KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 6

Chia sẻ: Nguyen Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:29

Thêm vào BST

Báo xấu

122
lượt xem 24
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR 1. Primer (mồi) Mồi phải thỏa một số điều kiện cơ bản : (1) dài khoảng 18-24 base, (2) Tm của 2 primer gần nhau, (3) [G:G] 40-60%, (4) không hình thành primer dimer, (5) không phải là trình tự lặp lại. 2. DNA bản mẫu (template) Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, ..), heparin, ..) 3. Nồng độ MgCl2 Cần cho hoạt động của Taq polymerase ; hàm lượng...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 6

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
CAÙC THAØNH PHAÀN CUÛA PHAÛN ÖÙNG PCR 1. Primer (moài) Moài phaûi thoûa moät soá ñieàu kieän cô baûn : (1) daøi khoaûng 18-24 base, (2) Tm cuûa 2 primer gaàn nhau, (3) [G:G] 40-60%, (4) khoâng hình thaønh primer dimer, (5) khoâng phaûi laø trình töï laëp laïi. 2. DNA baûn maãu (template) Haøm löôïng ñuû nhöng khoâng quaù cao, tinh saïch – khoâng chöùa caùc chaát öùc cheá phaûn öùng (SDS, chaát öùc cheá töø maãu (hemoglobin, saéc toá, ..), heparin, ..) 3. Noàng ñoä MgCl2 Caàn cho hoaït ñoäng cuûa Taq polymerase ; haøm löôïng quaù cao seõ taïo nhieàu saûn phaåm kyù sinh, quaù thaáp thì laøm giaûm hieäu quaû nhaân baûn cuûa enzyme 4. dNTP Thaønh phaàn 4 loaïi dNTP phaûi caân baèng ; haøm löôïng thöôøng khoâng ñoåi nhöng coù theå thay ñoåi tuøy ñieàu kieän thöïc teá
CAÙC THAØNH PHAÀN CUÛA PHAÛN ÖÙNG PCR (tieáp) 5. Enzyme Ñöôïc choïn tuøy muïc ñích söû duïng : Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) : thoâng duïng nhaát, hoaït tính polymerase khaù maïnh (35-100 nu/giaây), coù hoaït tính 5’3’ exonuclease Stoffel DNA polymerase : tính chòu nhieät cao hôn, khoâng coù hoaït tính 5’-3’ exonuclease, hoaït ñoäng ñöôïc ôû phoå MgCl2 roäng multiplex PCR Taq vaø Stoffel DNA polymerase theâm 1 3’dA vaøo saûn phaåm PCR Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis) : tính chòu nhieät raát cao, nhaân baûn ñöôïc nhöõng ñoïan DNA raát daøi, coù hoaït tính 3’-5’ exonuclease tính trung thöïc cao hôn Taq pol 5-15 laàn, taïo saûn phaåm “ñaàu baèng” Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus) : coù caû 2 hoaït tính 5’-3’ vaø 3’-5’ exonuclease, tính trung thöïc cao hôn Taq pol 12 laàn, thöôøng duøng trong cycle sequencing Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus) : vöøa coù chöùc naêng polymerase vöøa coù chöùc naêng phieân maõ ngöôïc (RT) duøng trong phaûn öng RT-PCR UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima) : tính chòu nhieät raát cao, coù hoaït tính 3’-5’ exonuclease tính trung thöïc raát cao
CAÙC THAØNH PHAÀN CUÛA PHAÛN ÖÙNG PCR (tieáp) 5. Chöông trình PCR : Nhieät ñoä : bieán tính – 94-95 C ; lai < Tm cuûa caùc primer ~ 5 C ; keùo daøi - 72 C Thôøi gian cuûa töøng chu kyø tuøy thuoäc thieát bò vaø kích thöôùc saûn phaåm Soá löôïng chu kyø thöôøng 40 Ví duï : 1 chu kyø - 95 C – 5‘ 35 chu kyø – 94 C – 30” 55 C – 30” 72 C – 45” 1 chu kyø – 72 C – 10’ 6. Thieát bò : Nhöõng caûi tieán maùy luaân nhieät lieân quan ñeán (1) microtiter plate 96 gieáng, (2) caùc block nhieät rieâng bieät trong 1 maùy, (3) block duøng cho lam kính ñeå tieán haønh in situ PCR. 7. Duïng cuï : OÁng Eppendorf “thaønh moûng” (thin-wall), ñaàu tip coù phin loïc
NHÖÕNG HAÏN CHEÁ CUÛA KYÕ THUAÄT PCR – CAÙCH KHAÉÊC PHUÏC 1. Ngoaïi nhieãm cao do khaû naêng nhaân baûn DNA maïnh Phaân chia khu vöïc thí nghieäm, söû duïng ñaàu tip coù phin loïc, gaêng tay thay thöôøng xuyeân, chieáu tia UV khu vöïc thí nghieäm, söû duïng heä thoáng dUTP-ung, 2. Sai soùt cuûa DNA polymerase trong quaù trình toång hôïp Laëp laïi phaûn öùng PCR neáu caàn thieát, söû duïng loaïi polymerase coù tính trung thöïc cao nhö Pfu, DeepVent, UlTma polymerase. 3. Keát quaû phuï thuoäc raát lôùn vaøo toaøn boä thao taùc Kyõ thuaät vieân caàn ñöôïc ñaøo taïo toát, töï ñoäng hoùa, söû duïng hoùa chaát pha saún (kit) ñaõ ñöôïc chuaån hoùa 4. Thieát bò ñaét tieàn
MOÄT SOÁ PHÖÔNG PHAÙP PCR 1. PCR : söû duïng 1 caëp moài ; saûn phaåm PCR ñöôïc phaùt hieän baèng ñieän di 2. Nested / Semi-nested PCR : söû duïng 1 caëp moài “ngoaøi” vaø 1 moài/1 caëp moài “trong” ñeå taêng tính ñaëc hieäu vaø ñoä nhaïy cuûa phaûn öùng PCR 3. Multiplex PCR : söû duïng nhieàu hôn 1 caëp moài trong 1 phaûn öùng PCR ñeå phaùt hieän ñoàng thôøi nhieàu trình töï DNA cuûa 1 taùc nhaân (A) hay nhieàu taùc nhaân (B) (A) (B)
MOÄT SOÁ PHÖÔNG PHAÙP PCR (tieáp) 4. AP-PCR (Arbitrary Primed)/RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) : söû duïng toå hôïp caùc primer “ngaãu nhieân” ñeå xaùc dònh “daáu aán di truyeàn” cuûa loaøi (1) (2) 5. RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) : nhaân baûn hai ñaàu muùt 5’ vaø 3’ cuûa 1 trình töï exon vôùi 1 moài ñaëc hieäu vaø 1 moài “chung” TTTTTTT AAAAA AAAAAAAA TTTTTT 6. In situ PCR : thöïc hieän phaûn öùng PCR ngay treân moâ/teá baøo 7. PCR ñònh löôïng : ñònh löôïng saûn phaåm PCR theo thôøi gian thöïc döïa treân maãu doø phaùt huøynh quang
RT-PCR Goàm 2 böôùc : 1. RT (Phieân maõ ngöôïc) : taïo cDNA 2. PCR : nhaân baûn cDNA Duøng ñeå nhaân baûn RNA
REAL-TIME PCR Duøng ñònh löôïng DNA hoaëc RNA (real-time RT-PCR) Ñònh löôïng döïa treân soá tín hieäu huyønh quang/phaûn öùng maø maùy ñoïc ñöôïc Taùc nhaân ñaùnh daáu thuoäc hai nhoùm : Chaát phaùt huyønh quang lieân keát vôùi DNA maïch ñoâi (SYBR Green, Ethidium bromide) seõ phaùt huyønh quang Chaát phaùt huøynh quang duøng ñaùnh daáu maãu doø ñaëc hieäu TaqMan probe
KEÁT QUAÛ PCR REAL-TIME A C Ct (Cycle threshold - chu kyø ngöôõng) : chu kyø PCR ôû ñoù tín hieäu ñaëc hieäu vöôït khoûi tín hieäu neàn B Ghi chuù : ñöôøng maøu ñoû laø t1n hieäu neàn Döïng ñöôøng chuaån (standard curve) vôùi moät chaát chuaån coù noàng ñoä ñaõ bieát. 101 baûn sao 101 baûn sao Haøm löôïng cuûa thaønh phaàn caàn phaùt hieän ñöôïc tính döïa treân ñöôøng chuaån naøy
TAÏO DOØNG SAÛN PHAÅM PCR Taq polymerase thöôøng theâm 1A vaøo ñaàu 3’ söû duïng T-vector ñeå taïo doøng saûn phaåm PCR Coøn goïi laø T-A cloning
PCR “NGÖÔÏC“ Duøng nhaân baûn vuøng naèm hai beân moät vuøng ñaõ bieát trình töï
PCR „“TAÙI TOÅ HÔÏP“ Duøng ñeå noái nhieàu trình töï ngaén thaønh moät trình töï daøi, Ví duï : noái promoter cuûa gene A vôùi vuøng maõ hoùa cuûa gene B
GIAÛI TRÌNH TÖÏ NUCLEOTIDE (SEQUENCING) PHÖÔNG PHAÙP MAXAM-GILBERT PHÖÔNG PHAÙP SANGER (HOÙA HOÏC) (ENZYME HOÏC) (DIDEOXY SEQUENCING METHOD) Nguyeân lyù : döïa treân söï phaân caét hoùa hoïc DNA Nguyeân lyù : döïa treân söï toång hôïp DNA keát hôïp vôùi töøng loaïi Caùc böôùc chính : dideoxynucleotide 1. Thu nhaän trình töï DNA caàn giaûi Caùc böôùc chính : 2. Bieán ñoåi hoùa hoïc ñaëc hieäu caùc 1. Thu nhaän trình töï DNA caàn giaûi base 2. Nhaân baûn trình töï naøy vôùi 3. Loaïi boû caùc base bieán ñoåi dNTP vaø töøng loaïi ddNTP 4. Caét maïch DNA ôû vò trí bò loaïi boû base Ñieän di phaân taùch caùc trình töï DNA taïo thaønh cuûa hai phaûn öùng Ñoïc keát quaû : töï ñoäng hoaëc qua phoùng xaï töï ghi
PHÖÔNG PHAÙP GIAÛI TRÌNH TÖÏ MAXAM-GILBERT Caùc phaûn öùng giaûi trình töï : C : Hydrazine trong NaCl caét base C G : G ñöôïc methyl hoùa baèng dimethylsulfate sau ñoù bò caét baèng kieàm G + A : Formic acid caét lieân keát giöõa base vaø ñöôøng T + C : Hydrazine caét voøng pyrimidine Böôùc cuoái : Piperidine caét caùc base bieán ñoåi
KEÁT QUAÛ GIAÛI TRÌNH TÖÏ HOÙA HOÏC Keát quaû cuûa kyõ thuaät phoùng xaï töï ghi (autoradiography)
PHÖÔNG PHAÙP GIAÛI TRÌNH TÖÏ SANGER
GIAÛI TRÌNH TÖÏ TÖÏ ÑOÄNG
MOÄT SOÁ BIEÄN PHAÙP GAÂY ÑOÄT BIEÁN ÑIEÅM ÑÒNH HÖÔÙNG
The Single-Priming Method