Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu các điều kiện stress môi trường đến khả năng tổng hợp exopolysaccharides của vi khuẩn Lactobacillus plantarum

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:156

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học "Nghiên cứu các điều kiện stress môi trường đến khả năng tổng hợp exopolysaccharides của vi khuẩn Lactobacillus plantarum" trình bày các nội dung chính sau: Phân lập chủng L. plantarum có khả năng sinh tổng hợp EPS cao; Khảo sát ảnh hưởng của stress nhiệt, pH, NaCl và sự tăng nồng độ CO2 đến năng suất và hoạt tính sinh học của EPS; Xác định sự thay đổi thành phần monosaccharide của EPS được sản xuất bởi L. plantarum dưới các điều kiện stress môi trường.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu các điều kiện stress môi trường đến khả năng tổng hợp exopolysaccharides của vi khuẩn Lactobacillus plantarum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Phú Thọ NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN STRESS MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG TỔNG HỢP EXOPOLYSACCHARIDES CỦA VI KHUẨN Lactobacillus plantarum LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Phú Thọ NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN STRESS MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG TỔNG HỢP EXOPOLYSACCHARIDES CỦA VI KHUẨN Lactobacillus plantarum Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Hoàng Quốc Khánh 2. TS. Nguyễn Hữu Thanh Hà Nội - 2022
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi. Các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu trong luận án do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam. Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác. Tác giả luận án Nguyễn Phú Thọ
LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, thực hiện luận án tôi đã nhận được sự quan tâm, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Quý cơ quan, thầy cô, đồng nghiệp, anh chị, bạn bè và gia đình. Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến TS. Hoàng Quốc Khánh và TS. Nguyễn Hữu Thanh, những người thầy, người hướng dẫn khoa học mà tôi hết mực kính trọng đã luôn tận tình chỉ bảo và hướng dẫn các nội dung, phương pháp và thực hiện các thí nghiệm cũng như giúp tôi trưởng thành hơn trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận án. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh và Phòng đào tạo, Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn tất các môn học trong suốt quá trình học tập tại Viện. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Trường Đại học An Giang, Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệ Cần Thơ đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tập thể Quý thầy cô, bạn bè, gia đình đã luôn bên tôi, động viên, chia sẻ khó khan và là động lực để tôi cố gắng và hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn đề tài cấp Nhà Nước thuộc Chương trình Khoa học Công nghệ Tây Nam Bộ: “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất prebiotic từ vi khuẩn lactic ứng dụng trong sản xuất thức ăn cho Tôm nhằm hạn chế bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease – AHND)” của Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ một phần kinh phí cho các nghiên cứu trong luận án này. Nguyễn Phú Thọ được tài trợ bởi Tập đoàn Vingroup – Công ty CP và hỗ trợ bởi Chương trình học bổng thạc sĩ, tiến sĩ trong nước của Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF), Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn, mã số VINIF.2021.TS.110. Tác giả luận án Nguyễn Phú Thọ
MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... iv DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................v DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. vi TÓM TẮT ................................................................................................................. ix ABSTRACT .............................................................................................................. xi MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................3 1.1. Giới thiệu về L. plantarum ........................................................................ 3 1.2. Cấu trúc vách tế bào của Lactobacillus ...................................................... 4 1.3. EPS của LAB ........................................................................................... 6 1.3.1. Phân loại EPS của LAB ............................................................................ 6 1.3.2. Thành phần và cấu trúc EPS của LAB ..................................................... 7 1.4. Hoạt tính sinh học của EPS ..................................................................... 14 1.5. Sinh tổng hợp EPS ở LAB ....................................................................... 18 1.6. Di truyền liên quan đến sản xuất EPS ở Lactobacillus .............................. 23 1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp EPS ở LAB ............................... 29 1.8. Phản ứng của LAB dưới tác động của stress môi trường ........................... 30 1.9. Stress môi trường và đáp ứng sinh tổng hợp EPS ở LAB .......................... 33 1.9.1. Stress môi trường và sản xuất EPS ở LAB ............................................. 33 1.9.2. Stress môi trường và khả năng chịu stress của LAB .............................. 34 1.9.3. Sự thích nghi với stress môi trường làm tăng khả năng sống sót của LAB .......................................................................................................................... 35 1.9.4. Stress môi trường và sự thay đổi thành phần monosaccharide của EPS .......................................................................................................................... 36 2.9.5. Stress môi trường và sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS .......................................................................................................................... 37 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................40 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 40 2.2. Hóa chất ................................................................................................. 40 i
2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 40 2.3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ........................................................................... 40 2.3.2. Các phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn L. platarum .......... 43 2.3.3. Phương pháp thu nhận EPS ................................................................... 44 2.3.4. Các phương pháp phân tích tính chất của EPS thu được ...................... 44 2.3.5. Phương pháp đếm mật số vi khuẩn và tính khả năng sống sót sau đông khô .................................................................................................................... 45 2.3.6. Phương pháp xác định thành phần monosaccharide của EPS .............. 45 2.3.7. Phương pháp phân tích biểu hiện gen .................................................... 46 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 48 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................49 3.1. Phân lập và định danh chủng vi khuẩn Lactobacillus ................................ 49 3.2. Ảnh hưởng của stress môi trường lên khả năng sinh tổng hợp EPS ở L. plantarum VAL6 ........................................................................................... 53 3.2.1. Stress nhiệt.............................................................................................. 53 3.2.2. Stress pH ................................................................................................. 55 3.2.3. Stress NaCl ............................................................................................. 58 3.2.4. Tăng nồng độ CO2 .................................................................................. 61 3.2.5. So sánh ảnh hưởng của các điều kiện stress môi trường khác nhau lên khả năng sản xuất EPS, hoạt tính sinh học của EPS thu được ........................ 63 3.3. Ảnh hưởng của stress môi trường lên thành phần monosaccharide của EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 ........................................................... 69 3.3.1. Stress nhiệt .............................................................................................. 69 3.3.2. Stress pH ................................................................................................. 72 3.3.3. Stress NaCl ............................................................................................. 74 3.3.4. Tăng nồng độ CO2 .................................................................................. 75 3.3.5. Đánh giá ảnh hưởng của yếu tố môi trường lên thành phần monosaccharide của EPS ................................................................................. 76 3.4. Ảnh hưởng của stress môi trường lên sự biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS ........................................................................................ 78 3.4.1. Stress nhiệt.............................................................................................. 78 3.4.2. Stress pH ................................................................................................. 80 ii
3.4.3. Stress NaCl ............................................................................................. 83 3.4.4. Tăng nồng độ CO2 .................................................................................. 85 3.4.5. Đánh giá ảnh hưởng của yếu tố môi trường lên sự biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS ....................................................................... 86 3.5. Thảo luận chung ..................................................................................... 89 3.5.1. Sự hình thành EPS .................................................................................. 89 3.5.2. Đáp ứng biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS ........... 90 3.5.3. Khả năng hình thành đường hiếm trong thành phần EPS ..................... 91 3.5.4. Mối quan hệ giữa biểu hiện gen với năng suất và thành phần monosaccharide của EPS ................................................................................. 92 3.5.5. Tác động của stress môi trường với khả năng sống sót của L. plantarum VAL6 ................................................................................................................. 93 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................95 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .........................................................97 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .......................................................978 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................99 PHỤ LỤC ................................................................................................................127 iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT EPS: Exopolysaccharide CIP: Protein cảm ứng lạnh Cs.: Cộng sự C55-P: Undecaprenyl phosphate DPPH: 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl GC-FID: Gas Chromatography - Flame Ionization Detection GDA: Glutamate decarboxylase Glu: Glucose; Gal: Galactose; Man: Mannose; Rha: Rhamnose; Ara: Arabinose; Xyl: Xylose; Fru: Fructose GT: glycosyltransferase HoPS: Homopolysaccharide HePS: Heteropolysaccharide HC II: Heparin Cofactor II IS: transasease LAB: Lactic acid bacteria (Vi khuẩn lactic) MRS: Man Rogosa Sharpe PE: Polyetylen PG: Peptidoglycan iv
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. HoPS được sản xuất bởi LAB ....................................................................7 Bảng 1.2. Cấu trúc đơn vị lặp lại của EPS ở một số LAB ..........................................9 Bảng 1.3. Thành phần monosaccharide trong EPS của một số dòng L. plantarum .12 Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nuôi cấy tăng cường CO2 .............................................42 Bảng 2.2. Các đoạn mồi được sử dụng phân tích Real-time qPCR ..........................47 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa của các chủng LAB được phân lập từ thực phẩm lên men ............................................................................................................49 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện stress môi trường khác nhau lên năng suất EPS, mật số và tỷ lệ sống sót sau sấy đông khô của L. plantarum VAL6 ................64 Bảng 3.3. Mật số vi khuẩn probiotic được nuôi cấy trong môi trường MRS không đường có bổ sung EPS của L. plantarum VAL6 ......................................................68 Bảng 3.4. Thay đổi biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới tác động của các thách thức môi trường so với điều kiện không gây stress ...................89 v
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vị trí phát sinh loài của L. plantarum so với một số LAB liên quan khác dựa trên trình tự 16S rRNA .........................................................................................4 Hình 1.2. Cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn Gram dương .........................................5 Hình 1.3. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh (pyranose) của glucose và 5 cạnh (furanose) của fructose .................................................................................................................8 Hình 1.4. Hoạt tính sinh học của EPS được sản xuất bởi LAB ................................15 Hình 1.5. Các cơ chế kháng khuẩn của EPS. ............................................................16 Hình 1.6. Sơ đồ chi tiết về sản xuất EPS của LAB thông qua việc chuyển đổi đường lactose, galactose và glucose trong tế bào chất .........................................................19 Hình 1.7. Cấu tạo của nucleotide-đường ..................................................................20 Hình 1.8. Sơ đồ sinh tổng hợp EPS trong L. lactis NIZO.........................................21 Hình 1.9. Tổng hợp dextran bởi glycosyltransferase (dextran sucrase) ...................22 Hình 1.10. Sơ đồ tổ chức di truyền của cụm gen eps trong L. plantarum ................28 Hình 1.11. Sơ đồ tổ chức di truyền của cụm gen eps trong các LAB khác nhau .....28 Hình 1.12. Stress môi trường kích thích sản xuất EPS .............................................33 Hình 1.13. Cơ chế điều hòa phiên mã chống lại stress môi trường ở vi khuẩn ........37 Hình 3.1. Hình dạng tế bào chủng vi khuẩn L6 dưới kính hiển vi quang học ..........49 Hình 3.2. Đặc điểm khuân lạc chủng vi khuẩn L6....................................................50 Hình 3.3. Khả năng sản xuất EPS của các chủng LAB phân lập từ thực phẩm lên men ............................................................................................................................50 Hình 3.4. Kết quả BLAST SEARCH để phân loài chủng L6 ...................................51 Hình 3.5. Cây phát sinh loài của chủng L. plantarum VAL6 được xây dựng bằng cách so sánh trình tự 16S rRNA ................................................................................52 Hình 3.6. Sản phẩm khuyếch đại PCR của gen recA ................................................52 Hình 3.7. Năng suất EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress nhiệt .................................................................................................................53 Hình 3.8. Sự thay đổi mật số L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress nhiệt ........54 Hình 3.9. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 được stress nhiệt ..55 Hình 3.10. Năng suất EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress pH ....................................................................................................................56 Hình 3.11. Sự thay đổi mật số L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress pH .........57 vi
Hình 3.12. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 được gây stress pH ...................................................................................................................................57 Hình 3.13. Năng suất EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress NaCl ................................................................................................................59 Hình 3.14. Sự thay đổi mật số L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress NaCl ......59 Hình 3.15. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 được stress NaCl60 Hình 3.16. Năng suất EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2 ..........................................................................................61 Hình 3.17. Sự thay đổi mật số L. plantarum VAL6 dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2 .................................................................................................................62 Hình 3.18. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 được nuôi cấy tăng cường CO2 .................................................................................................................62 Hình 3.19. Khả năng chống oxy hóa của các loại EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới các điều kiện stress môi trường ...........................................65 Hình 3.20. Hàm lượng protein trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới các điều kiện stress môi trường ........................................................................66 Hình 3.21. Tỷ lệ các monosaccharide: (A) mannose; (B) glucose; (C) galactose; (D) arabinose; (E) rhamnose và (F) xylose trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress nhiệt ............................................................70 Hình 3.22. Sắc ký đồ thành phần monosaccharide trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 sau 3 giờ gây stress ở 42 oC .........................................................71 Hình 3.23. Tỷ lệ các monosaccharide: (A) mannose; (B) glucose; (C) galactose; (D) arabinose; (E) rhamnose và (F) xylose trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress pH.................................................................................73 Hình 3.24. Tỷ lệ các monosaccharide: (A) mannose; (B) glucose; (C) galactose; (D) arabinose; (E) rhamnose và (F) xylose trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress NaCl .............................................................................74 Hình 3.25. Tỷ lệ các monosaccharide: (A) mannose; (B) glucose; (C) galactose và (D) rhamnose trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2 ..................................................................................................76 Hình 3.26. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress nhiệt .................................................................79 vii
Hình 3.27. Biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress nhiệt .................................................................................................................80 Hình 3.28. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress pH .....................................................................81 Hình 3.29. Biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress pH ....................................................................................................................82 Hình 3.30. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress NaCl .................................................................83 Hình 3.31. Biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress NaCl ................................................................................................................84 Hình 3.32. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2 ...........................................85 Hình 3.33. Biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện tăng nồng độ CO2 ......................................................................................................86 Hình 3.34. Sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới tác động của stress môi trường .......................................................................................................90 Hình 3.35. Mô hình đề xuất để nâng cao EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 ...................................................................................................................................91 Hình 3.36. Mối tương quan giữa tổng EPS và khả năng sống sót của L. plantarum VAL6 trong quá trình sấy đông khô .........................................................................94 viii
TÓM TẮT Luận án “Nghiên cứu các điều kiện stress môi trường đến khả năng tổng hợp exopolysaccharides của vi khuẩn Lactobacillus plantarum” được thực hiện nhằm mục đích xác định được điều kiện stress thích hợp kích thích khả năng sinh tổng hợp mạnh exopolysaccharide (EPS) ở Lactobacillus plantarum. Nghiên cứu đã thực hiện phân lập chủng L. plantarum có khả năng sinh tổng hợp EPS cao từ thực phẩm lên men, đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện stress môi trường như nhiệt độ, pH, NaCl và sự tăng nồng độ CO2 lên quá trình sản xuất EPS, lên sự thay đổi thành phần monosaccharide và sự biểu hiện của các gen có liên quan đến tổng hợp EPS. Từ nguồn thực phẩm lên men truyền thống tại An Giang (Việt Nam) đã phân lập được chủng vi khuẩn Lactobacillus bản địa có khả năng sản xuất EPS cao và được định danh là Lactobacillus plantarum VAL6. Thực hiện nuôi cấy dưới tác động của các điều kiện stress môi trường, nghiên cứu đã xác định được xác định được điều kiện stress thích hợp kích thích khả năng sinh tổng hợp mạnh EPS của L. plantarum. Năng suất EPS cao nhất (50,44 g/L) thu được ở điều kiện stress pH 3 trong 3 giờ. Xác định mối tương quan giữa sản xuất EPS và khả năng sống sót đã chỉ ra rằng sự tăng sản xuất EPS dưới các điều kiện stress môi trường làm tăng rõ rệt sự sống sót của vi khuẩn trong quá trình sấy đông khô. Tương ứng với lượng EPS thu được nhiều nhất, tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 ở điều kiện stress pH 3 cũng đạt cao nhất (30,72%), cao hơn 1.536 lần so với điều kiện không gây stress. Phân tích thành phần monosaccharide của EPS bằng phương pháp sắc ký khí với đầu dò ion hóa ngọn lửa. Kết quả cho thấy stress môi trường làm thay đổi thành phần monosaccharide của EPS với sự tích tụ nhiều hơn của một số loại đường phổ biến (mannose, galactose, xylose,..) và đường hiếm (rhamnose, fucose,...). Cụ thể, EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 ở điều kiện nuôi cấy bình thường là heteropolysaccharide bao gồm các loại đường mannose (83,44%), glucose (14,01%), galactose (1,15%), arabinose (0,00%), rhamnose (0,71%) và xylose (0,67%). Sau khi gây stress, thành phần monosaccharide thay đổi bao gồm mannose (69,13-80,34%), glucose (12,55-23,60%), galactose (1,87-6,50%), arabinose (0,00- ix
8,96%), rhamnose (0,38-8,00%) và xylose (0,00-6,55%). Dưới điều kiện stress nhiệt còn tìm thấy sự hiện diện của fucose trong thành phần EPS. Phân tích sự biểu hiện mRNA của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp EPS bằng kỹ thuật Real-time qPCR, kết quả cho thấy stress môi trường có tác động làm tăng hoặc giảm sự biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp EPS (glmU, pgmB1, cps4E, cps4F, cps4J và cps4H), kết quả dẫn đến những thay đổi trong năng suất và thành phần monosacchride của EPS. Các kết quả này cho thấy rằng stress môi trường có thể làm thay đổi quá trình sinh tổng hợp EPS ở vi khuẩn lactic (LAB). Ngoài ra, stress môi trường có thể được sử dụng để kích thích LAB sản xuất EPS mới có hoạt tính sinh học cao cho các ứng dụng công nghiệp. x
ABSTRACT The thesis, "Study on environmental stress conditions on the ability to synthesize exopolysaccharides of Lactobacillus plantarum" was carried out with the aim to determine the appropriate stress conditions that stimulate strong exopolysaccharide (EPS) biosynthesis in Lactobacillus plantarum. In this study, we isolated L. plantarum strain with high EPS biosynthesis ability from fermented foods and evaluated the effects of environmental stress conditions such as temperature, pH, NaCl, and increased CO2 concentration, on EPS production, changes in monosaccharide composition, and the expression of genes involved in EPS synthesis. From traditional fermented foods in An Giang (Vietnam), a native strain of Lactobacillus with high EPS production capacity was isolated and identified as Lactobacillus plantarum VAL6. Carrying out the culture under the influence of environmental stresses, the study discovered the appropriate stress condition that stimulates the strong EPS biosynthesis of L. plantarum. Accordingly, the maximum EPS yield (50.44 g/L) was obtained after 3 hours of stress at pH 3. Observation of the correlation between the EPS production and survival indicated that increased EPS production under environmental stresses markedly increased bacterial survival during freeze-drying. Corresponding to the maximum amount of EPS produced, the freeze-dried survival of L. plantarum VAL6 stressed at pH 3 was also the highest (30.72%), 1,536 times higher than the normal culture condition. Analysis of EPS monosaccharide composition was done using gas chromatography with a flame ionization detector. The analysis demonstrated that environmental stresses alter the monosaccharide composition of EPS, resulting in greater accumulation of some common sugars (mannose, galactose, xylose, etc.) and rare sugars (rhamnose, fucose, etc.). Specifically, the EPS produced by L. plantarum VAL6 under normal culture conditions are heteropolysaccharides consisting of sugars such as mannose (83.44%), glucose (14.01%), galactose (1.15%), arabinose (0.00%), rhamnose (0.71%), and xylose (0.67%). After stress, the monosaccharide composition changed including mannose (69.13-80.34%), xi
glucose (12.55-23.60%), galactose (1.87-6.50%), arabinose (0.00-8.96%), rhamnose (0.38-8.00%), and xylose (0.00-6.55%). Under heat stress conditions, the presence of fucose was also found in the EPS component. Analyzing the mRNA expression of genes involved in EPS biosynthesis via Real-time qPCR, the results showed that environmental stresses could increase or decrease the expression of genes involved in EPS biosynthesis (glmU, pgmB1, cps4E, cps4F, cps4J, and cps4H), resulting in changes in the yield and monosacchride composition of EPS. These results suggested that environmental stresses could alter EPS biosynthesis in lactic acid bacteria (LAB). Furthermore, environmental stresses could be used to stimulate LAB to produce novel EPS which is highly bioactive for industrial applications. xii
MỞ ĐẦU Exopolysaccharide (EPS) là các polymer sinh học và là một trong những thành phần tham gia cấu tạo vách tế bào. EPS có thể được sản xuất bởi nhiều vi sinh vật khác nhau như tảo, nấm và vi khuẩn, bao gồm vi khuẩn lactic (LAB: Lactic Acid Bacteria). EPS được chia thành hai loại là homopolysaccharide (HoPS) và heteropolysaccharide (HePS) dựa theo thành phần cấu tạo hóa học của nó. HoPS được cấu tạo từ cùng một tiểu đơn vị đường đơn trong cấu trúc đơn vị lặp lại. HePS được tạo thành từ các đơn vị lặp lại bao gồm hai hoặc nhiều loại tiểu đơn vị đường, dẫn xuất của đường, các phân tử hữu cơ và vô cơ khác [1,2]. EPS có thể liên kết chặt chẽ với bề mặt tế bào, được định nghĩa là capsular polysaccharide hoặc liên kết lỏng lẻo với bề mặt tế bào và có thể giải phóng ra môi trường bên ngoài, được mô tả là exo-polysaccharide. Hiện nay ngày càng có nhiều tài liệu mô tả các loại polysaccharide này với thuật ngữ chung là EPS [1]. Với những đặc điểm cấu trúc độc đáo cũng như nhu cầu sử dụng các thành phần tự nhiên đã khiến cho EPS của LAB nhận được sự quan tâm đặc biệt trong các ứng dụng của thực phẩm, dược phẩm và y học. Trong công nghiệp thực phẩm, EPS được sử dụng như là một các chất làm đặc, chất ổn định và chất nhũ hóa [3]. Trong y học, EPS được chứng minh có khả năng chống oxy hoá, kích thích và điều chỉnh hệ thống miễn dịch, hoạt động chống viêm, thậm chí chống ung thư. Một số tuyên bố về sức khỏe còn báo cáo rằng EPS của LAB có thể làm giảm cholesterol trong máu [4]. Trong tự nhiên, EPS có vai trò bảo vệ LAB khỏi sự mất nước, tránh các tác động tiêu cực của môi trường như nhiệt độ, pH, thẩm thấu, kháng sinh, thực bào và sự tấn công của phage. EPS còn liên quan đến sự hình thành màng sinh học (biofilm) và cơ chế bám dính của tế bào [5], cũng như quyết định đặc trưng tương tác giữa tế bào với vật chủ [6]. Trên thực tế, để thích nghi với các thay đổi của môi trường, LAB phản ứng bằng nhiều cách khác nhau, trong đó có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp EPS. Do đó, stress môi trường có thể kích thích làm tăng sản xuất EPS ở LAB. Chức năng sinh học của EPS phụ thuộc vào thành phần monosaccharide tham gia cấu tạo nên nó [7]. Sự khác biệt về tỷ lệ và thành phần monosaccharide dẫn đến những khác nhau trong hoạt tính sinh học của EPS [8]. Đặc biệt, EPS giàu 1
đường hiếm có hoạt tính sinh học cao hơn so với các EPS chỉ bao gồm các loại đường thông thường [9,10]. Ngoài ra, một số nghiên cứu đã chứng minh thành phần monosaccharide của EPS có liên quan trực tiếp đến khả năng chịu stress của LAB [11]. Ngược lại, những thay đổi trong điều kiện môi trường có thể làm thay đổi thành phần monosaccharide của EPS [12]. Nhưng đối với hầu hết các vi khuẩn, thành phần monosaccharide trong EPS được xác định về mặt di truyền và thay đổi không đáng kể dưới điều kiện nuôi cấy bình thường. Do đó, nghiên cứu tác động của stress môi trường nhằm làm thay đổi quá trình sinh tổng hợp với mục đích tạo ra EPS mới có hoạt tính sinh học cao sẽ là một chiến lược nghiên cứu đầy hứa hẹn. Trong số các LAB, Lactobacillus là nhóm được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm thực phẩm như đồ uống lên men, sữa chua và pho mát [13]. Lactobacillus plantarum (theo hệ thống phân loại mới được đặt tên là Lactiplantibacillus plantarum [14]) là vi khuẩn phổ biến trong các sản phẩm thực phẩm lên men bởi vì khả khả năng thích nghi cao với các thay đổi của môi trường. Ngoài ra, L. plantarum được biết đến với khả năng sản xuất EPS có các tính chất sinh học nổi bật được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau [15]. Tuy nhiên, hiện nay việc phân lập chủng vi khuẩn L. plantarum bản địa có khả năng sản xuất EPS cao và việc nghiên cứu sử dụng stress môi trường để làm tăng sản xuất EPS ở vi khuẩn này vẫn còn hạn chế. Do đó, đề tài “Nghiên cứu các điều kiện stress môi trường đến khả năng tổng hợp exopolysaccharides của vi khuẩn L. plantarum” nhằm mục đích xác định được điều kiện stress thích hợp kích thích khả năng sinh tổng hợp mạnh EPS của L. plantarum. Đề tài tập trung nghiên cứu khả năng tích lũy EPS từ việc nuôi cấy L. plantarum có bổ sung các các điều kiện stress môi trường với những nội dung sau: - Phân lập chủng L. plantarum có khả năng sinh tổng hợp EPS cao. - Khảo sát ảnh hưởng của stress nhiệt, pH, NaCl và sự tăng nồng độ CO2 đến năng suất và hoạt tính sinh học của EPS. - Xác định sự thay đổi thành phần monosaccharide của EPS được sản xuất bởi L. plantarum dưới các điều kiện stress môi trường. - Xác định ảnh hưởng của stress môi trường lên sự biểu hiện mRNA của các gen liên quan đến tổng hợp EPS. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về L. plantarum LAB là một nhóm đa dạng các vi khuẩn Gram dương, sống trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí bắt buộc, có khả năng sản xuất L-acid lactic. Lactobacillus được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực probiotic và là chi chiếm ưu thế nhất trong nhóm LAB [16]. Trong số các loài thuộc Lactobacillus, L. plantarum là chủng có các đặc tính hữu ích và thường được sử dụng nhiều trong các sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống [17]. Ngoài ra, L. plantarum còn được sử dụng rộng rãi trong lên men công nghiệp và được công nhận là an toàn [18]. Đầu tiên, L. plantarum được gọi tên là Streptobacterium plantarum bởi Orla- Jensen. Trước khi áp dụng phương pháp nhận dạng loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử, dựa trên nhận dạng sinh hóa trước những năm 1980 thì L. pentosus, L. arabinosus, L. rudensis và L. plantarum var. mobilis được xem như cùng một loài vì chúng có các đặc điểm kiểu hình giống nhau. L. plantarum là trực khuẩn Gram dương, tế bào có hình que đầu tròn, thẳng, thường rộng 0,9-1,2 μm và dài 3-8 μm, xuất hiện đơn lẻ, theo cặp hoặc theo chuỗi ngắn [19]. L. plantarum là vi khuẩn không gây bệnh, không có khả năng di động, không sinh bào tử, khuẩn lạc tròn và trơn, màu trắng sữa, lên men kỵ khí tùy tiện và thường được sử dụng trong bảo quản các loại thực phẩm lên men. L. plantarum lên men glucose qua con đường chuyển hóa Emden-Meyerhof-Parnas. Quá trình lên men hexose qua con đường chuyển hóa Emden-Meyerhof-Parnas dẫn đến sự hình thành các acid D-lactic và L-lactic. Mặt khác, pentose cũng được lên men để tạo thành acid lactic và acid axetic dưới sự hiện diện của phosphoacetolase [20]. L. plantarum thường chiếm ưu thế trong các sản phẩn thực phẩm lên men acid lactic có pH thấp hơn 4 và có thể sống sót trong điều kiện acid của dạ dày, điều này cho thấy nó có khả năng kháng acid cao. L. plantarum là chủng ưa nhiệt trung bình có khả năng tăng trưởng ở nhiệt độ từ 15 đến 45 °C. Sự tăng trưởng tốt được ghi nhận dưới sự hiện diện của 4 đến 6% NaCl và ở các giá trị pH trong khoảng từ 4 đến 9 [21]. Lactobacillus là một nhóm không đồng nhất, một nghiên cứu lai tạo DNA- DNA chỉ ra rằng chúng có chứa nhiều kiểu gen và nhóm di truyền. Vị trí phát sinh 3
loài của L. plantarum trong sự liên quan với một số loài Lactobacillus khác được mô tả ở hình 1.1. L. acidophilus L. fermentum L. fermentum L. fermentum L. fermentum L. paracasei L. paracasei L. rhamnosus L. sakei L. pentosus L. plantarum L. plantarum L. plantarum L. plantarum Lactobacillus sp L. brevis L. sanfrancisco L. sanfrancisco Hình 1.1. Vị trí phát sinh loài của L. plantarum so với một số LAB liên quan khác dựa trên trình tự 16S rRNA [22] 1.2. Cấu trúc vách tế bào của Lactobacillus Vách tế bào của Lactobacillus bao gồm khối peptidoglycan (PG) dày (có nhiều lớp) được gắn thêm các acid teichoic, polyphosphate, protein và polysaccharide (Hình 1.2). Đây cũng là đặc điểm chung của LAB và những thành phần này chi phối tương tác của LAB với môi trường. Mỗi đại phân tử trên bề mặt tế bào đều có ảnh hưởng đến hoạt động probiotic của LAB vì nó có liên quan đến tương tác giữa vi khuẩn và vật chủ. Lớp PG là 4