1.1 Cây Thạch tùng răng cưa Huperzia serrata (Thunb.) Trevis

alcaloid từ Thạch tùng răng cưa.

2.1.2. Mẫu nghiên cứu

 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Dược liệu sau khi thu mua được làm sạch, sấy khô và tán thành bột thô. Cân

bột dược liệu vào cốc, làm ẩm bằng amoniac đậm đặc. Thêm dung môi Cloroform,

siêu âm, lọc, thu được dịch chiết cloroform. Dịch chiết sau đó được làm bay hơi một

phần để thu hồi dung môi dùng cho lần chiết tiếp theo. Tinh sạch chất bằng cách

chiết với dung dịch axit sulfuric 2% và dung dịch cloroform. Cô quay thu hồi dung

môi đến khi thu được cắn. Quy trình chiết được trình bày ở Hình 2.1.2. Cao khô định chuẩn đạt độ ẩm 3,96% và tỷ lệ cao chiết: dược liệu là 0,23%. Hàm lượng Hup A

17

trong cao khô được định lượng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPLC cho kết quả 9,7% [7].

Hình 2.1.2 Phương pháp chiết alcaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm

2.2. Phương tiện nghiên cứu

2.2.1. Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng, giống đực, chủng Swiss, trọng lượng 18-22g được cung cấp

bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương. Trước khi tiến hành thử nghiệm, chuột nuôi

ổn định trong phòng thí nghiệm ít nhất 7 ngày. Điều kiện nuôi ở 22 - 26 độ C, đảo

ngược sáng tối (7 giờ: tối, 19 giờ: sáng). Chuột được nuôi bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp, nước sạch được cho uống tự do.

1.2.2. Hóa chất, dung môi

- Enzym acetylcholinesterase loại EC 3.1.1.7 (Sigma, Singapore)

- Acetylthiocholine iodide (ATCI) (Sigma, Singapore)

- 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) (Sigma, Singapore)

18

- Acid ascorbic 99% (Sigma, Singapore)

- Donepezil 5 mg biệt dược Alzepil (Egis Pharma, Hungary).

- Scopolamin (Sigma, Singapore)

- Một số hóa chất phòng thí nghiệm: HCl, NaCl, NH3, NaCMC, H2SO4,...

- Dung môi: Cloroform (CHCl3), MeOH, nước cất .

1.2.3. Thiết bị, dụng cụ

- Cân phân tích AY 129 (Shimadzu, Nhật Bản)

- Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal

- Máy đo quan UV Aligenttechnologies Cary 60 UV-Vis, Mỹ

- Máy cô quay chân không Rovapor R-210 (Buchi-Đức)

- Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sỹ)

- Giấy lọc (đường kính 11 cm), phễu lọc

- Cuvet (1ml), ống Eppendorf 1,5ml

- Các dụng cụ thủy tinh: Pipet, đầu côn các loại, bình định mức, bình chiết, các loại cốc có mỏ dung tích 25-500ml, bình cầu và các dụng cụ cần thiết khác.

- Máy nghiền đồng thể (Wisetir HS-30E, Mỹ)

- Mê lộ chữ Y

- Mê lộ nước Morris

2.3. Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện các mục tiêu đề ra, đề tài được thiết kế với các nội dung sau:

 Nội dung 1: Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE và dọn gốc tự do in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.)

Trevis.).

 Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của cao chiết giàu alcaloid

từ Thạch tùng răng cưa.

 Đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao chiết giàu alcaloid

từ Thạch tùng răng cưa.

 Nội dung 2: Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin in vivo của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa thông qua các thử nghiệm:

 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng

scopolamin in vivo thông qua các thử nghiệm:

- Thử nghiệm hành vi: thử nghiệm mê lộ chữ Y và thử nghiệm mê lộ

19

nước Morris

- Đánh giá các marker sinh học: định lượng hoạt độ AChE và hàm lượng

MDA trong mô não của chuột nhắt trắng.

Nội dung nghiên cứu được sơ đồ hóa ở Hình 2.3.1 dưới đây:

Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alkaloid từ Thạch tùng răng cưa

Đánh giá tác dụng ức chế AChE

và chống oxy hóa in vitro Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin

Đánh giá dọn gốc tự do Marker sinh học Các test hành vi Đánh giá tác dụng ức chế AChE

• • - Test mê lộ chữ Y

• • - Test mê lộ nước Morris

- Định lượng AChE trong mô não - Định lượng MDA trong mô não

Hình 2.3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE và chống oxy hóa in vitro

2.4.1.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro

Tác dụng ức chế enzym AChE của cao chiết giàu alcaloid từ cây Thạch tùng

răng cưa được đánh giá theo phương pháp của Ellman và cộng sự (1961) [25].

Nguyên tắc

Cơ chất acetylcholin iodid (ACTI) bị thủy phân nhờ xúc tác của enzym acetylcholinesterase tạo ra thiocholin. Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử

acid 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) để tạo thành hợp chất acid 5-thio-2-

20

nitrobenzoic có màu vàng. Lượng hợp chất màu được tạo thành trong một đơn vị

thời gian tỷ lệ thuận với hoạt tính AChE. Phản ứng xảy ra được thể hiện ở Hình 2.4.1.

Dựa vào xác định độ hấp thụ quang của mẫu thử ở bước sóng 412 nm để đánh giá hoạt tính của AChE.

Thiocholin Cơ chất ATCI

Thuốc thử DTNB

Màu vàng

Hình 2.4.1 Phản ứng giữa các chất trong hỗn hợp phản ứng Ellman

Cách tiến hành

Cao chiết Thạch tùng răng cưa và chứng dương được hoà tan trong dung dịch

đệm phosphat pH = 7,5 có chứa 1% DMSO thành dung dịch gốc nồng độ 10.000

µg/ml. Từ các dung dịch gốc nồng độ 10.000 µg/ml pha loãng ra thành các nồng độ

thấp hơn bằng dung dịch đệm phosphat pH = 7,5. Phản ứng định lượng được thực hiện trên đĩa 96 giếng ở nhiệt độ phòng (25oC).

Hỗn hợp phản ứng bao gồm 120 µl dung dịch đệm natri phosphat (pH 7,5), 20 µl dung dịch thử ở các nồng độ khác nhau và 20 µl dung dịch AChE 0,25 IU/ml. Trộn đều và đem ủ trong bóng tối 15 phút tại 25oC. Sau đó, thêm 20 µl DTNB 1,25 mM và 20 µl ACTI 1,25 mM, trộn đều.

Động học của phản ứng được theo dõi bằng cách đo mật độ quang của các giếng tại bước sóng 412 nm với tần suất 1 phút/lần trong thời gian 10 phút. Tất cả

các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Donepezil được sử dụng làm chứng dương.

Đánh giá kết quả

Đánh giá tác dụng ức chế AChE qua giá trị I% được tính theo công thức:

× 100%

I% =

∆ODo/phút -∆ODt/phút ∆ODo/phút

21

Trong đó: ΔODo/phút: thay đổi mật độ quang mỗi phút của giếng trắng.

ΔODt/phút: thay đổi mật độ quang mỗi phút của giếng có mẫu thử/chứng

dương.

IC50: Nồng độ ức chế 50% hoạt độ của enzym cholinesterase.

2.4.1.2. Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do in vitro

Nguyên tắc

Thử nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Kumar [54]. Hợp chất 2,2-

diphenyl-2-picryhydrazin (DPPH) có khả năng tạo ra gốc tự do, bền trong dung dịch

MeOH bão hòa. Dung dịch có màu tím đỏ, khi phản ứng với chất chống oxy hóa sẽ

tạo thành phức hợp màu vàng. Phức hợp này không hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 517 nm.

Cách tiến hành

Dung dịch DPPH 0,1 mM: hòa tan 2,19 mg DPPH trong 50ml methanol.

Mẫu thử là cao chiết alcaloid của Thạch tùng răng cưa được pha trong dung

môi MeOH thành các nồng độ khác nhau. Chất đối chứng là quercetin pha loãng

tương tự.

Cho vào giếng hỗn hợp gồm: 20 µl dung dịch mẫu thử hoặc chất đối chứng

hoặc MeOH và 180 µl dung dịch DPPH (0,1 mM).

Trộn đều hỗn hợp trong vòng 1 phút rồi tiếp tục ủ 30 phút trong bóng tối ở

nhiệt độ phòng. Dung dịch sau khi phản ứng được đem đo độ hấp thụ quang ở bước

sóng 517 nm.

Đánh giá kết quả

Hoạt tính quét gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức

chế I%, được tính theo công thức:

× 100% I% = ODtr -ODth ODtr

Trong đó:

+ I (%): phần trăm dọn gốc tự do DPPH.

+ ODtr: Độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch mẫu trắng.

22

+ ODth: Độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch mẫu thử/mẫu đối chứng.

Khả năng dọn gốc tự do của dịch chiết được so sánh với chất chứng dương là

quercetin.

2.4.2. Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng

scopolamin.

 Triển khai mô hình đánh giá tác dụng của cao chiết

Nguyên tắc

Scopolamin là một chất đối kháng cạnh tranh với chất dẫn truyền thần kinh

acetylcholin tại thụ thể M1 muscarinic hậu synap. Scopolamin thay thế các Ach gắn

vào thụ thể muscarinic, làm gián đoạn quá trình dẫn truyền tín hiệu thần kinh; đồng

thời lượng ACh giải phóng quá mức dẫn đến phá hủy các tế bào thần kinh vùng đồi

hải mã và gây ra suy giảm khả năng học tập và trí nhớ [19,65].

Chuẩn bị chế phẩm

Cao chiết (30 mg/kg và 60 mg/kg) và donepezil (5 mg/kg) được pha trong

dung dịch natri carboxymethyl cellulose (NaCMC) 0,5%.

Thiết kế thử nghiệm

Chuột nhắt trắng, giống đực, chủng Swiss được nuôi ổn định 7 ngày trước khi

thí nghiệm. Chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm khác nhau, mỗi nhóm 10 con.

- Nhóm chứng sinh lý: uống dung dịch NaCMC 0,5%.

- Nhóm chứng bệnh: uống dung dịch NaCMC 0.5%.

- Nhóm cao chiết liều 30 mg/kg: uống dung dịch cao chiết giàu alcaloid liều 30

mg/kg.

- Nhóm cao chiết liều 60 mg/kg: uống dung dịch cao chiết giàu alcaloid liều 60

mg/kg.

- Nhóm donepezil: uống donepezil với liều 5 mg/kg.

Dựa trên kết quả của thử nghiệm đánh giá độc tính cấp trước đó đã xác định giá trị LD50 của cao chiết là 707 (526 – 1043) mg/kg cân nặng và các nghiên cứu trước đây, liều dùng trong thử nghiệm được lựa chọn là 30 mg/kg (nhỏ hơn 1/20 LD50) và 60 mg/kg (nhỏ hơn 1/10 LD50) [3,7,45].

Các nhóm chuột được cho uống cao chiết/donepezil/NaCMC 0,5% liên tục

23

trong suốt quá trình nghiên cứu (23 ngày) và 1 giờ trước khi thực hiện các thử nghiệm. Chuột được gây suy giảm trí nhớ bằng cách tiêm màng bụng scopolamin: với liều 3

mg/kg trong thử nghiệm mê lộ chữ Y và 1 mg/kg trong thử nghiệm mê lộ nước

Morris. Ở ngày thứ 14, tiến hành thử nghiệm mê lộ chữ Y. Ngày thứ 18 – 22, tiến hành thử nghiệm mê lộ nước Morris. Ngày thứ 23, sau 24 giờ từ khi kết thúc thử

nghiệm mê lộ nước Morris, tiến hành gây mê chuột ở tất cả các nhóm và lấy não để

đánh giá hoạt độ của enzym AChE và hàm lượng MDA.

Hình 2.4.2 Sơ đồ triển khai mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin in vivo

2.4.2.1. Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thông qua thử nghiệm mê lộ chữ Y

Nguyên tắc

Thử nghiệm mê lộ chữ Y là thử nghiệm hành vi dùng để đánh giá trí nhớ

không gian ngắn hạn của động vật thử nghiệm được mô tả lần đầu vào năm 1992 bởi

nhà khoa học Dellu [23]. Thử nghiệm này được tiến hành dựa vào hành vi khám phá

của động vật gặm nhấm giúp chúng thu thập thông tin về môi trường mới. Trong thử

nghiệm mê lộ chữ Y, chuột có xu hướng tìm đến cánh mà chúng chưa khám phá (hay có xu hướng khám phá lần lượt ba cánh tay liên tiếp).

Bố trí thí nghiệm

24

Mê lộ chữ Y được sử dụng rộng rãi để đánh giá trí nhớ không gian của động vật. Mê lộ này có 3 cánh tay ( được ký hiệu là A, B và C), kích thước mỗi cánh tay giống hệt nhau (kích thước 30 x 6 x 15 cm) được bố trí theo hình chữ Y, cách nhau 120o. Một bóng đèn 10W chiếu sáng nhẹ, được bố trí để cường độ sáng ở ba cánh

tay là như nhau. Toàn bộ hoạt động của chuột trong mê lộ được theo dõi và ghi lại

bằng camera đặt phía trên, chính giữa mê lộ.

Tiến hành Vào ngày thử nghiệm, sau khi được cho uống chế phẩm/donepezil/nước cất

1 giờ và sau 30 phút được tiêm scopolamin vào màng bụng. Tiến hành thử nghiệm:

chuột được đặt nhẹ nhàng vào một cánh tay bất kỳ và tự do khám phá các cánh tay

trong 8 phút. Ghi nhận số lần chuột di chuyển vào 3 cánh tay khác nhau liên tiếp và

trình tự chuột di chuyển vào các cánh tay. Chuột được xem là di chuyển vào một

cánh tay khi cả bốn chân đều nằm trong cánh tay đó. Kết thúc mỗi thử nghiệm, mê

lộ được vệ sinh bằng khăn sạch tẩm cồn và làm khô tự nhiên để tránh lưu mùi.

Đánh giá

Tỷ lệ chuyển tiếp là tỷ lệ % số lần chuột khám phá 3 cánh tay khác nhau liên

tiếp, được tính theo công thức sau:

Tỷ lệ chuyển tiếp = 100% Số lần chuột di chuyển vào ba cánh liên tiếp Tổng số lần thay đổi cánh − 2

Trong đó, một lần chuột di chuyển vào ba cánh liên tiếp được tính nếu chuột

đi vào ba cánh tay khác nhau liên tiếp (ABC, ACB, BAC, BCA, CAB hoặc CBA).

2.4.2.2. Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thông qua thử nghiệm mê lộ nước Morris

Nguyên tắc

Thử nghiệm mê lộ nước Morris được mô tả lần đầu tiên năm 1981 [44]. Đây

là một thử nghiệm đánh giá khả năng học tập và trí nhớ không gian dài hạn của loài

gặm nhấm thông qua bài tập tìm bến đỗ. Thử nghiệm dựa vào bản năng sinh tồn và

khả năng ghi nhớ vị trí không gian của chuột, khi cho vào nước, chuột sẽ bơi để tìm

bến đỗ và nhớ vị trí bến đỗ ở các lần tiếp theo.

Tiến hành

Mệ lộ là một bể nước hình tròn đường kính 1,1m, cao 30cm, mực nước trong bể duy trì ở mức 15cm, nhiệt độ nước khoảng 25oC trong suốt quá trình thí nghiệm. Nước được làm đục bằng sữa. Bến đỗ có đường kính 7,5cm, làm bằng thủy tinh trong suốt, đặt cố định tại một góc phần tư của mê lộ. Thử nghiệm mê lộ nước Morris kéo

25

dài 5 ngày, bao gồm 2 giai đoạn:

Giai đoạn luyện tập – bài tập có bến đỗ: Bài tập diễn ra trong 4 ngày. Trong

bài tập này, bến đỗ được đặt thấp hơn mặt nước 1cm. Chuột bắt đầu bơi lần lượt tại một trong 3 góc phần tư còn lại của mê lộ. Mỗi lần chuột tập trong 1 phút, tập 3

lần/ngày, mỗi lần cách nhau 1 phút. Trong thời gian đó, chuột nhanh chóng được lau

khô và sưởi ấm. Nếu không tìm được bến đỗ trong 90 phút thì chuột sẽ được hướng

dẫn cách tìm thấy bến đỗ và ở đó 10 giây. Thử nghiệm được ghi lại bằng camera.

Chỉ tiêu đánh giá là thời gian trung bình tìm thấy bến đỗ của 3 lần luyện tập trong

ngày.

Giai đoạn thử nghiệm – bài tập không có bến đỗ: Trong ngày thứ 5, bến đỗ

được bỏ ra ngoài và chuột bơi trong mê lộ 1 lần duy nhất trong 1 phút. Chuột phải

tìm bến đỗ dựa vào trí nhớ đã hình thành những ngày trước đó và có xu hướng bơi

lâu hơn tại góc phần tư có bến đỗ trước đó. Chỉ tiêu đánh giá là thời gian chuột bơi ở góc phần tư này.

2.4.2.3. Định lượng hoạt độ AChE in vivo trong mô não

Nguyên tắc

Hoạt độ AChE được định lượng theo phương pháp của Ellman (1961), dựa

vào phản ứng tạo màu giữa DTNB và thiocholin, một sản phẩm tạo thành từ phản

ứng thủy phân cơ chất ACTI dưới xúc tác của AChE.

Cách tiến hành

Sau thử nghiệm mê lộ nước Morris 24 giờ, chuột bị giết và lấy não. Ngay sau

đó não được rửa nhanh với nước muối sinh lý, cân và nghiền đồng thể với dung dịch

đệm phosphat pH = 7,5 chứa 2% trion X-100 (tỷ lệ 2:100) trong điều kiện nhiệt độ từ 0 – 4oC. Ly tâm lạnh (0oC) với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 30 phút. Lấy phần dịch nổi để định lượng hoạt độ AChE. Phần dịch này đóng vai trò nguồn enzym.Phản ứng thực hiện trên đĩa 96 giếng ở nhiệt độ phòng (25oC).

Hỗn hợp phản ứng được thêm lần lượt theo thứ tự gồm:

Đệm phosphat pH=7,5, 100 mM: Nguồn enzym: DTNB 4 mM: ATCI 6 mM: 100 µl 30 µl 40 µl 30 µl

Động học của phản ứng được theo dõi bằng cách đo mật độ quang của các

26

giếng tại bước sóng 412 nm, tần suất 2 phút/lần trong 10 phút.

Hoạt độ AChE trong não toàn phần được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hoạt

độ (UI/g não). Trong đó, một đơn vị hoạt độ AChE là lượng enzym xúc tác cho sự

hình thành 1 mol thiocholin/phút tại pH = 7,5 ở nhiệt độ phòng.

 Hoạt độ enzym (UI) =  V  ⁄ OD phút 0,0136  0,6 200 30 k m

Trong đó:

ΔOD/phút là thay đổi mật độ quang/phút của giếng chứa hỗn hợp phản ứng

200 là thể tích hỗn hợp phản ứng trong mỗi giếng (µl) 0,0136 là hệ số hấp thụ micromol phân tử của phức tạo thành sau phản ứng tại bước sóng 412 nm (µM-1.cm-1) 0,6 là độ cao của dung dịch trong mỗi giếng (cm)

k là hệ số pha loãng (lít)

30 là thể tích nguồn enzym trong hỗn hợp phản ứng (µl)

m là khối lượng não toàn phần (g)

V là thể tích dịch nghiền đồng thể não (ml)

2.4.2.4. Định lượng hàm lượng malondialdehyd (MDA) trong mô não

Nguyên tắc

Hàm lượng malondialdehyd (MDA) được định lượng theo phương pháp của

Wojciech Wasowicz và cộng sự, dựa trên phản ứng của malondialdehyd (MDA) với

acid thiobarbituric (TBA) trong môi trường acid, tạo ra hợp chất trimethin màu hồng

có cực đại hấp thụ ở bước sóng 532 nm [48].

Cách tiến hành

Thêm chất chống oxy hóa pha dầu hydroxytoluen butylat hóa (BHT) trong điều kiện lạnh (nhiệt độ 0 – 4oC) vào phần dịch nghiền đồng thể mô não. Ly tâm lạnh (0oC) với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút. Hỗn hợp phản ứng được đựng trong ống nghiệm thủy tinh có nắp, trộn, hấp cách thủy ở nhiệt độ trên 95oC trong 60 phút và để nguội. Mẫu trắng và mẫu chuẩn được thực hiện tương tự. Thành phần

các chất có trong phản ứng được trình bày ở bảng 2.4.1.

Lấy chính xác 500 µl dung dịch sau phản ứng từ các ống nghiệm vào ống eppendorf đã chứa 750 µl n-butanol, đem ly tâm trong 5 phút. Sau đó, lấy 750 µl lớp n-butanol sau ly tâm vào ống eppendorf có chứa Na2SO4 khan, đem ly tâm trong 5

27

phút rồi lấy 200 µl mẫu đem đo quang ở bước sóng 532 nm. Mỗi thử nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần được làm trên 3 giếng.

Bảng 2.4.1. Thành phần của hỗn hợp phản ứng

Mẫu trắng Mẫu chuẩn Mẫu thử

150 µl nước cất 150 µl TMP

150 µl phần dịch nổi sau ly tâm

1 ml TBA 1 ml TBA 1ml TBA

1ml nước cất 1 ml nước cất 1ml nước cất

Tiến hành đo độ hấp thụ của các mẫu ở bước sóng 532 nm. Xây dựng đường

chuẩn để xác định hàm lượng MDA trong mô não theo công thức:

Hàm lượng MDA (mol g⁄ ) = a  V  b m

Trong đó:

l⁄ ) là nồng độ MDA tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của

a (mmol chất chuẩn TMP.

V (ml) là thể tích dịch nghiền đồng thể não với giá trị V = 2ml.

b = 707/30 là hệ số pha loãng

m (g) là khối lượng não

2.5. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm thống kê Microsoft excel 2013, SPSS 22, Graphpad Prism

8 để xử lý số liệu.

Với các mẫu liên tục, phân bố chuẩn, dữ liệu được biểu diễn dưới dạng X ±

SE. So sánh giá trị trung bình giữa các nhóm bằng one-way ANOVA, kèm hậu kiểm

LSD và Dunett’s T3.

Với các mẫu rời rạc hoặc không tuân theo phân bố chuẩn, dữ liệu được biểu

diễn dưới dạng trung vị (khoảng tứ phân vị) và sử dụng kiểm định Kruskal Wallis,

sau đó là kiểm định Mann-Whitney U để so sánh khác biệt giữa các nhóm .

Sự khác biệt giữa các nhóm được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

28

Giá trị IC50 và khoảng tin cậy 95% của IC50 được xác định dựa trên tỷ lệ phần trăm ức chế tại các nồng độ khác nhau, sử dụng phương pháp hồi quy phi tuyến tính bằng mô hình sigmoid trên phần mềm Graphpad Prism 8.

Chương 3 – KẾT QUẢ

3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE và khả năng dọn gốc tự do in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa

3.1.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro

Cao chiết alcaloid của Thạch tùng răng cưa được đánh giá tác dụng ức chế

AChE bằng phương pháp của Ellman và cộng sự. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa được trình

bày trong bảng 3.1.1.

Bảng 3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất chuẩn donepezil.

Nồng độ % Ức chế IC50 (µg/ml) Mẫu (µg/ml) (Khoảng tin cậy 95% của IC50) AChE

2 23,32

7,93 Cao 5 33,96

Thạch tùng (5,43-10,98) 10 52,23 răng cưa 15 67,15

20 78,81

0,05 12,42

0,28 0,1 23,43

(0,26-0,31) Donepezil 0,2 39,42

0,4 61,81

0,8 75,23

Nhận xét

- Chất chuẩn donepezil thể hiện tác dụng ức chế AChE in vitro với giá trị

IC50 là 0,28 µg/ml và khoảng tin cậy 95% của IC50 là 0,26 – 0,31 µg/ml.

- Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa thể hiện tác dụng ức chế

AChE in vitro với IC50 = 7,928 g/ml (khoảng tin cậy 95% của IC50 là 5,429-10,98

29

g/ml) gấp 36 lần giá trị IC50 của chất chuẩn donepezil. Như vậy, cao chiết giàu

alcaloid từ Thạch tùng răng cưa có khả năng ức chế AChE tốt trên mô hình thử

nghiệm in vitro.

3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa

Đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch

tùng răng cưa in vitro theo phương pháp của Kumar [54]. Kết quả đánh giá khả năng

dọn gốc tự do của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và quercetin được trình bày ở bảng 3.1.2 sau đây:

Bảng 3.1.2 Giá trị IC50 của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất chuẩn quercetin

Mẫu Nồng độ (µg/ml) % Ức chế DPPH IC50 (µg/ml) (Khoảng tin cậy 95% của IC50)

10 3,00

56,06 Cao 30 24,96

(37,56-90,55) Thạch 50 44,15

tùng răng 100 78,59 cưa 300 82,46

0,5 3,32

2,65 Quercetin 1 9,24

(1,89-3,03) 3 56,24

5 83,57

10 93,05

Nhận xét

- Chất chuẩn quercetin thể hiện khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro với

giá trị IC50 là 2,65 µg/ml và khoảng tin cậy 95% của IC50 là 1,89 – 3,03 µg/ml.

- Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa thể hiện khả năng dọn gốc

tự do DPPH in vitro với IC50 = 56,06 g/ml (khoảng tin cậy 95% của IC50 là 37,56

30

– 90,55 g/ml) gấp 21 lần giá trị IC50 của chất chuẩn quercetin.

3.2. Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin

3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thông qua thử nghiệm mê lộ Y

Thử nghiệm mê lộ chữ Y được thực hiện vào ngày thứ 14 để đánh giá trí nhớ

không gian ngắn hạn của động vật thử nghiệm. Mẫu thử được coi là có tác dụng cải

thiện trí nhớ của động vật thí nghiệm khi tỷ lệ chuyển tiếp giữa các cánh của động vật thử nghiệm ở nhóm đó cao hơn nhóm bệnh chứng (p < 0.05).

Kết quả của thử nghiệm được trình bày ở hình 3.2.1:

Hình 3.2.1. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến tỷ lệ chuyển tiếp giữa các cánh

Ghi chú: Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng M ± SE; #: khác biệt có ý nghĩa

thống kê so với nhóm chứng sinh lý (p<0,001); *: khác biệt có ý nghĩa thống kê so

với nhóm chứng bệnh (p<0,05); ns: khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các

nhóm (p>0,05) (kiểm định ANOVA).

Nhận xét

Kết quả cho thấy, chuột thuộc nhóm chứng bệnh có tỷ lệ chuyển tiếp giảm

21,78% (p<0,001) so với nhóm chứng sinh lý. Nhóm chuột dùng donepezil liều 5 mg/kg làm tăng tỷ lệ chuyển tiếp so với nhóm chứng bệnh với tỷ lệ tăng là 15,01% (p<0,05).

31

Hai nhóm chuột uống cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg đều có tỷ lệ chuyển tiếp giữa các cánh tăng 11,62% (p<0,01) và 19,82% (p<0,05) tương ứng so với nhóm chứng bệnh.

Đối với nhóm donepezil, tỷ lệ chuyển tiếp của nhóm cao chiết giàu alcaloid

từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg giảm 2,94% (p>0,05) và liều 60 mg/kg tăng 4,18% (p>0,05). Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa hai nhóm liều 30

mg/kg và 60 mg/kg (p>0,05).

3.2.2. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thông qua thử nghiệm mê lộ nước Morris

Từ ngày 18 đến ngày 22, chuột thuộc các nhóm được kiểm tra trí nhớ không gian dài hạn và khả năng học tập thông qua thử nghiệm mê lộ nước Morris. Thử

nghiệm gồm 2 bài tập (bài tập có bến đỗ và bài tập không có bến đỗ). Đánh giá hành

vi thông qua các thông số: thời gian tìm thấy bến đỗ ở bài tập có bến đỗ và thời gian

lưu tại góc phần tư có bến đỗ ở bài tập không có bến đỗ.

 Thời gian tìm thấy bến đỗ

Kết quả của bài tập có bến đỗ được trình bày ở hình 3.2.2.

Hình 3.2.2 Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến thời gian tìm thấy bến đỗ ở bài tập có bến đỗ

Ghi chú: Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng M ± SE; #: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng sinh lý (p<0,001); *: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng bệnh (p<0,05); (kiểm định ANOVA)

Nhận xét

Từ kết quả nhận thấy, qua 4 ngày luyện tập, chuột thuộc tất cả các nhóm đều

32

có xu hướng giảm dần thời gian tìm thấy bến đỗ.

So sánh thời gian tìm thấy bến đỗ giữa nhóm chứng bệnh với nhóm chứng

sinh lý trong cùng một ngày:

- Ngày 2: chuột thuộc nhóm chứng bệnh cần 56,0 ± 5,1 giây để tìm thấy bến đỗ còn chuột thuộc nhóm chứng sinh lý cần 44,5 ± 3,9 giây để thực hiện hoạt

động này, tỷ lệ chênh lệch là 20,53% (p <0,01).

- Ngày 3: chuột thuộc nhóm chứng bệnh lý và nhóm chứng sinh lý cần thời gian tương ứng là 50,3 ± 5,0 và 35,5 ± 4,4 giây để tìm thấy bến đỗ, tỷ lệ chênh lệch

là 29,42% (p<0,001).

- Ngày 4: chuột thuộc nhóm chứng sinh lý có thời gian tìm thấy bến đỗ là 30,6 giây, giảm 50,0% so với ngày 1. Trong khi đó, thời gian tìm thấy bến đỗ của

chuột thuộc nhóm chứng bệnh là 45,3 giây, giảm 28,3% so với ngày đầu tiên. Như

vậy, so với nhóm chứng sinh lý, nhóm chứng bệnh có xu hướng ghi nhớ thông tin

kém hơn (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê). Điều này có nghĩa là scopolamin đã gây

suy giảm trí nhớ và khả năng học tập của chuột [19].

So sánh với nhóm chứng bệnh: nhóm cao chiết cho thấy thời gian tìm thấy

bến đỗ có xu hướng giảm nhiều hơn (so sánh cùng ngày). Ở ngày 4, nhóm cao chiết

giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và 60 mg/kg có thời gian tìm

thấy bến đỗ thấp hơn so với nhóm chứng bệnh, tỷ lệ giảm lần lượt là 12,05% (p<0,05)

và 17,57% (p<0,01).

 Thời gian lưu tại góc phần tư có bến đỗ

Tại ngày thứ 5, bài tập không có bến đỗ được tiến hành để đánh giá trí nhớ

không gian dài hạn của động vật gặm nhấm. Mục tiêu của nhóm nghiên cứu là đánh

giá được khả năng củng cố trí nhớ đã được xây dựng trước đó. Chuột được coi là có

cải thiện trí nhớ khi thời gian lưu tại góc phần tư có bến đỗ lâu hơn so với nhóm

bệnh chứng (p<0,05). Kết quả thời gian lưu tại góc phần tư có bến đỗ của chuột ở

33

ngày 5 được trình bày ở Hình 3.2.3:

Hình 3.2.3 Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa tới thời

gian lưu tại góc phần tư có bến đỗ ở bài tập không có bến đỗ

Ghi chú: Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng M ± SE; #: khác biệt có ý nghĩa thống

kê so với nhóm chứng sinh lý (p < 0,001); *: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với

nhóm chứng bệnh (p < 0,05); ns: không có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm (p >

0,05) (kiểm định ANOVA).

Nhận xét:

Nhóm chứng bệnh có thời gian lưu tại góc phần tư có bến đỗ ngắn hơn so với

nhóm chứng sinh lý với tỷ lệ giảm là 47,20% (p<0,001).

Nhóm donepezil liều 5 mg/kg làm tăng thời gian lưu tại góc phần tư có bến

đỗ so với nhóm chứng bệnh, tỷ lệ tăng 62,49 % (p<0,001).

Nhóm cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và 60

mg/kg làm tăng thời gian lưu tại góc phần tư có bến đỗ của chuột so với nhóm chứng

bệnh, tỷ lệ tăng lần lượt là 36,39% (p<0,05) và 48,82% (p<0,01). So sánh với nhóm donepezil, chuột thuộc nhóm cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30

mg/kg và 60 mg/kg đều có thời gian lưu tại góc phần tư có bến đỗ giảm không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa hai mức liều thử (p>0,05).

3.2.3. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hoạt độ AChE trong não

34

Trong thử nghiệm trước đó, mẫu nghiên cứu đã thể hiện hoạt tính ức chế

enzym AChE tốt trên mô hình in vitro. Để làm rõ hơn về cơ chế hoạt động của mẫu

thử liên quan đến hoạt tính đề kháng hệ cholinergic, nhóm nghiên cứu tiến hành định lượng hoạt độ enzym AChE trong thể đồng nhất mô não chuột nhắt trắng sau khi kết

thúc nghiên cứu. Mẫu nghiên cứu được coi là có tác dụng ức chế enzym AChE khi

hoạt độ AChE của nhóm cao chiết thấp hơn nhóm bệnh chứng (p<0,05). Kết quả

định lượng hoạt độ AChE in vivo được trình bày ở Hình 3.2.4.

Hình 3.2.4 Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hoạt

độ AChE trên thể đồng nhất não chuột

Ghi chú: Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng M ± SE; #: khác biệt có ý nghĩa thống

kê so với nhóm chứng sinh lý (p<0,001); *: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với

nhóm chứng bệnh (p<0,05); ns: không có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm (p>0,05)

(kiểm định ANOVA).

Nhận xét

Kết quả của thử nghiệm định lượng AChE cho thấy nhóm chứng bệnh có hoạt

độ enzym tăng đáng kể so với nhóm chứng sinh lý với tỷ lệ tăng là 42,52% (p<0,01).

Nhóm chuột được cho uống donepezil liều 5 mg/kg có biểu hiện giảm 17,91% (p<0,05) hoạt độ enzym AChE so với nhóm chứng bệnh. Hai nhóm uống cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg có xu hướng làm giảm hoạt độ enzym AChE với tỷ lệ giảm 45,89% (p<0,001) và 52,57% (p<0,001) tương ứng so với nhóm chứng bệnh. Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng

35

răng cưa liều 30 mg/kg và 60 mg/kg làm giảm hoạt độ AChE so với nhóm donepezil,

tỷ lệ giảm tương ứng là 34,77% (p < 0,05) và 43,45% (p < 0,05). Sự khác biệt không

có ý nghĩa thống kê giữa hai mức liều dùng và giữa cao chiết và nhóm sinh lý.

3.2.4. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm

lượng malondialdehyd (MDA) trong mô não

Hàm lượng MDA trong não phản ánh mức độ peroxy hóa lipid màng tế bào

não chuột. Tiến hành định lượng MDA giúp nhóm nghiên cứu làm rõ hơn về cơ chế

tác dụng chống oxy hóa của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa. Mẫu nghiên cứu được coi là có tác dụng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào

khi hàm lượng MDA trong thể đồng nhất mô não chuột nhắt trắng thấp hơn so với

nhóm bệnh chứng (p<0,05).

Kết quả định lượng MDA trong mô não được trình bày ở hình 3.2.5:

Hình 3.2.5 Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm

lượng malondialdehyd (MDA) trong mô não

Ghi chú: Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng M ± SE; #: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng sinh lý (p<0,05); *: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm

chứng bệnh (p<0,05); ns: khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa hai nhóm liều (p>0,05) (kiểm định ANOVA).

Nhận xét

Kết quả của thử nghiệm cho thấy nhóm chứng bệnh có hàm lượng MDA trong

36

mô não cao hơn so với nhóm chứng sinh lý với tỷ lệ tăng 27,59% (p<0,05). Nhóm chuột dùng donepezil liều 5 mg/kg làm giảm đáng kể hàm lượng MDA với tỷ lệ giảm

46,76% (p<0,01) so với chuột thuộc nhóm chứng bệnh. Hàm lượng MDA trong thể

đồng nhất mô não chuột thuộc nhóm cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và 60 mg/kg thấp hơn nhóm chứng bệnh, tỷ lệ giảm tương ứng là

36,81% (p<0,01) và 43,17% (p<0,01). So với nhóm chứng dương donepezil, nhóm

cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và 60 mg/kg có hàm

lượng MDA cao hơn nhưng không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Sự khác biệt không

37

có ý nghĩa thống kê giữa hai mức liều (p>0,05).

Chương 4 – BÀN LUẬN

Sa sút trí nhớ và bệnh Alzheimer là căn bệnh phổ biến ở người cao tuổi nhưng

cũng có ghi nhận số ca mắc ở độ tuổi dưới 60. Bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống của cả người bệnh và gia đình, dẫn đến tử vong ở giai đoạn

nặng. Tuy nhiên, các thuốc điều trị sa sút trí nhớ hiện nay còn hạn chế về số lượng

với 6 thuốc được chấp nhận trong điều trị sa sút trí nhớ thuộc hai nhóm: nhóm ức

chế enzym acetylcholinesterase và nhóm đối kháng thụ thể NMDA. Bản thân các

thuốc này còn có nhiều nhược điểm như thời gian bán thải ngắn, tác dụng làm giảm

triệu chứng nhưng không ngăn chặn hoặc làm chậm được diễn tiến bệnh, cùng các

tác dụng phụ không mong muốn khi dùng thuốc. Trước những hạn chế trên, việc

nghiên cứu phát triển thuốc mới là vô cùng cần thiết. Trong đó, việc tìm kiếm thuốc

mới từ các hợp chất tự nhiên là một hướng đi có tính khả thi cao.

Trên thế giới, cây Thạch tùng răng cưa đã được ghi nhận có tác dụng tăng

cường trí nhớ [45]. Hiện tại có rất ít các nghiên cứu về loài cây này ở Việt Nam. Hơn

nữa mới chỉ có nghiên cứu trên đối tượng cao chiết cồn. Vì vậy, trong nghiên cứu

này, chúng tôi sử dụng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa để đánh giá

tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ ở chuột nhắt trắng bằng

scopolamin.

4.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE và chống oxy hóa in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa

4.1.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro

Enzym acetylcholinesterase (AChE) và giả thuyết cholinergic đóng vai trò

trung tâm trong nhiều nghiên cứu phát triển thuốc mới [17]. Trong đó, sự thiếu hụt

acetylcholin và sự suy yếu của các thụ thể muscarinic và nicotin được cho là gây ra

sa sút trí nhớ. AChE là enzym phân giải acetylcholin giúp kiểm soát dẫn truyền tín

hiệu thần kinh thông qua hệ cholinergic. Sự hoạt động quá mức của AChE dẫn đến việc acetylcholin bị phân giải nhanh, gây thiếu hụt chất dẫn truyền thần kinh. Vì vậy,

ức chế AChE được xem là mục tiêu để phát triển thuốc.

Để đánh giá khả năng ức chế AChE, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp đo độ hấp thụ quang của tác giả Ellman và cộng sự vì những ưu điểm như đơn giản, độ nhạy và tính lặp lại cao [25].

38

Donepezil là một trong số thuốc được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị sa sút trí nhớ. Thuốc đã được công nhận có tác dụng ức chế chọn lọc AChE và cải thiện trí nhớ đáng kể ở bệnh nhân mắc sa sút trí nhớ [56]. Trong nghiên cứu này,

donepezil được sử dụng làm mẫu chứng và có giá trị IC50 với khoảng tin cậy 95% là

0,28 (0,26 – 0,31) g/ml. Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của tác giả

Hachiro Sugimoto và cộng sự là 6,7 nM (khoảng 0,25 µg/ml) [56]. Điều này cho

thấy phương pháp thử nghiệm của chúng tôi phù hợp và kết quả thu được có ý nghĩa.

Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng

cưa có tác dụng ức chế AChE với giá trị IC50 là 7,93 (5,43 – 10,98) g/ml; tương

đồng với kết quả của tác giả Takuya Ohba và cộng sự đã công bố với giá trị IC50 =

5,96 µg/ml của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa tại Nhật Bản [45].

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thu và cộng sự đã đánh giá được tác dụng ức chế AChE in vitro của các phân đoạn dịch chiết từ lá và thân của Thạch tùng răng cưa

thu hái tại Sapa, Lào Cai cho thấy phân đoạn dịch chiết EtOAc có tác dụng ức chế

AChE mạnh nhất với IC50 là 89,96 ± 3,42 µg/ml [6]. Kết quả trong nghiên cứu của

chúng tôi cho thấy cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa có tác dụng ức chế

AChE in vitro tốt hơn phân đoạn dịch chiết có tác dụng mạnh nhất của họ. Điều này

chứng minh rằng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa có tác dụng tốt hơn

do alcaloid là thành phần chính có trong cao chiết.

4.1.2. Về kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do in vitro

Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH được sử dụng trong

nhiều nghiên cứu do độ chính xác cao, đơn giản, nhanh và chi phí thấp.

Trong cơ thể, quá trình sản sinh các gốc tự do và chống oxy hóa luôn xảy ra

đồng thời. Sự mất cân bằng giữa hai quá trình nói trên với sự gia tăng các gốc tự do

được gọi là tình trạng stress oxy hóa. Tổn thương các phân tử sinh học (protein, lipid,

DNA,...) và tạo ra nhiều gốc tự do khác là hậu quả của tình trạng này. Stress oxy hóa

có liên quan đến viêm và các bệnh thoái hóa thần kinh [34]. Trong đó, sa sút trí nhớ

được tin tưởng là do các gốc tự do góp phần tạo thành. Các chất chống oxy hóa có

vai trò quét sạch các gốc tự do và các ion kim loại, giúp ngăn chặn stress oxy hóa và bảo vệ tế bào thần kinh khỏi các gốc tự do.

Quercetin là một hợp chất thường được dùng làm mẫu chứng trong đánh giá

khả năng dọn gốc tự do in vitro. Vì kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy

quercetin có tác dụng chống oxy với IC50 là 2,65 (1,89 – 3,03) g/ml, tương đồng với nghiên cứu trước đây [58]. Cho nên phương pháp thử nghiệm của chúng tôi là phù hợp.

Kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro cho thấy cao chiết

39

giàu alcaloid của Thạch tùng răng cưa có IC50 = 56,06 (37,56 – 90,55) g/ml. Do

hiện nay chưa có nghiên cứu đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của

cao chiết toàn phần, phân đoạn chiết hay cao chiết giàu alcaloid của Thạch tùng răng cưa nên chúng tôi không thể bàn luận thêm.

Từ kết quả của 2 thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế AChE và khả năng dọn

gốc tự do DPPH in vitro, chúng tôi đã đánh giá rằng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch

tùng răng cưa có tiềm năng cải thiện trí nhớ trên động vật thử nghiệm.

4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa

Gỉa thuyết cholinergic cho rằng sự giảm sút chất dẫn truyền thần kinh hệ

cholinergic và sự suy yếu các thụ thể nicotinic và muscarinic gây suy giảm khả năng

nhớ và nhận thức [17]. Các mô hình sa sút trí nhớ sử dụng các chất đối kháng hệ

cholinergic để làm giảm lượng chất dẫn truyền thần kinh. Một trong số các chất này là scopolamin. Scopolamin là một chất đối kháng với chất dẫn truyền thần kinh

acetylcholin, gây giảm trí nhớ và nhận thức ở chuột [65]. Đề tài sử dụng mô hình

gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin không đòi hỏi khắt khe về điều kiện vật chất và

kỹ thuật, đồng thời có độ lặp lại và tỷ lệ sống sót cao nên được lựa chọn để thực hiện

thử nghiệm. Chuột được tiêm scopolamin liều 3 mg/kg ở thử nghiệm mê lộ chữ Y

và tiêm scopolamin liều 1 mg/kg ở thử nghiệm mê lộ nước Morris. Trong thời gian

tiến hành thử nghiệm đánh giá trí nhớ và khả năng nhận thức của chuột, các yếu tố

như ánh sáng, nhiệt độ, tiếng ồn,... được kiểm soát để đảm bảo không gây ảnh hưởng

đến kết quả thực nghiệm. Tất cả các thử nghiệm đều được thực hiện trong pha tối

của động vật thử nghiệm để phù hợp với đặc tính hoạt động vào ban đêm của loài

gặm nhấm.

4.2.1. Về kết quả của thử nghiệm hành vi

4.2.1.1. Về kết quả của thử nghiệm mê lộ chữ Y

Thử nghiệm mê lộ chữ Y là một thử nghiệm đơn giản được ứng dụng để đánh giá trí nhớ không gian ngắn hạn dựa vào hành vi thích khám phá của chuột. Thử

nghiệm có ưu điểm nổi bật là thực hiện dễ dàng, yêu cầu ít trang thiết bị và tiết kiệm. Thông số đánh giá là tỷ lệ chuyển tiếp. Chuột được coi là có trí nhớ tốt khi tăng tỷ lệ chuyển tiếp và ngược lại.

Kết quả của thử nghiệm cho thấy chuột thuộc nhóm chứng bệnh có tỷ lệ thay

40

đổi chuyển tiếp giảm 21,78% so với nhóm chứng sinh lý (p<0,001). Điều này có nghĩa là scopolamin liều 3 mg/kg đã gây suy giảm trí nhớ ở chuột thuộc nhóm chứng

bệnh. Các nhóm cao chiết liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg có cải thiện trí nhớ rõ rệt

với tỷ lệ chuyển tiếp tăng có ý nghĩa thống kê lần lượt là 11,62% (p<0,05) và 19,82% (p<0,01) so với nhóm chứng bệnh. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa hai

nhóm liều dùng. Kết quả này tương đồng với kết quả về tác dụng cải thiện trí nhớ

của cao chiết giàu alcaloid của Thạch tùng răng cưa thu hái ở Nhật Bản liều 30 mg/kg

được đưa ra bởi Takuya Ohba và cộng sự [45].

Khi so sánh hiệu quả tác dụng giữa chất chuẩn donepezil và 2 liều dùng của

cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa, kết quả thực nghiệm cho thấy liều 60

mg/kg có xu hướng tác dụng tăng cường trí nhớ không gian ngắn hạn tốt hơn

donepezil (p>0,05).

4.2.1.2. Về kết quả thử nghiệm mê lộ nước Morris

Thử nghiệm mê lộ nước Morris được áp dụng để đánh giá khả năng học tập và trí nhớ không gian dài hạn của loài gặm nhấm. Thử nghiệm dựa vào bản năng

sinh tồn của động vật sống trên cạn: khi đưa vào nước, chúng sẽ cố gắng bơi và tìm

cách trốn thoát khỏi môi trường xa lạ. Mô hình thử nghiệm cho phép động vật thử

nghiệm tự do lựa chọn hướng di chuyển. Do đó, thử nghiệm hạn chế được những sai

số không cần thiết. Thử nghiệm kéo dài trong 5 ngày, bao gồm 4 ngày luyện tập bài

tập có bến đỗ và 1 ngày thực hiện bài tập không có bến đỗ. Thông số đánh giá thử

nghiệm là thời gian tìm thấy bến đỗ (bài tập có bến đỗ) và thời gian lưu tại góc phần

tư có bến đỗ (bài tập không có bến đỗ).

Trong thử nghiệm mê lộ nước Morris, ở ngày 4, thời gian tìm thấy bến đỗ của

nhóm cao chiết liều 30 mg/kg và 60 mg/kg đều giảm có ý nghĩa thống kê với nhóm

chứng bệnh, tỷ lệ giảm lần lượt là 12,05% (p<0,05) và 17,57% (p<0,01). Cho thấy

nhóm cao chiết liều 30 mg/kg và 60 mg/kg được cải thiện trí nhớ và khả năng học

tập tiến bộ hơn nhóm chứng bệnh. Tại ngày thứ 5, kết quả cho thấy nhóm cao chiết

liều 30 mg/kg và 60 mg/kg đều tăng thời gian lưu tại góc phần tư có bến đỗ có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng bệnh với tỷ lệ tăng lần lượt là 36,39% (p<0,05)

và 48,82% (p<0,01). Như vậy, cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa có tác dụng cải thiện trí nhớ không gian dài hạn và khả năng học tập của chuột thông qua thử nghiệm mê lộ nước Morris.

Ở Việt Nam, tác giả Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự đã chứng minh cao

41

chiết cồn Thạch tùng răng cưa liều 0,533 g/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin dùng đường uống (1 mg/kg) (thông qua thử nghiệm mê lộ nước Morris) [3]. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của tác giả

Nguyễn Thị Thu Hiền ghi nhận tác dụng cải thiện trí nhớ ở chuột dùng cao chiết toàn

phần liều 600 mg/kg trong khi liều 300 mg/kg có xu hướng tăng trí nhớ nhưng không có ý nghĩa thống kê (thông qua mê lộ chữ Y và mê lộ nước Morris) [2].

Từ những nghiên cứu vừa kể trên, chúng tôi nhận thấy liều có tác dụng cải

thiện trí nhớ của cao chiết toàn phần là 533 – 600 mg/kg cao hơn hẳn so với liều có

tác dụng của cao chiết giàu alcaloid. Điều này có thể giải thích do alcaloid là thành

phần chính có tác dụng chống sa sút trí nhớ trong dược liệu Thạch tùng răng cưa.

4.2.2. Về kết quả định lượng các marker sinh học

4.2.2.1. Về kết quả định lượng hoạt độ AChE trong thể đồng nhất não chuột

Một ngày sau khi thử nghiệm trên chuột kết thúc, tiến hành định lượng hoạt

độ AChE trong mô não của chuột thuộc từng nhóm. Mục đích thử nghiệm này nhắm

tới là tìm hiểu cơ chế liên quan đến hoạt động ức chế AChE của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa.

Kết quả cho thấy 2 mức liều cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa

đều có tác dụng ức chế AChE trong mô não của động vật thử nghiệm, tỷ lệ giảm có

ý nghĩa thống kê lần lượt là 45,89% (p<0,001), 52,57% (p<0,001) so với nhóm chứng

bệnh. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm cao chiết. Điều này

phù hợp với kết quả của 2 test hành vi là mê lộ chữ Y và test mê lộ nước Morris:

chuột ở 2 nhóm cao chiết đều cải thiện trí nhớ không gian. Từ đó cho thấy cao chiết

giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa có tác dụng cải thiện trí nhớ theo cơ chế có liên

quan với sự điều tiết hệ thống cholinergic thông qua ức chế AChE. Một nghiên cứu

khác cũng chỉ ra cao chiết toàn phần liều 300 mg/kg và 600 mg/kg đều làm giảm

hoạt độ AChE trong não chuột với tỷ lệ giảm lần lượt là 12,15% (p<0,05) và 24,77%

(p<0,001) so với nhóm chứng bệnh [2]. Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng

cưa có tác dụng vượt trội hơn trong làm giảm hoạt độ AChE so với cao chiết toàn

phần giải thích tương tự do sự khác biệt thành phần của 2 mẫu cao chiết.

Ngoài ra khi so sánh với nhóm chứng dương, cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và 60 mg/kg thể hiện tác dụng ức chế AChE trong thể đồng nhất não chuột tốt hơn so với nhóm donepezil, tỷ lệ giảm tương ứng là 34,77% (p<0,05) và 43,45% (p<0,05). Trong khi đó, kết quả đánh giá in vitro cho thấy donepezil có tác dụng ức chế AChE tốt hơn cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng

42

răng cưa. Điều này gợi ý cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa có lẽ sở hữu đặc tính dược động học vượt trội hơn donepezil. Hiện nay ngoài một nghiên cứu

đánh giá tác dụng ức chế AChE in vivo của cao chiết toàn phần của Thạch tùng răng

cưa thì chỉ có nghiên cứu đánh giá tác dụng của Hup A. Theo nghiên cứu của Yan Qi Liang, Hup A có tiềm năng vượt trội hơn donepezil và rivastigmin trong việc gia

tăng hàm lượng acetylcholin và kéo dài thời gian tác dụng ức chế AChE trong vỏ

não chuột [68].

4.2.2.2. Về ảnh hưởng của cao chiết alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm lượng MDA trong mô não

Quá trình peroxy hóa lipid là quá trình oxy hóa các acid béo không bão hòa tạo thành các gốc tự do thông qua khử H+. Các sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid chủ yếu là lipid hydroperoxid (LOOH) và những sản phẩm phụ khác như

malondialdehyd (MDA), propanal, hexanal, 4-hydroxynonenal (4-HNE),... Ở não,

các phân tử lipid tập trung với mật độ cao và mức tiêu thụ oxy của não lớn nên quá trình peroxid hóa lipid diễn ra mạnh mẽ. Trong điều kiện bệnh lý, các gốc tự do được

sản sinh quá mức có thể gây tổn thương và gây chết tế bào thần kinh. Các nghiên

cứu trước đây chủ yếu sử dụng malondialdehyd (MDA) như một marker sinh học

hữu ích đế đánh giá quá trình peroxid hóa lipid ở não của động vật thử nghiệm do sự

đơn giản và chi phí thấp.

Kết quả nghiên cứu cho thấy scopolamin làm tăng hàm lượng MDA trong não

của động vật thí nghiệm 27,59% (p<0,05) so với nhóm chứng sinh lý. Kết quả này

phù hợp với cộng nhận scopolamin là tác nhân làm tăng biểu hiện stress oxy hóa

trong não thông qua peroxy hóa lipid và làm giảm khả năng chống oxy hóa của não

bộ [45]. Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và 60 mg/kg

có tác dụng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào não chuột khi làm giảm

hàm lượng MDA với tỷ lệ giảm lần lượt là 36,81% (p<0,01), 43,17% (p<0,01) so

với nhóm chứng bệnh. Kết quả này phù hợp với một nghiên cứu gần đây cho thấy

cao chiết toàn phần liều 300 mg/kg và 600 mg/kg cân nặng đều có tác dụng giảm nồng độ MDA trong não chuột với tỷ lệ giảm lần lượt là 23,44% (p<0,001) và 38,40%

(p<0,001) so với nhóm chứng bệnh [2]. Sự khác biệt về ảnh hưởng của mức liều đến hàm lượng MDA trong não chuột được giải thích là do khác biệt về thành phần của cao chiết. Ngoài ra, Hup A là một hợp chất alcaloid có tác dụng nổi bật trong cây Thạch tùng răng cưa. Theo tác giả Liang YZ và cộng sự, sử dụng Hup A liều 0,05 mg/kg làm giảm rõ rệt nồng độ MDA và hoạt động của Mn-SOD ở chuột lão hóa

43

giống đực sau 7 -14 ngày điều trị liên tiếp. Trong khi ở chuột đực trường thành không

có báo cáo về sự thay đổi của hai thông số này sau 7 – 14 ngày liên tục sử dụng Hup

A liều 0,05 mg/kg [53].

Những kết quả trên cho thấy cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa là đối tượng nghiên cứu có tiềm năng để phát triển sản phẩm hỗ trợ cải thiện trí nhớ

44

và điều trị bệnh sa sút trí nhớ.

Chương 5 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Kết luận

1. Đánh giá được tác dụng ức chế AChE và khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata

(Thunb.) Trevis.):

- Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa có tác dụng ức chế AChE in vitro

với IC50 = 7,928 (5,429-10,98) g/ml.

- Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa có khả năng dọn gốc tự do in vitro

với IC50 = 56,06 (37,56 – 90,55) g/ml.

2. Triển khai mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin nhằm đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa

(Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.) thông qua các thử nghiệm:

 Đánh giá thông qua thử nghiệm hành vi:

- Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ không gian ngắn hạn thông qua thử nghiệm mê lộ

chữ Y với tỷ lệ chuyển tiếp tăng có ý nghĩa thống kê lần lượt là 11,62% (p<0,05)

và 19,82% (p<0,01) so với nhóm chứng bệnh

- Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ không gian dài hạn và khả năng học tập thông qua

thử nghiệm mê lộ nước Morris:

+ Thời gian tìm thấy bến đỗ ở nhóm sử dụng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch

tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg thấp hơn so với nhóm chứng

bệnh với tỷ lệ giảm lần lượt là 12,05% (p<0,05) và 17,57% (p<0,01).

+ Thời gian bơi tại góc phần tư có bến đỗ ở nhóm sử dụng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg lâu hơn so

với nhóm chứng bệnh với tỷ lệ tăng lần lượt là 36,39% (p<0,05) và 48,82% (p<0,01).

 Đánh giá thông qua marker sinh học:

45

- Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg có khả năng ức chế AChE trong thể đồng nhất mô não chuột nhắt trắng với giá

trị hoạt độ AChE giảm tương ứng 45,89% (p<0,001) và 52,57% (p<0,001) so

với nhóm chứng bệnh.

- Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg có khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào ở chuột nhắt trắng

46

với tỷ lệ giảm tương ứng là 36,81% (p<0,01) và 43,17% (p<0,01).

Đề xuất

 Tiếp tục các nghiên cứu đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu

alcaloid từ Thạch tùng răng cưa trên các mô hình thực nghiệm khác.

 Phân lập và xác định chất hoặc nhóm chất có tác dụng cải thiện trí nhớ trong

47

cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

[1] Bộ Y tế (2010), Triệu chứng học thần kinh, tr. 157. [2] Nguyễn Thị Thu Hiền (2020), Triển khai mô hình gây sa sút trí nhớ bằng

scopolamin và áp dụng đánh giá tác dụng của cao chiết toàn phần từ cây Thạch

tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.), Khóa luận tốt nghiệp đại

học ngành dược học, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

[3] Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự (2013), "Nghiên cứu tác dụng cải thiện suy

giảm trí nhớ của các cao chiết cồn từ hai loài thạch tùng thuộc họ

Lycopodiaceae trên chuột nhắt trắng", Tạp chí y học TP.Hồ Chí Minh, Tập 17,

tr. 243-248.

[4] Nguyễn Ngọc Hòa và cộng sự (2009), "Nghiên cứu tỉ lệ mắc sa sút trí tuệ ở người cao tuổi tại huyện Ba Vì - Hà Tây cũ (2005 - 2006) ", Y học thực hành

(662) - số 5/2009.

[5] Nguyễn Quang Hiệu (2017), Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa

học của hai loài Huperzia, họ Thạch tùng (lycopodiaceae) thu hái ở Tam Đảo

(Vĩnh Phúc), Luận văn thạc sĩ dược học, Đại học Dược Hà Nội.

[6] Nguyễn Thị Kim Thu và cộng sự (2016), "Tác dụng ức chế enzym

acetylcholinesterase của các phân đoạn dịch chiết Thạch tùng răng cưa

(Huperza serrata)", Tạp chí Dược học, Số 11/2016, tr. 49-53.

[7] Nguyễn Thị Thu Hoài (2020), Nghiên cứu tác dụng theo hướng chống sa sút

trí nhớ của Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.) trên một

số mô hình thực nghiệm, Luận văn thạc sĩ dược học, Đại học Dược Hà Nội.

[8] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Tập 1, NXB Trẻ, tr 22-26.

[9] Phạm Thắng (2010), "Nghiên cứu dịch tễ về sa sút trí tuệ ở người cao tuổi tại

cộng đồng", Y học thực hành. 5, tr. 715

[10] Uỷ ban Dân số và gia đình trẻ em (2006), Dự báo dân số, gia đình và trẻ em

Việt Nam đến 2025, Hà Nội.

[11] Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới), Vol. II, Nhà xuất

bản Y học, tr. 565.

[12] Vũ Anh Nhị và cộng sự (2015), Nghiên cứu dịch tễ bệnh lý sa sút trí tuệ tại tp.hcm Hội nghị khoa học Y tế công cộng lần 2 của Hội Y tế công cộng

TPHCM, tr. 8.

[13] Vũ Thị Ngọc (2016), "Định tính và định lượng Huperzine A trong cây Thạch

tùng răng cưa (Huperzia serrata) ở Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng".

Tài liệu tiếng Anh

[14] Alam Md Nur et al. (2013), "Review on in vivo and in vitro methods evaluation

of antioxidant activity", Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), pp. 143-152.

[15] Alzheimer's Association (2019), "2019 Alzheimer's disease facts and figures",

Alzheimer's & Dementia. 15 (3), pp. 321-387.

[16] Balaban CD et al. (1988), "Trimethyltin-induced neuronal damage in the rat

brain: comparative studies using silver degeneration stains,

immunocytochemistry and immunoassay for neuronotypic and gliotypic

proteins", Neuroscience. 26 (1), pp. 337-361.

[17] Bartus Raymond T et al. (1982), "The cholinergic hypothesis of geriatric

memory dysfunction", Science. 217 (4558), pp. 408-414.

[18] BK et al. (2007), "Wound healing activity of Lycopodium serratum", Indian

Journal of Pharmaceutical Sciences. 69 (2), pp. 283.

[19] Broks P et al. (1988), "Modelling dementia: effects of scopolamine on memory

and attention", Neuropsychologia. 26 (5), pp. 685-700.

[20] Chen Ruey et al. (2017), "Treatment effects between monotherapy of donepezil

versus combination with memantine for Alzheimer disease: a meta-analysis",

PLoS One. 12 (8).

[21] Cheng Dong Hang et al. (1996), "Huperzine A, a novel promising

acetylcholinesterase inhibitor", Neuroreport. 8 (1), pp. 97-101.

[22] Davies Peter et al. (1976), "Selective loss of central cholinergic neurons in

Alzheimer's disease", The Lancet. 308 (8000), pp. 1403.

[23] Dellu F et al. (1992), "A two-trial memory task with automated recording:

study in young and aged rats", Brain research. 588 (1), pp. 132-139.

[24] Dong Xiao-xia et al. (2009), "Molecular mechanisms of excitotoxicity and their diseases", Acta of neurodegenerative pathogenesis relevance to

Pharmacologica Sinica. 30 (4), pp. 379-387.

[25] Ellman George L et al. (1961), "A new and rapid colorimetric determination of

acetylcholinesterase activity", Biochemical pharmacology. 7 (2), pp. 88-95.

[26] Gao Xin et al. (2009), "Huperzine A protects isolated rat brain mitochondria

against β-amyloid peptide", Free Radical Biology and Medicine. 46 (11), pp. 1454-1462.

[27] Gérard-Monnier Dominique et al. (1998), "Reactions of 1-methyl-2-

phenylindole with malondialdehyde and 4-hydroxyalkenals. Analytical applications to a colorimetric assay of lipid peroxidation", Chemical research

in toxicology. 11 (10), pp. 1176-1183.

[28] Gersner R et al. (2015), "Huperzine A prophylaxis against pentylenetetrazole-

induced seizures in rats is associated with increased cortical inhibition",

Epilepsy research. 117, pp. 97-103.

[29] HAGLER ALLEN N et al. (1981), "Rapid diazonium blue B test to detect

basidiomycetous yeasts", International Journal of Systematic and Evolutionary

Microbiology. 31 (2), pp. 204-208.

[30] Ham Young-Min et al. (2012), "Investigation of the component of Lycopodium

serratum extract that inhibits proliferation and mediates apoptosis of human HL-60 leukemia cells", Food and chemical toxicology. 50 (8), pp. 2629-2634.

[31] Hardy John et al. (2002), "The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease:

progress and problems on the road to therapeutics", science. 297 (5580), pp.

353-356.

[32] Hozumi Soichi et al. (2003), "Characteristics of changes in cholinergic function

and impairment of learning and memory-related behavior induced by olfactory

bulbectomy", Behavioural brain research. 138 (1), pp. 9-15.

[33] Ittner Lars M et al. (2011), "Amyloid-β and tau—a toxic pas de deux in

Alzheimer's disease", Nature Reviews Neuroscience. 12 (2), pp. 67-72.

[34] Izquierdo Alicia et al. (2006), "Brief uncontrollable stress causes dendritic

retraction in infralimbic cortex and resistance to fear extinction in mice",

Journal of Neuroscience. 26 (21), pp. 5733-5738.

[35] Jaswinder Kaur et al. (2016), "A systematic review on Huperzia serrata",

International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research. 8 (8),

pp. 1250-1255.

[36] Kraeuter Ann-Katrin et al. (2019), "The Y-maze for assessment of spatial

working and reference memory in mice", Pre-Clinical Models, Springer, pp. 105-111.

[37] Liu Jia-Sen et al. (1986), "The structures of huperzine A and B, two new alkaloids exhibiting marked anticholinesterase activity", Canadian Journal of Chemistry. 64 (4), pp. 837-839.

[38] Liu L et al. (2013), "Effect of huperzine A on neural lesion of acute

organophosphate poisoning in mice", Wei sheng yan jiu= Journal of hygiene research. 42 (3), pp. 419-423.

[39] Maridass M et al. (2009), "Investigation of phytochemical and antimicrobial

activity of Huperzia Species", Pharmacologyonline. 3, pp. 688-692.

[40] McShane Rupert et al. (2019), "Memantine for dementia", Cochrane database

of systematic reviews(3).

[41] Mimica Ninoslav et al. (2009), "Side effects of approved antidementives",

Psychiatria Danubina. 21 (1), pp. 108-113.

[42] Morales-Medina JC et al. (2013), "Impaired structural hippocampal plasticity

is associated with emotional and memory deficits in the olfactory

bulbectomized rat", Neuroscience. 236, pp. 233-243.

[43] More Sandeep Vasant et al. (2016), "Toxin-induced experimental models of

learning and memory impairment", International journal of molecular sciences.

17 (9), pp. 1447.

[44] Morris Richard GM (1981), "Spatial localization does not require the presence

of local cues", Learning and motivation. 12 (2), pp. 239-260.

[45] Ohba Takuya et al. (2015), "Japanese Huperzia serrata extract and the

constituent, huperzine A, ameliorate the scopolamine-induced cognitive

impairment in mice", Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 79 (11), pp.

1838-1844.

[46] Park Ju-Yeon et al. (2018), "Ethanol Extract of Lycopodium serratum Thunb.

Attenuates Lipopolysaccharide-Induced C6 Glioma Cells Migration via Matrix

Metalloproteinase-9 Expression", Chinese journal of integrative medicine. 24

(11), pp. 860-866.

[47] Patterson C (2018), World Alzheimer Report 2018: the state of the art of

dementia research: new frontiers, Alzheimer’s Disease International (ADI): London, UK.

[48] Peña-Bautista Carmen et al. (2019), "Free radicals in Alzheimer's disease:

Lipid peroxidation biomarkers", Clinica Chimica Acta.

[49] Prince Martin James et al. (2015), "World Alzheimer Report 2015: The Global Impact of Dementia: an Analysis of Prevalence", Incidence, Cost and Trends. 2017.

[50] Rafii MS et al. (2011), "A phase II trial of huperzine A in mild to moderate

Alzheimer disease", Neurology. 76 (16), pp. 1389-1394.

[51] Sah Saroj Kumar et al. (2017), "Effect of high-fat diet on cognitive impairment

in triple-transgenic mice model of Alzheimer's disease", Biochemical and biophysical research communications. 493 (1), pp. 731-736.

[52] Salkovic-Petrisic Melita et al. (2014), "Long-term oral galactose treatment

prevents cognitive deficits in male Wistar rats treated intracerebroventricularly

with streptozotocin", Neuropharmacology. 77, pp. 68-80.

[53] Shang Ya-Zhen et al. (1999), "Improving effects of huperzine A on abnormal

lipid peroxidation and superoxide dismutase in aged rats", Zhongguo yao li xue

bao= Acta pharmacologica Sinica. 20 (9), pp. 824-828.

[54] Singh Sandeep Kumar et al. (2018), "Evaluation of phenolic composition,

antioxidant, anti-inflammatory and anticancer activities of Polygonatum

verticillatum (L.)", Journal of integrative medicine. 16 (4), pp. 273-282. [55] Sodhi Rupinder K et al. (2014), "Animal models of dementia and cognitive

dysfunction", Life sciences. 109 (2), pp. 73-86.

[56] Sugimoto Hachiro et al. (2002), "Research and development of donepezil

hydrochloride, a new type of acetylcholinesterase inhibitor", The Japanese

journal of pharmacology. 89 (1), pp. 7-20.

[57] T O'Brien John et al. (2015), "Vascular dementia", The Lancet. 386 (10004),

pp. 1698-1706.

[58] Takao (2015), " Antioxidant activity and phenolic content of leaf infusions of

Myrtaceae species from Cerrado (Brazilian Savanna).", Brazilian Journal of

Biology, 75(4), 948-952.

[59] Takeda Toshio (2009), "Senescence-accelerated mouse (SAM) with special

references to neurodegeneration models, SAMP8 and SAMP10 mice",

Neurochemical research. 34 (4), pp. 639-659.

[60] Vorhees Charles V et al. (2006), "Morris water maze: procedures for assessing

spatial and related forms of learning and memory", Nature protocols. 1 (2), pp. 848.

[61] Wang Juan et al. (2010), "Huperzine a improves chronic inflammation and cognitive decline in rats with cerebral hypoperfusion", Journal of neuroscience research. 88 (4), pp. 807-815.

[62] Wang Zhi‐Fei et al. (2008), "Huperzine A exhibits anti‐inflammatory and

neuroprotective effects in a rat model of transient focal cerebral ischemia", Journal of neurochemistry. 106 (4), pp. 1594-1603.

[63] Wasowicz Wojciech et al. (1993), "Optimized steps in fluorometric

determination of thiobarbituric acid-reactive substances in serum: importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage", Clinical

chemistry. 39 (12), pp. 2522-2526.

[64] Watkins Paul B et al. (1994), "Hepatotoxic effects of tacrine administration in

patients with Alzheimer's disease", Jama. 271 (13), pp. 992-998.

[65] WM et al. (1986), "Patterns of memory failure after scopolamine treatment:

implications for cholinergic hypotheses of dementia", Behavioral and Neural

Biology. 45 (2), pp. 196-211.

[66] World Health Organization (1992), "The ICD-10 classification of mental and

behavioural disorders: clinical descriptions and diagnostic guidelines", Weekly

Epidemiological Record= Relevé épidémiologique hebdomadaire. 67 (30), pp. 227-227.

[67] Yamada Kaoru et al. (2011), "In vivo microdialysis reveals age-dependent

decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic

mice", Journal of Neuroscience. 31 (37), pp. 13110-13117.

[68] Liang et al. (2006), "Comparative studies of huperzine A, donepezil, and

rivastigmine on brain acetylcholine, dopamine, norepinephrine, and 5-

hydroxytryptamine levels in freely-moving rats", Acta Pharmacologica Sinica.

27 (9), pp. 1127-1136.

PHỤ LỤC