Lựa chọn phương pháp phân lập thích hợp cho tảo Microcystis aeruginosa

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 1/2017<br /> <br /> THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC<br /> <br /> LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP THÍCH HỢP CHO TẢO<br /> Microcystis aeruginosa<br /> SELECTION OF SUITABLE ISOLATION METHOD FOR THE MICROALGAE<br /> Microcystis aeruginosa<br /> Nguyễn Thị Thúy1, Lê Minh Hoàng1, Trương Thị Bích Hồng1<br /> Ngày nhận bài: 14/6/2016; Ngày phản biện thông qua: 11/10/2016; Ngày duyệt đăng: 10/3/2017<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm để xác định phương pháp phân lập thích hợp cho tảo Microcystis<br /> aeruginosa. Thí nghiệm được thực hiện với 2 phương pháp phân lập khác nhau: phương pháp pha loãng và<br /> nuôi cấy trên môi trường agar với thành phần dinh dưỡng B12, cường độ ánh sáng 2.000 lux, nhiệt độ 25 ºC,<br /> chu kỳ quang 12 sáng:12 tối. Kết quả cho thấy, sau 16 ngày thí nghiệm, tảo Microcystis aeruginosa đạt thuần<br /> chủng 100 % ở phương pháp pha loãng với tỉ lệ pha loãng 10-5, thậm chí, ở tỉ lệ pha loãng 10-4, độ thuần chủng<br /> cũng đạt 99 %. Trong khi đó, tảo Microcystis aeruginosa phân lập trong môi trường agar đạt độ thuần chủng<br /> 100 % sau khi tiến hành phân lập lại nhiều lần. Thời gian tiến hành phân lập trên môi trường agar cũng lâu<br /> hơn so với phương pháp pha loãng. Như vậy, phương pháp pha loãng được xem là phù hợp hơn để phân lập<br /> Microcystis aeruginosa trong nghiên cứu này.<br /> Từ khóa: agar, Microcystis aeruginosa, B12, phương pháp phân lập<br /> ABSTRACT<br /> The objectives of the study were to determine the suitable isolation method for Microcystis aeruginosa.<br /> Experiments were performed in two different isolation methods: diluted method and culturing algae on the<br /> agar medium, with culture condition of nutrient medium B12, light intensity of 2,000 lux, temperature of 25oC,<br /> light cycle of (12 light: 12 dark). After 16 days, the results showed that the best purification of Microcystis<br /> aeruginosa was in the diluted method which reached at 100% and 99% at the dilution ratio of 10-5 and 10-4.<br /> After re-isolating many times, the purification level of Microcystis aeruginosa was still at 100%. Moreover, the<br /> time needed to isolate was also longer than that of diluted method. In conclusion, it can be suggested that the<br /> best isolation method for Microcystis aeruginosa was diluted method applied in this study.<br /> Keywords: agar, Microcystis aeruginosa, B12, isolated method<br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Trong số các loài vi khuẩn lam gây nở hoa<br /> nước hồ, ao thì loài Microcystis aeruginosa<br /> là loài bắt gặp thường xuyên nhất. Loài<br /> M. aeruginosa chứa độc tố thuộc nhóm<br /> hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ các peptid<br /> mạch vòng có tên gọi là microcystin(MC) [5], [13].<br /> <br /> 1<br /> <br /> Viện Nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang<br /> <br /> 76 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Độc tố cũng gây ảnh hưởng xấu lên hai loại<br /> protein serine và threonin phosphatases [7],<br /> [8], [9].<br /> Với đặc điểm là tập đoàn bao gồm hàng<br /> nghìn tế bào riêng lẻ cỡ từ 2- 7 µm và mỗi tế bào<br /> đều chứa một không bào khí. Chính sự tập hợp<br /> của hàng nghìn không bào khí định vị trong vô số<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> các tế bào này giúp chúng nổi trên mặt nước và<br /> thu nhận được nguồn ánh sáng mặt trời, thông<br /> qua quá trình quang hợp tổng hợp sắc tố diệp lục<br /> tạo nên váng xanh trên mặt nước [10] .<br /> Trên thế giới cũng như ở nước ta đã có<br /> một số phương pháp phân lập giống tảo<br /> thuần chủng (Hilary Belcher and Erica Swale<br /> (1982) [11] , Nguyễn Thị Hương, 2001 [3], Các<br /> phương pháp pha loãng, nuôi cấy trên môi<br /> trường thạch, nhặt tế bào bằng micropipet,…<br /> hiện đang được sử dụng phổ biến để phân lập<br /> các loài tảo. Tuy nhiên, mỗi loài tảo phù hợp<br /> với các phương pháp khác nhau. Theo Hoàng<br /> Thị Bích Mai [1] phương pháp pha loãng phù<br /> hợp để phân lập Nitzschia longissima nhưng<br /> loài tảo Chlorella sp lại phát triển tốt nhất trên<br /> môi trường thạch agar.<br /> Cho đến nay, chưa có một công trình<br /> nào nghiên cứu đầy đủ về phân lập loài tảo<br /> M. aeruginosa. các nhà khoa học mới chỉ phân<br /> lập bằng phương pháp nuôi cấy trên thạch agar<br /> [12]. Các phương pháp khác như nhặt tế bào,<br /> phương pháp pha loãng chưa được nói đến.<br /> Do đó, để lựa chọn được phương pháp phân<br /> lập phù hợp cho loài tảo M. aeruginosa thì việc<br /> nghiên cứu phương pháp phân lập thích hợp cho<br /> tảo M. aeruginosa được chúng tôi thực hiện.<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu<br /> 1.1. Đối tượng nghiên cứu<br /> Ngành Cyanobaeteria<br /> Lớp<br /> Cyanophyceae<br /> Bộ<br /> Chroococcales<br /> Họ<br /> Microcystaceae<br /> Chi<br /> Microcystis<br /> Loài<br /> Microcystis aeruginosa<br /> 1.2. Địa điểm nghiên cứu<br /> Phòng Norad - Viện Nuôi trồng Thủy sản.<br /> 1.3. Thời gian nghiên cứu:<br /> Từ tháng 6/2015 đến tháng 8/2015.<br /> 2. Chuẩn bị các dụng cụ thí nghiệm<br /> - Nguồn nước: nước cất.<br /> - Dụng cụ thu mẫu: lưới vớt thực vật nổi,<br /> động vật nổi, chai nhựa và thùng xốp đựng mẫu.<br /> <br /> Số 1/2017<br /> 2.1. Môi trường nuôi tảo<br /> Bảng 1. Môi trường dinh dưỡng B12 [12]<br /> Các chất dinh dưỡng<br /> <br /> NaNO3<br /> <br /> Nồng độ (mg/l)<br /> <br /> 100 mg<br /> <br /> K2HPO4<br /> <br /> 10 mg<br /> <br /> MgSO4.7H2O<br /> <br /> 75mg<br /> <br /> CaCl2.2H2O<br /> <br /> 40mg<br /> <br /> Na2CO3<br /> <br /> 20mg<br /> <br /> Ferric citrate<br /> <br /> 6mg<br /> <br /> Disodium EDTA. 2H2O<br /> <br /> 1mg<br /> <br /> VTM<br /> <br /> Vitamin B12<br /> <br /> Nồng độ (ml/l)<br /> <br /> 0,1ml<br /> <br /> 2.2. Vệ sinh các dụng cụ nuôi<br /> Cho nước cất và môi trường dinh dưỡng<br /> (trừ VTM) vào trong bình tam giác 1000 mL,<br /> điều chỉnh pH = 9 (bằng HCl và KOH). Các<br /> dụng cụ như ống nghiệm, hộp lồng, bình tam<br /> giác, ống đong, pipet, que cấy, bông gòn, môi<br /> trường dinh dưỡng, được tiệt trùng bằng máy<br /> Autoclarve ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1.5 at<br /> trong thời gian 30 phút. Để nhiệt độ xuống<br /> thấp hơn 80 0C lấy các dụng cụ ra. Riêng môi<br /> trường dinh dưỡng sau khi lấy ra, để ở nhiệt<br /> độ phòng tảo (25 0C) trong 20 phút rồi cho VTM<br /> vào lắc đều.<br /> 2.3. Phương pháp thu mẫu và nhân giống tảo<br /> để bố trí phân lập<br /> Nguồn tảo hỗn hợp được thu từ một số ao<br /> nuôi cá tại Ninh Phụng - Ninh Hòa - Khánh Hòa<br /> bằng lưới vớt thực vật nổi (Juday gas 98). Sau<br /> đó lọc qua lưới vớt động vật nổi (Juday gas 68)<br /> và cho vào chai nhựa 500 ml. Mẫu tảo được để<br /> trong các thùng xốp, ướp đá lạnh và được vận<br /> chuyển về phòng thí nghiệm. Để lắng trong<br /> vòng 2 tiếng, dùng pipet hút lớp dịch nổi lên<br /> trên bề mặt đó chính là vi khuẩn lam. Nhân<br /> sinh khối giống trong các bình tam giác 250<br /> ml với môi trường B12, nhiệt độ 250C, cường<br /> độ chiếu sáng 2,000 lux, với chu kỳ quang 12<br /> sáng: 12 tối trước khi đưa vào thí nghiệm.<br /> 2.4. Phương pháp phân loại<br /> Quan sát mẫu dưới kính hiển vi Olympus<br /> CX41 có gắn máy ghi hình kỹ thuật số Olympus<br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 77<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> để quan sát và chụp ảnh tảo. Song song với<br /> ảnh chụp, những chi tiết của tảo cũng được<br /> vẽ lại.<br /> Căn cứ vào quan sát trực tiếp, hình ảnh,<br /> các đặc điểm, hình thái và kích thước tế bào<br /> để phân loại. Bằng phương pháp hình thái so<br /> sánh, dựa vào khóa phân loại để phân loại đến<br /> loài. Chúng tôi sử dụng các tài liệu chính sau:<br /> - Phân loại vi khuẩn lam ở Việt Nam [4].<br /> - Phân loại thực vật học bậc thấp [6].<br /> 3. Phương pháp nghiên cứu<br /> 3.1. Phương pháp phân lập tảo<br /> 3.1.1. Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy<br /> trên môi trường thạch agar<br /> Pha 0,4g agar với 100 ml nước cất trong<br /> bình tam giác 500 ml,. Sau đó, đổ vào trong<br /> bình nút mài 500 ml có màu và Autoclarve ở<br /> nhiệt độ 1210C, áp suất 1,5 at trong thời gian<br /> 30 phút. Để nhiệt độ xuống 80 0C lấy bình ra để<br /> ở nhiệt độ phòng tảo (250C) trong 20 phút, cho<br /> môi trường dinh dưỡng vào lắc đều đồng thời<br /> đổ vào đĩa petri (10 ml/đĩa).<br /> Sau 12 giờ, khi thạch đông, nguội dùng<br /> que cấy tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho<br /> đến khi nóng đỏ, chờ nguội rồi dùng que cấy<br /> lấy tảo và cấy lên bề mặt thạch agar. Đậy hộp<br /> lồng lại, cuốn mép đĩa peptri bằng parafin và<br /> đặt dưới ánh sáng đèn neon (thời gian chiếu<br /> sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối), cường độ chiếu<br /> sáng 2,000 lux, nhiệt độ 25 0C.<br /> Sau 10 - 12 ngày nuôi cấy thấy xuất hiện<br /> các quần lạc tảo màu xanh có hình dạng khác<br /> nhau trên bề mặt thạch. Dùng que cấy (sau khi<br /> đã hơ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội) lấy<br /> mẫu từ các quần lạc và quan sát trên kính hiển<br /> vi để kiểm tra độ thuần chủng. Cấy chuyền<br /> sang các đĩa thạch khác đến khi thu được mẫu<br /> thuần chủng 100%.<br /> 3.1.2. Phân lập bằng phương pháp pha loãng<br /> Chuẩn bị 10 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm<br /> chứa 9 ml nước cất. Sau đó, Autoclarve ở nhiệt<br /> độ 1210C, áp suất 1,5 at trong thời gian 30<br /> phút. Để nhiệt độ xuống 80 0C lấy ống nghiệm<br /> ra và để trong phòng thí nghiệm nuôi tảo<br /> <br /> 78 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Số 1/2017<br /> ở nhiệt độ 25 0C. Sau 24h ống nghiệm và nước<br /> cất đã nguội, cho môi trường dinh dưỡng vào<br /> lắc đều. Tiến hành ghi nhãn từ 10-1 đến 10-10<br /> để chỉ số lần pha loãng. Dùng pipet hút 1ml<br /> tảo mẫu thu ngoài tự nhiên đã nhân sinh khối<br /> đưa sang ống nghiệm đầu tiên 10-1 và lắc<br /> nhẹ nhàng cho đều. Tiếp tục hút 1ml từ ống<br /> nghiệm 10-1 sang ống nghiệm 10-2 và lắc nhẹ.<br /> Lặp lại như vậy cho đến ống nghiệm thứ 10<br /> (10-10). Các ống nghiệm được đặt trên giá và<br /> nuôi trong điều kiện: thời gian chiếu sáng: 12<br /> giờ sáng: 12 giờ tối, nhiệt độ: 250C, cường độ<br /> chiếu sáng: 2,000 lux.<br /> 3.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu<br /> 3.2.1. Xác định mật độ tế bào<br /> Việc xác định số lượng tế bào tảo được<br /> tiến hành bằng cách đếm tế bào trên buồng<br /> đếm hồng cầu Neubacur’s Hemacytometer<br /> của Đức, buồng đếm có 25 ô vuông lớn, mỗi ô<br /> vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ, mỗi ô vông nhỏ<br /> có diện tích 0,0025 mm2 và độ sâu buồng đếm<br /> là 0,1 mm.<br /> 3.2.2. Công thức tính<br /> Theo Mucklow, số lượng tb/mL = (X x 1000<br /> mm3)/(Y x W2 x d)<br /> Trong đó:<br /> X = số lượng tế bào được đếm<br /> Y = số lượng ô vuông nhỏ nhất được đếm<br /> d = độ dày của lớp nước trong buồng đếm<br /> W = cạnh của một ô vuông<br /> W2 x d: Thể tích của dung dịch trong một ô<br /> vuông nhỏ nhất<br /> 3.2.3. Xác định một số yếu tố môi trường<br /> a. Đo cường độ ánh sáng: Được đo bằng<br /> máy đo Ana-F1 của Nhật.<br /> b. Đo pH: Được đo bằng máy đo pH 744,<br /> hiệu Metrohm.<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br /> 1. Thu mẫu, phân lập 1 loài thuộc chi<br /> Microcystis từ ao cá Ninh Phụng - Ninh Hòa<br /> Sau khi thu mẫu từ một số ao nuôi cá tại Ninh<br /> Phụng - Ninh Hòa - Khánh Hòa về Phòng thí<br /> nghiệm Norad - Viện Nuôi trồng Thủy sản. Nhân<br /> sinh khối giống trong các bình tam giác 250ml<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> với môi trường B12, nhiệt độ 250C, cường độ<br /> chiếu sáng 2,000 lux, với chu kỳ quang (12:12)<br /> trước khi đưa vào thí nghiệm.<br /> 1.1. Phân loại loài Microcystis aeruginosa<br /> Dựa theo phân loại các tài liệu [4], [6] về các<br /> đặc điểm hình thái, kết hợp với kết quả chụp<br /> hình thái trên kính hiển vi quang học, chúng tôi<br /> xác định đây là loài Microcystis aeruginosa.<br /> Tế bào tảo Microcystis aeruginosa có<br /> đặc điểm: Tập đoàn có cấu tạo bất thường,<br /> <br /> Số 1/2017<br /> các tế bào sắp xếp rải rác, bao nhầy, trong suốt,<br /> các tế bào tròn rộng, dạng hình cầu, đường<br /> kính 3 -7 µm. Tế bào có màu xanh lam, đều<br /> chứa không bào khí bên trong, thường sắp xếp<br /> dày đặc. Thường tạo thành váng xanh nổi trên<br /> mặt nước. Tuy nhiên trong mẫu còn rất nhiều<br /> loài tảo khác nhau do đó chúng tôi tiến hành<br /> phân lập tảo bằng phương pháp: nuôi cấy<br /> trên môi trường thạch agar và phương pháp<br /> pha loãng.<br /> <br /> Hình 1. Tảo Microcystis phát triển trong ao nuôi cá Ninh Phụng<br /> <br /> 1.2. Phân lập Microcystis aeruginosa bằng<br /> phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch agar<br /> Sau 10 ngày phân lập, chúng tôi quan sát<br /> thấy xuất hiện các quần lạc có màu xanh mọc<br /> rải rác trên đĩa thạch. Dùng que cấy lấy các<br /> quần lạc tảo từ các đĩa petri và kiểm tra độ<br /> <br /> thuần chủng của tảo, tảo đạt độ thuần chủng<br /> không cao (70%), trong mẫu còn bắt gặp khá<br /> nhiều tế bào tảo khác. Sau 3 lần cấy chuyền lặp<br /> lại với tổng thời gian 30 ngày nuôi cấy trên môi<br /> trường thạch agar chúng tôi đã thu được loài<br /> tảo M. aeruginosa có độ thuần chủng 100%.<br /> <br /> Bảng 2. Độ thuần chủng của M. aeruginosa (%)<br /> bằng phương pháp cấy trên môi trường thạch agar<br /> STT<br /> <br /> Phân lập trên môi trường thạch agar<br /> <br /> Thời gian nuôi cấy<br /> <br /> Độ thuần chủng<br /> <br /> 1<br /> <br /> Đĩa peptri 1<br /> <br /> 10 ngày<br /> <br /> 70%<br /> <br /> 2<br /> <br /> Cấy chuyền từ đĩa peptri 1 qua đĩa peptri 2<br /> <br /> 10 ngày<br /> <br /> 95%<br /> <br /> 3<br /> <br /> Cấy chuyền từ đĩa peptri 2 qua đĩa peptri 3<br /> <br /> 10 ngày<br /> <br /> 100%<br /> <br /> Hình 2. Quần lạc tảo Microcystis aeruginosa mọc trên môi trường thạch agar<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 79<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 1/2017<br /> <br /> 1.3. Phân lập Microcystis aeruginosa bằng<br /> phương pháp pha loãng<br /> Sau 16 ngày nuôi cấy tảo M. aeruginosa ở<br /> các độ pha loãng khác nhau từ 10-1 đến 10-10,<br /> chúng tôi quan sát các ống nghiệm bằng mắt<br /> thường thấy dịch tảo có màu xanh lam, màu<br /> đặc trưng của tảo lam.<br /> <br /> Hình 4. Quần lạc tảo Microcystis aeruginosa<br /> thuần chủng (độ phóng đại 400x)<br /> <br /> Hình 3. Tảo Microcystis aeruginosa phát triển<br /> ở phương pháp pha loãng<br /> <br /> Khi đưa các mẫu tảo ở các độ pha loãng<br /> khác nhau lên quan sát, chúng tôi đã đếm mật<br /> độ tảo M. aeruginosa và thu được kết quả<br /> như sau:<br /> - Độ pha loãng 10-1: sau 5 ngày quan sát<br /> thấy lẫn nhiều loài tảo khác;<br /> - Độ pha loãng10-2: sau 7 ngày quan sát<br /> thấy lẫn nhiều loài tảo khác;<br /> - Độ pha loãng10-3: sau 16 ngày độ thuần<br /> chủng của M. aeruginosa đạt 80%;<br /> - Độ pha loãng10-4: sau 16 ngày độ thuần<br /> chủng của M. aeruginosa đạt 99%;<br /> - Độ pha loãng 10-5: sau 16 ngày độ thuần<br /> chủng của M. aeruginosa đạt 100%;<br /> Kết quả thu được M. aeruginosa thuần<br /> chủng 100% từ đĩa có độ pha loãng 10-5 đến<br /> 10-10. Ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-4, độ<br /> thuần chủng cũng đã đạt 99% sau 16 ngày<br /> nuôi cấy.<br /> <br /> 80 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> So sánh với phương pháp pha loãng thì<br /> phương pháp nuôi cấy trên môi trường agar,<br /> tảo M. aeruginosa thu được tảo thuần chủng<br /> có thời gian lâu hơn (30 ngày). Kết quả phù<br /> hợp với nghiên cứu của Hilary Belcher,1982<br /> [11], khi ông cho rằng phương pháp phân<br /> lập bằng cách nuôi cấy trên môi trường agar<br /> chỉ phù hợp với các loài tảo silic nước ngọt<br /> và tảo lục đơn bào (đặc biệt là các loài thuộc<br /> chi Chlorella). Nghiên cứu của Hoàng Thị Bích<br /> Mai, 1995 [2] đã kết luận rằng: khi phân lập,<br /> lưu giữ cũng như nuôi sinh khối tảo, chúng ta<br /> cần chú ý đến đặc điểm sinh thái của loài để<br /> chọn phương pháp phân lập phù hợp.<br /> Qua kết quả trên ta thấy, phương pháp pha<br /> loãng là phương pháp thích hợp hơn để phân<br /> lập tảo M. aeruginosa với độ thuần chủng cao<br /> 100% và độ pha loãng thấp 10-5.<br /> IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ<br /> Trong 2 phương pháp phân lập: phân lập<br /> bằng cách pha loãng và phân lập bằng cách<br /> nuôi cấy trên môi trường thạch, chúng tôi thấy<br /> phân lập theo phương pháp pha loãng là thích<br /> hợp hơn cho loài tảo Microcystis aeruginosa.<br /> Tảo M. aeruginosa đạt thuần chủng 100 % từ<br /> độ pha loãng 10-5.<br /> Cần nghiên cứu sâu như: tách chiết và<br /> phân loại độc tố của vi khuẩn lam, cụ thể là loài<br /> M. aeruginosa trên máy sắc ký lỏng cao áp và<br /> thăm dò khả năng phân giải độc tố microcystin<br /> của tảo M. aeruginosa trên động vật thủy sản.<br /> <br />