Khuếch đại đặc hiệu vùng gen ITS2 xác định sự có mặt của nấm ở bệnh nhân viêm dạ dày tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hải Dương

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:3

Thêm vào BST

Báo xấu

5
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Khuếch đại đặc hiệu vùng gen ITS2 xác định sự có mặt của nấm ở bệnh nhân viêm dạ dày tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hải Dương thiết lập phương pháp khuếch đại PCR đặc hiệu vùng gen ITS2 để xác định sự có mặt của nấm trong các mẫu bệnh phẩm dạ dày.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khuếch đại đặc hiệu vùng gen ITS2 xác định sự có mặt của nấm ở bệnh nhân viêm dạ dày tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hải Dương

94 Lê Thị Phượng KHUẾCH ĐẠI ĐẶC HIỆU VÙNG GEN ITS2 XÁC ĐỊNH SỰ CÓ MẶT CỦA NẤM Ở BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TỈNH HẢI DƯƠNG SPECIFIC AMPLIFICATION OF THE ITS2 REGION FOR FUNGAL DETECTION IN GASTRIC PATIENTS AT HAI DUONG PROVINCIAL GENERAL HOSPITAL Lê Thị Phượng Trường Đại học Hải Dương; Phuongsinh@ymail.com Tóm tắt - 180 bệnh nhân viêm dạ dày đến khám và điều trị tự Abstract - 180 gastric patients who met the standards of the study, nguyện tại bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương đáp ứng các tiêu voluntarily came to Hai Duong Provincial General Hospital for chuẩn của nghiên cứu. Các bệnh nhân này được thu thập thông examination and treatment. Information about patients such as age, tin như: tuổi, giới tính, nơi ở, công việc, số lần điều trị, đau thượng gender, residence, occupation, numbers of treatment, epigastric pain, vị, đầy bụng, khó tiêu, chán ăn sụt cân... và được sinh thiết mẫu bloating, indigestion, poor appetite and weight loss... was collected These tại các vị trí hang vị, thân vị và rìa các ổ loét hoặc các tổ chức thâm patients were taken for endoscopy to have endoscopic biopsy samples nhiễm nghi ung thư dạ dày. Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu at the antrum, body and edge of the gastric ulcer, organizations bệnh phẩm, khếch đại đặc hiệu vùng gen ITS2 và phân tích trình suspected of infiltrating stomach cancer. DNA was extracted from tự gen, đồng thời nuôi cấy sinh thiết trên môi trường máu để xác samples, specific amplification of the ITS2 region and gene sequence định sự có mặt của các loại nấm trong dạ dày người bệnh. Kết quả analysis. Simultaneously, blood and biopsy cultures were used to detect cho thấy, tỷ lệ nhiễm nấm là 70/180, chiếm 38,9%. the presence of fungi in patients’ stomach. The results have showed that fungal infection rate account for 38.9% (70/180). Từ khóa - bội nhiễm nấm; gen ITS2; khuếch đại; nuôi cấy; viêm Key words - fungal super-infection; ITS2 gen; amplification; dạ dày. culture; gastritis 1. Đặt vấn đề 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Trong những năm gần đây, công tác điều trị các bệnh 2.1. Đối tượng dạ dày kèm nhiễm Helicobacter pylori (H.pylori) ở Việt 180 bệnh nhân viêm dạ dày khám, điều trị tự nguyện tại Nam có tiến bộ nhờ sử dụng kết hợp các loại kháng sinh và Bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương và đáp ứng các tiêu chất giảm tiết axit. Tuy vậy ở thời điểm hiện tại, tỷ lệ chữa chuẩn: i). Tuổi từ 18- 80; ii). Bị viêm dạ dày mạn tính, loét khỏi các bệnh thấp, bệnh nhân phải điều trị nhiều lần với hoặc ung thư dạ dày; iii). Không dùng kháng sinh trong các phác đồ điều trị khác nhau, rất tốn kém về tiền bạc và thời gian 01 tháng cho tới khi nội soi. mất nhiều thời gian điều trị do Helicobacter pylori đã trở nên kháng thuốc kèm hiện tượng bội nhiễm các loại vi sinh 2.2. Phương pháp vật khác như nấm và các vi khuẩn non-H.pylori. Lấy mẫu và bảo quản mẫu Nhiễm vi sinh vật dạ dày tạo các nguy cơ cho sức khỏe Mẫu bệnh phẩm được lấy dưới sự tự nguyện của người con người, rõ nhất là ung thư dạ dày, còn nhiễm trùng xâm bệnh và gia đình bệnh nhân. Trước khi lấy mẫu các bác sĩ lấn của nấm dẫn tới nhiễm nấm máu, gây tử vong và tàn có giải thích cho bệnh nhân và gia đình bệnh nhân vì sao phế. Trong y văn thế giới, hiện tượng đã được dự đoán cần thiết phải tiến hành thí nghiệm này. Các kết quả nghiên nhiều năm về trước bởi Zboril V và Corea và được gọi là cứu khi công bố sẽ không ghi rõ họ tên của người bệnh và sự phát triển vượt trội của các vi sinh vật dạ dày, bao gồm gia đình bệnh nhân. Bệnh nhân tự nguyện tham gia làm các C. albicans, C. tropical C. parapsilosis, C. glabrata và xét nghiệm và có thể rút khỏi chương trình nghiên cứu bất C. krusei [7]. cứ lúc nào khi cần thiết. Ở Việt Nam, hiện tượng nhiễm vi sinh vật dạ dày đã 180 bệnh nhân được tiến hành phỏng vấn về các yếu tố được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 2000. Nấm dịch tễ, sau đó được nội soi, chụp ảnh và xác định các thể Candida được tìm thấy dưới đáy ổ loét dạ dày của bệnh bệnh viêm mạn, loét, ung thư dạ dày. Vị trí sinh thiết của nhân Việt nam bởi Tạ Long và Trịnh Tiến Dũng [5]. Các dạ dày gồm hang vị, thân vị, rìa các ổ loét, các tổ chức thâm nghiên cứu hợp tác với các nhà khoa học Trường Đại học nhiễm nghi ung thư. Mỗi bệnh nhân lấy 2 mảnh niêm mạc Tổng hợp New York xác nhận sự có mặt của nhiều vi dạ dày: 1 mảnh tại hang vị và 1 mảnh ở thân vị. Mảnh sinh khuẩn non-H.pylori trong dạ dày người bệnh gây chảy thiết cần phải có kích thước 2 - 3 mm, là mô sống, không máu dạ dày [8]. ITS2 được coi như một chỉ thị phân tử để phải là tổ chức hoại tử, không dính máu và không dính mật. xác định tình trạng nhiễm nấm trong dạ dày người bệnh Thủ thuật nội soi được thực hiện bởi các bác sĩ Khoa Thăm [3]. Hiện nay, ở tất cả các đơn vị Bệnh viện đa khoa tuyến dò chức năng Bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương. tỉnh cũng như tuyến huyện tại Hải Dương, các nghiên cứu Mẫu sinh thiết được lưu trữ trong bình nitơ lỏng, sau đó về bội nhiễm nấm dựa trên công nghệ gen vẫn chưa được bảo quản ở -700 C cho tới khi tách chiết DNA. tiến hành. Nghiên cứu này nhằm mục đích: Thiết lập phương pháp khuếch đại PCR đặc hiệu vùng gen ITS2 để Tách chiết DNA từ bệnh phẩm xác định sự có mặt của nấm trong các mẫu bệnh phẩm 180 mẫu bệnh phẩm được tách chiết DNA qua các dạ dày. bước: phân hủy bằng Proteinase K; loại protein và mỡ bằng
ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 11(108).2016, Quyển 1 95 Phenol/chloroform/isoamylalcohol; tủa DNA bằng cồn tinh sạch cao, ít bị đứt gãy và có thể sử dụng cho các thí nồng độ cao hoặc isopropanol. nghiệm tiếp theo. Mẫu DNA được đánh giá chất lượng và hàm lượng tách chiết bằng điện di trên gel agarose, nhuộm EtBr, quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại; độ tinh sạch được đánh giá bằng đo phổ hấp thụ bước sóng 260/280 nm. DNA được hòa trong 100-200µl 1x TE. Nồng độ và độ tinh sạch của chế phẩm DNA được kiểm tra trên thiết bị đo quang phổ ở hai bước sóng 260nm và 280nm hoặc trên máy NanoDrop1000, Thermo Scientific. Phản ứng PCR khuếch đại gen ITS2 xác định mức độ Hình 1. Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số được tách chiết từ nhiễm nấm mẫu bệnh phẩm. Giếng 1-16: Các mẫu được tách chiết DNA; 1-10 ng ADN được sử dụng để khuếch đại vùng ITS2 Giếng 17: Thang DNA chuẩn 1 kb có kích thước khoảng 350bp bằng phương pháp PCR trong 3.2. Phân tích trình tự gen ITS2 phát hiện nấm trong các thể tích phản ứng 20µl với cặp mồi: mẫu nghiên cứu ITS3 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’; Sau hàng loạt thử nghiệm tối ưu hoá bằng cách thay đổi ITS4 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’. nhiệt độ gắn mồi (Ta) của mồi với DNA khuôn mẫu, nhiệt độ gắn mồi tối ưu của phản ứng PCR khuếch đại đặc hiệu Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 2,5 µl DNA đoạn gen ITS2 được chọn là 58oC. khuôn; 2,5 µl cặp mồi (ITS3-ITS4); 2,5 µl dNTP; 2,5 µl đệm PCR10x; 1,0 µl DNA polymerase (1 U/µl); 9,0 µl Hệ vi sinh vật dạ dày người (động vật) và các hệ lụy do nước cất PCR. chúng gây nên đối với con người phức tạp hơn chúng ta vẫn hình dung. Theo Zboril, thông thường các loại vi sinh Các thành phần phản ứng PCR được trộn nhẹ nhàng vật kị khí không có trong dạ dày người khỏe mạnh [7]. Năm trong ống Eppendorf và thực hiện phản ứng với chu trình 2001, giáo sư người Nga Bondarenko đã nuôi cấy vi khuẩn nhiệt như sau: 5 phút hot-start; 35 chu kỳ của (94°C 60 ở điều kiện kỵ khí từ sinh thiết dạ dày và đã nhận diện được giây, 58°C 45 giây, 72°C 60 giây); 72°C trong 5 phút; hạ các loài vi sinh vật thuộc 32 chi như Helicobacter pylori, nhiệt độ phản ứng PCR xuống 14°C đến khi lấy mẫu. nấm Candida, Bacteroides, Streptococcus, Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 5µl sản phẩm PCR trộn Staphylococcus, Corynebacterium [2]. Ngoài việc nhiễm với 1µl đệm tra mẫu (loading buffer), hỗn hợp này được các loại vi khuẩn, việc nhiễm nấm trong các bệnh viêm dạ nhỏ vào các giếng trên gel. Tiến hành điện di các mẫu DNA dày cũng là 1 vấn đề được quan tâm, do nó ảnh hưởng đến cùng với mẫu đối chứng dương và thang DNA chuẩn để kết quả điều trị [4]. Các loại nấm nhiễm đã được tìm thấy ước lượng kích thước phân tử DNA. Các băng DNA sẽ hiện trong các bệnh nhân viêm dạ dày có thể là: Ascomycete sp., hình dưới dạng những vệt sáng trên bản gel điện di. So Engyodontium album,…[1]. Tình trạng nhiễm các loại nấm sánh kích thước ước đoán của mẫu nghiên cứu với mẫu được phát hiện bằng phương pháp PCR khuếch đại đoạn chứng dương và marker phân tử để xác định sự có mặt của gen ITS2 kích thước khoảng 350 bp, kết hợp đọc và phân gen ITS2. tích trình tự gen (Hình 2). Đọc trình tự đoạn ITS2 Sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen ITS2 đặc hiệu sẽ được làm sạch bằng QIAquick PCR purification Kit (Qiagen, USA) và gửi đọc trình tự gen trực tiếp từ sản phẩm PCR bằng máy đọc giải trình tự ABI 3730XL (Macrogen, Korea). Kết quả đọc trình tự được xử lý, căn chỉnh và so sánh với các trình tự gen đã có trong ngân hàng gen bằng phần mềm BioEdit 7.1.3; trình tự gen thu được được dóng hàng cột bằng ứng dụng BLAST trong ngân hàng dữ liệu NCBI. Hình 2. Kết quả khuyếch đại vùng ITS2 của nấm từ DNA 3. Kết quả và thảo luận sinh thiết dạ dày 3.1. Tách chiết và xác định nồng độ DNA bệnh phẩm M: Marker DNA chuẩn 100 bp (Invitrogen); Giếng 1-9: Mẫu nghiên cứu; Giếng CA: Đối chứng âm; Tách chiết DNA từ 180 mẫu mô bệnh phẩm của bệnh Giếng CD: Đối chứng dương nhân viêm dạ dày tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương. Kết quả ở Hình 2 cho thấy, giếng 3,4 không xuất hiện Sau khi tách chiết, tiến hành kiểm tra nồng độ và độ tinh băng DNA và giống như giếng CA - mẫu chứng âm. Còn sạch DNA bằng phương pháp đo mật độ quang và điện di các giếng 1,2,3,5,6,7,8,9 là mẫu nghiên cứu, xuất hiện một trên gel agarose 1,5%. Kết quả được thể hiện ở Hình 1. băng DNA trên bản gel điện di, vị trí băng này trùng với vị DNA được tách chiết theo quy trình phenol/chloroform trí băng DNA của mẫu chứng dương (CD - mang đoạn để phân tích trình tự gen 16S rRNA. Hình ảnh điện di cho ITS2). So sánh với marker phân tử 100 bp thì băng DNA thấy các băng ở các giếng đều gọn, đẹp và có kích thước mẫu xét nghiệm có kích thước ước đoán khoảng 350 bp. phân tử lớn hơn 10 kb chứng tỏ DNA đã tách chiết có độ Chứng tỏ các mẫu nghiên cứu mang trình tự ITS2.
96 Lê Thị Phượng Để khẳng định chắc chắn các mẫu xét nghiệm nhiễm gây chảy máu dạ dày và 1 loại nấm chưa định tên (This nấm, chúng tôi tiến hành đọc trình tự gen vùng ITS2, đối fungus, rarely seen as a human pathogen dealing with chiếu trên Genbank, đồng thời nuôi cấy sinh thiết trên môi gastric bleeding - nấm này hiếm khi thấy, nhưng được coi trường thạch máu. Kết quả cho thấy, các nấm gây chảy máu là một tác nhân gây chảy máu dạ dày người). dạ dày Trachypithecus cristatus, Engyodontium album, Theo kết quả phân tích PCR, trong số 180 mẫu bệnh Ascomycete sp, BMP2899 (chưa định tên) đã được tìm thấy nhân viêm dạ dày, có 70 mẫu dương tính với cặp mồi ITS2, trong mẫu bệnh phẩm của một số bệnh nhân. Một số loài tương ứng với tỷ lệ nhiễm nấm là 38,9%. Kết quả này nấm khác Macaca arctoides, Ascomycete, Trachypithecus tương tự như kết quả nghiên cứu của Mallory (2015) sử obscurus, Engyodontium cũng được tìm thấy ở sinh thiết dụng phương pháp phân tích trình tự gen ITS2 cho thấy sự dạ dày các bệnh nhân, nhưng vai trò gây bệnh của chúng có mặt của hàng loạt các loại nấm Alternaria, Aspergillus, vẫn chưa được biết rõ. Kết quả tại Hình 3 cho thấy hình Cladosporium, Fusarium và Penicillium [6]. ảnh bội nhiễm các loại nấm. 4. Kết luận Qua nghiên cứu 180 mẫu DNA từ bệnh nhân viêm dạ dày đến khám và điều trị tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương, khuếch đại đặc hiệu vùng gen ITS2 xác định sự có mặt của nấm, đồng thời nuôi cấy sinh thiết trên môi trường thạch máu, kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm nấm là khá cao Hình 3. Bội nhiễm nấm khi nuôi cấy sinh thiết trên 70/180 (chiếm 38,9%). Trong số các loại nấm được tìm môi trường thạch máu thấy, nấm Macaca arctoides và Trachypithecus obscurus Sản phẩm PCR vùng gen ITS2 được làm sạch và được chiếm tỷ lệ cao hơn các loại nấm khác. phân tích trình tự. Kết quả được thể hiện tại Hình 4. Một số kết quả trình tự gen ITS2 của các bệnh nhân: TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Alga Zuccaro, Conrad L. Schoch, Joseph W. Spatafora, Jan Kohlmeyer, Siegfried Draeger,and Julian I. Mitchell, 2008. Detection and Identification of Fungi Intimately Associated with the Brown Seaweed Fucus serratus. Appl Environ Microbiol. 74(4): 931–941. [2] Bondarenko VM, 2001. Bacterial pathogenicity islands. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. (4):67-74. [3] Consuelo Ferrer, Francisca Colom, Susana Frasés, Emilia Mulet, José L.Abad, and Jorge L. Alió, 2001. Detection and Identification of Fungal Pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8S Ribosomal DNA Typing in Ocular Infections. J Clin Microbiol; 39(8): 2873–2879. [4] Nguyen Thi Hong Hanh, Nguyen Van Thinh, Nguyen Thi Nguyet, Ta Long, Nguyen Quoc Khang, Tran Van Hop, 2008. Fungi – status and gastritis in Viet Nam. 7th congress on gastroenterology of Shouth East Asian nations joint 14th VNGE Annual Scientific Meeting, pp. 742 – 748. [5] Tạ Long, Nguyễn Văn Thịnh, Trịnh Tiến Dũng và cs, 2007, ”Phát hiện nấm Candida parapsilosis trong mảnh sinh thiết dạ dày bệnh nhân viêm dạ dày mạn tính“, Tạp chí Khoa học tiêu hóa Việt Nam, II(6), pp 355 – 361. [6] Mallory J. Suhr, 2015. Characterization and investigation of Fungi inhabiting the gastrointestinal tract of healthy and diseased humans. University of Nebraska - Lincoln Dissertations & Theses in Food Science and Technology Food Science and Technology Department. Hình 4. Trình tự gen đoạn ITS2 ở một số mẫu nghiên cứu [7] Prucek R., Tuček J, Kilianová M, Panáček A, Kvítek L, Filip J, Kolář M, Tománková K, Zbořil R., 2011. The targeted Trong số các loại nấm được tìm thấy, có 6 loại nấm đã antibacterial and antifungal properties of magnetic nanocomposite định tên là: 1. Nấm Macaca arctoides; 2. Nấm of iron oxide and silver nanoparticles, Biomaterials Jul;32(21): Engyodontium album, loài gây bệnh cho người, gây chảy 4704-13. máu dạ dày; 3. Nấm Ascomycete sp, loài gây bệnh cho [8] Nguyễn Văn Thịnh, Tạ Long, Trần Văn Hợp, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2009, „Nghiên cứu mật độ Helicobacter pylori và tổn thương người; 4. Nấm Trachypithecus obscurus; 5. Nấm mô bệnh học trong viêm dạ dày mạn“, Báo cáo tại Hội nghị nghiên Ascomycete sp; 6. Nấm Trachypithecus cristatus hiếm gặp, cứu khoa học lần thứ III - Hội khoa học Tiêu hóa Hà Nội. (BBT nhận bài: 19/8/2016, phản biện xong: 03/10/2016)