Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:147

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án "Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens" là tuyển chọn và nâng cao được khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của vi khuẩn Bacillus sp. phân lập từ nguồn tương lên men truyền thống.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thanh NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2023
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thanh NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Nguyễn Lan Hương 2. TS.Phạm Tuấn Anh Hà Nội – 2023
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Hà nội, ngày tháng năm 2023 Giáo viên hướng dẫn khoa học Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thanh 1
LỜI CẢM ƠN Sau 5 năm học tập và nghiên cứu thực hiện luận án tại Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách Khoa Hà Nội, dưới sự hướng dẫn, định hướng của cô và thầy hướng dẫn trực tiếp trong suốt quá trình học tập, cùng sự giúp đỡ của tập thể các thầy, cô giáo, các anh, chị, em phụ trách các Bộ môn, Phòng, Ban, các bạn đồng nghiệp và các em sinh viên trong và ngoài trường đã góp phần giúp em hoàn thành luận án này. Em xin chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc tới cô và thầy hướng dẫn trực tiếp đó là PGS. TS. Nguyễn Lan Hương, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách khoa Hà Nội. TS. Phạm Tuấn Anh, Trưởng bộ môn Vi sinh-Hóa sinh-Sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách khoa Hà Nội. Cô và thầy đã hướng dẫn tận tình, thường xuyên theo dõi, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Em xin chân thành cảm ơn đến tập thể thầy, cô giáo, cán bộ thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học, Bộ môn Vi sinh-Hóa sinh-Sinh học phân tử, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học cùng Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách khoa Hà Nội đã đóng góp ý kiến, tạo điều kiện, giúp đỡ em trong suốt quá trình triển khai thí nghiệm thực nghiệm hoàn thành nội dung luận án tại Đại học Bách khoa Hà Nội. Em xin chân thành cảm ơn đến Ban giám hiệu, tập thể các thầy, cô Phòng Sau đại học/Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập, nghiên cứu và bảo vệ luận án. Em xin chân thành cảm ơn đến tập thể Ban lãnh đạo, chỉ huy Học viện Hậu cần và Viện Nghiên cứu KHHC quân sự cùng các đồng nghiệp, tập thể các Phòng, Ban thuộc Học viện Hậu cần đã tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ và động viên em trong quá trình công tác, học tập và nghiên cứu tại Đại học Bách khoa Hà Nội. Em xin chân thành cảm ơn đến lãnh đạo, chỉ huy Đoàn 871, cùng tập thể Phòng Quản lý học viên trong nước, lãnh đạo, chỉ huy Quản lý Hệ 1/Đoàn 871/ Tổng cục Chính trị đã quan tâm, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Đại học Bách khoa Hà Nội. 2
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè đã quan tâm, chia sẻ khó khăn và động viên để em hoàn thành luận án. Trân trọng! Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thanh 3
MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................... 1 LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................... 2 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... 8 DANH MỤC BẢNG .............................................................................................................. 10 DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ ............................................................................................... 11 MỞ ĐẦU ................................................................................................................................. 13 1. Tính cấp thiết của luận án ................................................................................................... 13 2. Mục tiêu của luận án .......................................................................................................... 14 3. Nội dung của luận án .......................................................................................................... 14 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án ....................................................................... 14 5. Những đóng góp mới của luận án .................................................................................... 15 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 16 1.1. Giới thiệu về enzyme thủy phân fibrin .......................................................................... 16 1.1.1. Cơ chế tiêu sợi huyết của enzyme thủy phân fibrin .................................................. 16 1.1.2. Ứng dụng của enzyme thủy phân fibrin ..................................................................... 18 1.1.3. Nguồn thu nhận enzyme thủy phân fibrin .................................................................. 19 1.2. Giới thiệu về Bacillus sp. ................................................................................................ 22 1.2.1. Đặc điểm của Bacillus sp. ............................................................................................ 22 1.2.1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................................................................... 23 1.2.1.2. Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens ...................................................................... 24 1.2.2. Nghiên cứu thu nhận các enzyme thủy phân fibrin được sinh tổng hợp từ Bacillus sp. .............................................................................................................................. 25 1.3. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin bằng đột biến .............. 27 1.3.1. Phương pháp gây đột biến bằng UV ........................................................................... 29 1.3.1.1. Cơ chế gây đột biến UV............................................................................................ 29 1.3.1.2. Nghiên cứu đột biến UV nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn ................................................................................................ 29 1.3.2. Phương pháp gây đột biến bằng hóa chất ................................................................... 31 1.3.2.1. Cơ chế gây đột biến hóa chất EMS và EtBr ........................................................... 31 1.3.2.2. Nghiên cứu đột biến hóa chất EMS và EtBr nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn ................................................................ 32 4
1.4. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin bằng tối ưu môi trường lên men ..................................................................................................................................... 33 1.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin................................................................................. 34 1.4.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin bằng tối ưu môi trường lên men ................................................................................................................. 35 1.5. Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin ................................................... 38 1.5.1. Lên men theo mẻ........................................................................................................... 38 1.5.2. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất ............................................................................. 39 1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng trong lên men .......................................................................... 40 1.6. Sản phẩm enzyme thủy phân fibrin thương mại ........................................................... 42 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................. 44 2.1. Vật liệu .............................................................................................................................. 44 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................... 44 2.1.2. Hóa chất ......................................................................................................................... 44 2.1.3. Thành phần môi trường ................................................................................................ 45 2.1.4. Thiết bị ........................................................................................................................... 46 2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................................. 47 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................................... 47 2.2.2. Phương pháp phân tích ................................................................................................. 48 2.2.2.1. Xác định hoạt độ enzyme.......................................................................................... 48 2.2.2.2. Nhuộm Gram ............................................................................................................. 49 2.2.2.3. Nhuộm bào tử ............................................................................................................ 49 2.2.2.4. Xác định đường khử bằng phương pháp DNS ....................................................... 49 2.2.2.5. Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Bradford ...................... 49 2.2.2.6. Xác định hàm lượng sinh khối khô .......................................................................... 50 2.2.2.7. Đo độ nhớt dịch lên men ........................................................................................... 50 2.2.2.8. Định tính enzyme amylase ....................................................................................... 50 2.2.2.9. Định tính enzyme cellulase....................................................................................... 50 2.2.2.10. Đặc điểm sinh hóa của chủng gốc và chủng đột biến .......................................... 50 2.2.2.11. Tách DNA tổng số và giải trình tự bộ gen của vi khuẩn ................................ 51 2.2.2.12. Xử lý số liệu ............................................................................................................. 52 2.2.3. Phương pháp thí nghiệm .............................................................................................. 53 5
2.2.3.1. Phân lập và sàng lọc chủng....................................................................................... 53 2.2.3.2. Hoạt hóa chủng .......................................................................................................... 53 2.2.3.3. Thu nhận enzyme thủy phân fibrin ngoại bào ........................................................ 53 2.2.3.4. Đột biến chủng vi khuẩn ........................................................................................... 53 2.2.3.5. Kiểm tra độ ổn định của các chủng đột biến ........................................................... 56 2.2.3.6. Khảo sát khả năng tạo bào tử của chủng đột biến .................................................. 57 2.2.3.7. Tối ưu hóa điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng Bacillus sp. .................................................................................................. 57 2.2.3.8. Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật lên men .................................................................... 60 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 63 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao ......................................................................................................................... 63 3.1.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease .............................. 63 3.1.2. Khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng .................................. 65 3.2. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng lựa chọn bằng phương pháp gây đột biến ...................................................................................................... 67 3.2.1. Đột biến bằng tia UV.................................................................................................... 67 3.2.2. Đột biến chủng HY6 bằng hóa chất EtBr ................................................................... 70 3.2.3. Đột biến bằng UV kết hợp hóa chất............................................................................ 71 3.2.3.1. Đột biến chủng U5_90.5 bằng EtBr ........................................................................ 71 3.2.3.2. Đột biến chủng U5_90.5 bằng EMS........................................................................ 72 3.2.3.3. Đột biến chủng E1 (đã đột biến UV và EtBr) bằng EMS ..................................... 73 3.2.3.4. Đột biến chủng U5_90.5 bằng EtBr kết hợp với EMS .......................................... 75 3.2.4. Độ ổn định của các chủng đột biến ............................................................................. 76 3.2.5. Bước đầu tìm hiểu về hệ gen liên quan đến enzyme thủy phân fibrin của chủng HY6 ban đầu và chủng đột biến ES4 .................................................................................... 78 3.3. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng ES4 bằng kỹ thuật lên men ........................................................................................................................... 82 3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp để sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng ES4 ..................................................................................................... 82 3.3.1.1. Nguồn carbon ............................................................................................................. 83 3.3.1.2. Nguồn nitrogen .......................................................................................................... 84 3.3.1.3. Các ion kim loại ......................................................................................................... 86 6
3.3.2. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho khả năng sinh enzyme của chủng................................................................................................................................. 88 3.3.2.1. Nhiệt độ lên men........................................................................................................ 88 3.3.2.2. pH môi trường ban đầu ............................................................................................. 90 3.3.3. Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin . 91 3.3.4. Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin ............ 97 3.3.4.1. Lên men theo mẻ ....................................................................................................... 97 3.3.3.2. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn........................................................ 98 3.3.3.3. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2 giai đoạn...................................................... 100 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 104 KẾT LUẬN ........................................................................................................................... 104 KIẾN NGHỊ........................................................................................................................... 105 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN........................... 106 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 107 PHỤ LỤC............................................................................................................................... 131 7
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng anh Tên tiếng việt BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết thanh bò BN Bắc Ninh CFU Colony-forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc CMC Carboxymethyl cellulose Carboxymethyl xenluloza CTAB Cetyltrimethylammonium Cetyltrimethylammonium bromide bromide cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic DNS 3,5-Dinitrosalicylic acid Axit 3,5-Dinitrosalicylic DO Dissolved Oxygen Oxi hòa tan EDTA Etylenediaminetetraacetic acid Axit etylenediaminetetraacetic EMS Ethyl methanesulfonate Ethyl methanesulfonate EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide FE Fibrinolytic enzyme Enzyme thủy phân fibrin FU Fibrin unit Đơn vị hoạt độ enzyme thủy phân fibrin GĐ Giai đoạn HD Hải Dương HN Hà Nội HP Hải Phòng HY Hưng Yên LB Luria-Bertani Luria-Bertani LM Lên men mPas Milipascal Đơn vị đo độ nhớt động lực NA Nghệ An NTG N-methyl-N-nitro-N- N-methyl-N-nitro-N- nitrosoguanid nitrosoguanid OD Optical density Mật độ quang học PGA Polyglutamic Acid Axit Polyglutamic PT Phú Thọ 8
RAST Rapid Annotations using Chú thích nhanh bằng Công Subsystems Technology nghệ hệ thống phụ/ Hệ thống chú thích chức năng RPM Revolutions per minute Vòng/phút RSM Response surface Phương pháp đáp ứng bề mặt methodolody SK Sinh khối TCA Trichloroacetic acid Axit trichloroacetic t-PA Tissue plasminogen activator Tiền tố kích thích plasminogen Tris-HCl Tris (hydroxymethyl) Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride aminomethane hydrochloride UV Ultra Violet Tia cực tím vvm Thể tích khí/thể tích chất lỏng/phút WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới 9
DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin được phân lập từ nguồn thực phẩm…………………………..… 21 Bảng 1.2. Một số sản phẩm enzyme thủy phân fibrin thương mại……..…... 42 Bảng 2.1. Tổng hợp địa điểm và số lượng các mẫu tương thu thập…...….... 44 Bảng 2.2. Danh mục hóa chất………………………………………..….......... 45 Bảng 2.3. Danh mục các trang thiết bị chính………….……………………... 46 Bảng 2.4. Bảng thiết kế thí nghiệm thống kê tối ưu cho sinh khối và enzyme... 59 Bảng 3. 1. Tổng hợp các mẫu và chủng vi khuẩn phân lập…………………. 63 Bảng 3.2. Kết quả đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn.. 65 Bảng 3.3. Đặc điểm tổ hợp bộ gen của chủng HY6 và ES4……………...…. 78 Bảng 3.4. Các gen thay đổi giữa chủng HY6 và chủng ES4 đột biến ……… 80 Bảng 3.5. Đặc điểm của chủng đột biến ES4 thay đổi so với chủng HY6 gốc ban đầu…………………………………………………………………. 82 Bảng 3.6. Kết quả phân tích ANOVA mô hình bậc hai………..……………. 92 Bảng 3.7. Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm……. 93 Bảng 3.8. Thành phần môi trường tối ưu cho sự tạo sinh khối và hoạt độ enzyme. 96 Bảng 3.9: Tổng hợp kết quả lên men theo mẻ bổ sung cơ chất…………….. 101 10
DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Cơ chế thủy phân fibrin của enzyme…………………………...... 17 Hình 1.2. Nguồn phân lập vi khuẩn sinh enzyme thủy phân fibrin……….. 20 Hình 1.3. Hình ảnh tế bào Bacillus amyloliquefaciens SEM……………..... 24 Hình 1.4. Quá trình ethyl hóa do EMS tạo ra ở vị trí O-6 của guanine và vị trí O-4 của thymine có thể dẫn đến sự bắt cặp sai trực tiếp với thymine và guanine, tương ứng…………………………………………………..……... 31 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu………………………………………………… 47 Hình 2.2. Sơ đồ đột biến chủng bằng tia UV……………………………….. 54 Hình 2.2. Sơ đồ đột biến chủng bằng hóa chất……………………………... 56 Hình 3.1. Tỉ lệ các chủng vi khuẩn phân lập có hoạt tính protease (%)…... 64 Hình 3.2. Kết quả đo đường kính vòng thủy phân sữa gầy của 48 chủng phân lập……………………………………………………………………... 64 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc và tế bào nhuộm gram của chủng HY6 soi kính hiển vi trên vật kính dầu 100x………………………………….. …..... 67 Hình 3.4. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng sau đột biến bằng tia UV. ………………………………………………………………… 69 Hình 3.5. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng đột biến bằng EtBr... 70 Hình 3.6. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến bằng EtBr từ chủng U5_90.5……………………………..………………… 72 Hình 3.7. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến bằng EMS từ chủng U5_90.5………………….…………...……………….. 73 Hình 3.8. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến bằng EMS từ chủng E1……………………………………………...……… 74 Hình 3.9. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến bằng EtBr kết hợp EMS …............................................................................. 75 Hình 3.10. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng qua 10 lần cấy chuyển. 77 Hình 3.11. Kết quả chạy RAST chủng HY6…………………………….. 79 Hình 3.12. Kết quả chạy RAST chủng ES4……………………………... 79 11
Hình 3.13. Ảnh hưởng của nguồn carbon…………………………………... 83 Hình 3.14. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen………………...………………. 85 Hình 3.15. Ảnh hưởng của các ion kim loại…………...…………………… 87 Hình 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy……………………………..... 89 Hình 3.17. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu………………………... 90 Hình 3.18. Hệ số ảnh hưởng của phương trình hồi quy bậc hai đối với mật độ tế bào và hoạt độ enzyme thủy phân fibrin……………..……………...... 94 Hình 3.19. Bề mặt đáp ứng cho hàm mật độ tế bào và hàm hoạt độ enzyme. 95 Hình 3.20. Động học quá trình lên men theo mẻ ………………….……….. 97 Hình 3.21. Động học của quá trình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn 99 Hình 3.22. Động học của quá trình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2 giai đoạn 101 12
MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA LUẬN ÁN Các bệnh tim mạch (CVD) là một trong những nguyên nhân dẫn đến tử vong ở người và theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã xác định có 17,9 triệu ca tử vong mỗi năm do CVD, ước tính chiếm 31% số ca tử vong trên toàn cầu. Các bệnh rối loạn tim mạch như nhồi máu cơ tim cấp tính, tắc mạch và đột quỵ chủ yếu là do sự tích tụ quá nhiều fibrin trong mạch máu tạo thành huyết khối. Việc sử dụng thuốc chống đông máu, thuốc chống kết dính tiểu cầu, phẫu thuật và enzyme thủy phân fibrin để làm tan cục máu đông đã cải thiện được tình trạng huyết khối. Các enzyme thủy phân fibrin được thu nhận từ các chủng vi sinh vật trở thành nguồn sản xuất các enzyme thủy phân fibrin dễ tiếp cận hơn, rẻ hơn và các enzyme này có thể làm tan được huyết khối có trong máu. Ngày nay, enzyme thủy phân fibrin được quan tâm và nghiên cứu ứng dụng trong hỗ trợ điều trị bệnh liên quan đến huyết khối, tắc nghẽn mạch máu và đột quỵ. Ngoài ra, enzyme thủy phân fibrin còn được chứng minh là có tác dụng bảo vệ chống lại bệnh tăng huyết áp, bệnh Alzheimer và xơ vữa động mạch. Do đó, enzyme thủy phân fibrin được coi là một enzyme làm tan huyết khối hiệu quả, an toàn và kinh tế. Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin được phân lập chủ yếu từ các nguồn thực phẩm lên men, trong đó có nguồn thực phẩm lên men từ đậu tương được quan tâm nghiên cứu để thu nhận enzyme là chủ yếu, các chủng vi khuẩn phân lập được thuộc chi Bacillus như B. subtilis, B. amyloliquefaciens thường chiếm đa số và được cho là an toàn. Tuy nhiên các chủng phân lập thường cho hoạt lực enzyme thấp, việc nghiên cứu để tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn cho năng suất và hiệu quả cao đến nay vẫn đang là một trong những vấn đề được quan tâm hướng tới ứng dụng trong quá trình lên men công nghiệp sản xuất sản phẩm thương mại. Trước nhu cầu về sử dụng enzyme thủy phân fibrin ngày càng tăng trong các lĩnh vực y dược và thực phẩm bổ sung, việc mở rộng nghiên cứu tăng cường cải thiện hoạt độ của enzyme cũng như nâng cao sản lượng thông qua việc cải tiến chủng, tối ưu môi trường và lựa chọn kỹ thuật lên men phù hợp để tăng hiệu quả và năng suất góp phần giảm chi phí sản xuất là rất cần thiết. Ngoài việc lựa chọn 13
phương pháp lên men phù hợp và tối ưu hóa thành phần môi trường lên men cho từng chủng cụ thể thì việc nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn được coi là một trong những cách đem lại hiệu quả cao, nhất là ứng dụng trong sản xuất quy mô công nghiệp. Vì vậy, tác giả đã tiến hành “Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens” được phân lập từ nguồn tương lên men truyền thống của Việt Nam. 2. MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN Tuyển chọn và nâng cao được khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của vi khuẩn Bacillus sp. phân lập từ nguồn tương lên men truyền thống. 3. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN 1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao. Định danh tên chủng bằng phương pháp giải trình tự gen. 2. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng bằng phương pháp đột biến dùng tia UV kết hợp hóa chất EtBr và EMS. 3. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng bằng kỹ thuật lên men theo mẻ bổ sung cơ chất. 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN 1. Về ý nghĩa khoa học Đã phân lập và tuyển chọn được chủng Bacillus amyloliquefaciens HY6 từ tường Bần, Hưng Yên và cải biến thành chủng đột biến ES4 có khả năng sinh enzyme thủy phân fibrin. Chứng minh được việc nâng cao khả năng sinh tổng enzyme thủy phân fibrin của chủng bằng cách tạo đột biến sử dụng kết hợp tia UV với hóa chất EtBr và EMS. Đã nâng cao được khả năng sinh enzyme thủy phân fibrin bằng cách thiết lập được kỹ thuật lên men theo mẻ bổ sung cơ chất hai giai đoạn đối với chủng đột biến ES4. 2. Về ý nghĩa thực tiễn Bổ sung vào bộ sưu tập giống các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao. 14
Kết quả là cơ sở khoa học để nghiên cứu mở rộng quy mô sản xuất enzyme thủy phân fibrin nhằm tạo sản phẩm nhằm ứng dụng hỗ trợ phòng ngừa và điều trị bệnh liên quan đến huyết khối ở Việt Nam. 5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Là nghiên cứu đầu tiên có tính hệ thống về phân lập, tuyển chọn, tạo chủng vi khuẩn đột biến, xác định điều kiện lên men nhằm thu enzyme thủy phân fibrin từ chủng B. amyloliquefaciens HY6 có nguồn gốc từ tương Bần, Hưng Yên. 2. Đã tạo được chủng đột biến B. amyloliquefaciens ES4 sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao hơn so với chủng đã phân lập bằng kỹ thuật sử dụng kết hợp đột biến tia UV với hóa chất EMS và EtBr. 3. Đã nâng cao được khả năng sinh enzyme thủy phân bằng cách thiết lập kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất hai giai đoạn trên thiết bị lên men 2 lít. 15
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN Enzyme thủy phân fibrin hay còn gọi là enzyme tiêu sợi huyết, được phân lập đầu tiên năm 1987 từ thực phẩm lên men truyền thống “natto” của Nhật Bản bởi Sumi [1]. Hầu hết các enzyme thủy phân fibrin thuộc họ protease subtilisin [2] và được sinh tổng hợp bởi chủng vi khuẩn Bacillus sp., các chủng vi khuẩn Bacillus sp. được phân lập chủ yếu từ các nguồn thực phẩm lên men, trong đó có nguồn đậu tương lên men truyền thống. Enzyme thủy phân fibrin đã được nghiên cứu thu nhận ở các nước như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Thái Lan, trong đó cũng có Việt nam. Một loạt các enzyme thủy phân fibrin đã được báo cáo thu nhận được từ chi Bacillus khác nhau về đặc tính của chúng như trọng lượng phân tử từ 20 - 60 KDa [3-23], tính đặc hiệu của cơ chất, có khả năng trở thành tác nhân làm tan huyết khối tác động trực tiếp, hiệu quả về mặt chi phí và có thể sử dụng bằng đường uống [24, 25]. Gần đây, các enzyme thủy phân fibrin do vi sinh vật tổng hợp đã thu hút được nhiều sự chú ý hơn so với các chất tiêu sợi huyết thông thường trong điều trị huyết khối. Các loài Bacillus sp. có tiềm năng rất lớn để tiết ra nhiều loại protease và hầu hết chúng đều có khả năng thủy phân fibrin. Vì vậy, việc phân lập tìm kiếm các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin có đặc tính mới vẫn được quan tâm đến nay. 1.1.1. Cơ chế tiêu sợi huyết của enzyme thủy phân fibrin Enzyme thủy phân fibrin vốn sẵn có trong cơ thể bao gồm t-PA (tissue plasminogen activators), urokinase, đây là những chất hoạt hóa plasminogen, có tác dụng chuyển plasminogen không hoạt động thành plasmin hoạt động và thủy phân fibrin. Các enzyme thủy phân fibrin, Streptokinase và Staphylokinase từ các nguồn vi khuẩn cũng thuộc loại chất kích hoạt plasminogen này. Enzyme thủy phân fibrin có thể hỗ trợ làm tan các sợi huyết trong cơ thể [26], giúp máu lưu thông tốt bằng cách phá vỡ các protein fibrin trong máu, thúc đẩy và tăng cường lưu lượng máu khỏe mạnh theo cơ chế như Hình 1.1. Fibrin thường được hình thành từ fibrinogen do tác dụng của thrombin (EC 3.4.21.5), bị cắt bởi plasmin (EC 3.4.21.7), plasmin được kích hoạt từ plasminogen bởi chất hoạt hóa plasminogen mô. Trong điều kiện cân bằng, các cục máu đông có chứa các sợi fibrin được thủy phân 16
bởi plasmin để tránh huyết khối trong mạch máu. Tuy nhiên, trong một số trường hợp các sợi fibrin không bị thủy phân, lắng đọng trong mạch máu dẫn đến hiện tượng làm tăng huyết khối và một số bệnh khác liên quan đến tim mạch như huyết áp cao, nhồi máu cơ tim cấp, bệnh mạch máu ngoại biên [25]. Các cục máu đông bất thường cũng là nguyên nhân gây ra các cơn đau tim và đột quỵ, và một số tình trạng như viêm tĩnh mạch, tắc mạch phổi hoặc huyết khối tĩnh mạch sâu [27, 28]. Việc nhanh chóng làm tan cục máu đông và tái lập lưu lượng máu là rất quan trọng để điều trị bệnh huyết khối hiệu quả. Enzyme thủy phân fibrin được cho là nguồn hứa hẹn nhất để điều trị lâm sàng chứng huyết khối. Các enzyme thủy phân fibrin có khả năng cắt bỏ chất ức chế hoạt hóa plasminogen, kích hoạt pro-urokinase và chất kích hoạt plasminogen mô (t-PA), hỗ trợ hoạt động tiêu sợi huyết của plasmin, góp phần duy trì lưu lượng máu thích hợp, ngăn ngừa cục máu đông [29]. Hình 1.1. Cơ chế thủy phân fibrin của enzyme [29] Các chất tan huyết khối như t-PA và Urokinase được sử dụng phổ biến nhưng giá thành cao và có tác dụng phụ không mong muốn [30]. Do đó, việc nỗ lực tìm kiếm các tác nhân tan huyết khối an toàn hơn và ít tốn kém hơn từ các nguồn 17
khác nhau để có thể thay thế, trong đó có các enzyme thủy phân fibrin được sinh tổng hợp từ vi sinh vật. Các enzyme thủy phân fibrin được thu nhận từ nguồn vi sinh vật được cho là an toàn hơn cho người sử dụng, các enzyme thủy phân fibrin đã và đang được quan tâm nghiên cứu thu nhận ứng dụng trong lâm sàng, dược phẩm, thực phẩm hiện nay [31, 32]. 1.1.2. Ứng dụng của enzyme thủy phân fibrin Một số báo cáo chỉ ra, các enzyme thủy phân fibrin không chỉ làm suy giảm fibrin trực tiếp mà còn làm tăng sự giải phóng chất hoạt hóa plasminogen mô từ các tế bào để làm suy giảm fibrin [33, 34]. Các enzyme thủy phân fibrin có tác dụng kích hoạt các chất hòa tan cục máu đông bao gồm plasmin và pro-urokinase có trong cơ thể, làm bất hoạt chất ức chế hoạt hóa plasminogen và ức chế kết tập tiểu cầu bằng cách ngăn chặn sự hình thành thromboxane [35]. Do đó, các enzyme thủy phân fibrin hiện được coi là một enzyme hiệu quả, an toàn và là trọng tâm của nghiên cứu thuốc tan huyết khối [36]. Các enzyme thủy phân fibrin được cho là an toàn, thuận tiện, hiệu quả và được khẳng định có tác dụng phòng ngừa, có hoạt động ly giải huyết khối lớn gấp 4 lần so với plasmin, chất có sẵn trong cơ thể chống lại cục máu đông [35, 37]. Vì vậy, các enzyme thủy phân fibrin ngày càng được quan tâm và nghiên cứu ứng dụng trong điều trị và phòng ngừa bệnh như: - Các enzyme thủy phân fibrin có khả năng hòa tan cục máu đông và ngăn ngừa sự kết tụ của các tế bào hồng cầu. Do vậy, có khả năng hỗ trợ hệ thống làm sạch tuần hoàn của cơ thể. - Các enzyme thủy phân fibrin giúp tăng cường sản xuất plasmin của cơ thể. Do vậy có thể hỗ trợ ngăn ngừa các bênh xơ cứng động mạnh và động mạch thu hẹp. - Các enzyme thủy phân fibrin còn được coi là tác nhân tiêu sợi huyết lý tưởng không chỉ làm tan cục máu đông mà còn ngăn chặn chúng và điều chỉnh quá trình đông máu theo cách tái lập cân bằng nội mô. - Các enzyme này có độ an toàn trong sinh học nên được ứng dụng như các hạt tổng hợp mới được chỉ định để ức chế huyết khối liên quan đến cấy ghép [38], điều trị thủy tinh thể dược lý ở những bệnh nhân bị rối loạn tăng sinh tế bào. 18