Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:146

Thêm vào BST

Báo xấu

60
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học "Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học" trình bày các nội dung chính sau: Xây dựng quy trình lên men sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se; Đánh giá một số hoạt tính sinh học của các hoạt chất chứa Se từ sinh khối nấm C. sinensis giàu Se.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Quốc Phong NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Quốc Phong NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TSKH. Ngô Kế Sương TP Hồ Chí Minh – Năm 2021
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chương trình Nghiên cứu sinh và Luận án Tiến sĩ, tôi đã nhận được sự quan tâm, chia sẻ, hỗ trợ của rất nhiều thầy cô, anh chị, các bạn bè cùng khoá, đồng nghiệp tại các đơn vị. Xin trân trọng cám ơn PGS.TSKH Ngô Kế Sương, người thầy đáng kính đã luôn động viên, hướng dẫn, góp ý kiến để tôi hoàn thiện Luận án. Trân trọng cám ơn TS. Đinh Minh Hiệp đã hỗ trợ, giúp đỡ, chia sẻ trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Xin trân trọng cám ơn các thầy cô giáo của Viện Sinh học Nhiệt đới, Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức, góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Trân trọng cám ơn các bạn trong nhóm nghiên cứu (TS. Trần Minh Trang, ThS. Nguyễn Tài Hoàng) đã dành nhiều tâm huyết, thời gian, hỗ trợ tôi hoàn thành Luận án. Trân trọng cám ơn Trung ương Đoàn TNCS Hồ Chí Minh, cơ quan tôi công tác trong suốt thời gian thực hiện Luận án, đã chia sẻ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình học tập và nghiên cứu. Và cuối cùng, tôi xin dành tình cảm, sự biết ơn đối với gia đình, những người luôn mong mỏi, âm thầm quan tâm, động viên, khích lệ để tôi hoàn thành Luận án. Trân trọng cám ơn.
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong Luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Người thực hiện Lê Quốc Phong
MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................... i DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................v DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ vii MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................3 1.1. Nấm Cordyceps sinensis ..................................................................................3 1.1.1. Đặc điểm, phân bố ......................................................................................3 1.1.2. Hoạt tính sinh học .......................................................................................4 1.2. Selen và vai trò sinh học của selen ..................................................................6 1.2.1. Nguồn selen hiện nay .................................................................................6 1.2.2. Vai trò của selen đối với cơ thể ..................................................................7 1.2.3. Con đường chuyển hóa selen ở nấm.........................................................11 1.3. Nuôi trồng nấm Cordyceps ............................................................................13 1.3.1 Nuôi trồng Cordyceps................................................................................13 1.3.2. Các nghiên cứu về nuôi cấy Cordyceps bổ sung selen .............................15 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................17 2.1. Vật liệu ...........................................................................................................17 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................17 2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................17 2.1.3. Thiết bị ......................................................................................................17 2.2. Nội dung nghiên cứu......................................................................................18 2.3. Địa điểm và thời gian thực hiện .....................................................................18 2.3.1. Địa điểm thực hiện: ..................................................................................18 2.3.2. Thời gian thực hiện ...................................................................................18 2.4. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................18 2.4.1. Chuẩn bị giống..........................................................................................18
2.4.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C. sinensis trên môi trường PGA và môi trường lỏng PS ......................................................................................................18 2.4.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C. sinensis trên môi trường PGA .......................................................................................................................18 2.4.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C. sinensis trên môi trường lỏng PS ..................................................................................................................19 2.4.3 Phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến .................................................19 2.4.4. Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy Cordyceps sinensis trên môi trường lỏng bổ sung selen .....................................................................................20 2.4.3.1. Sàng lọc thành phần môi trường bằng Plackett – Burman ..............20 2.4.3.2. Tối ưu hóa thành phần môi trường bổ sung selen bằng mô hình đáp ứng bề mặt Box -Behnken.............................................................................21 2.4.3.3. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng mô hình đáp ứng bề mặt D- optimal...........................................................................................................23 2.4.5. Phương pháp thu nhận cao chiết...............................................................24 2.4.5.1. Cao chiết tổng ..................................................................................24 2.4.5.2. Cao chiết phân đoạn .........................................................................25 2.4.5.3. Cao chiết CPS ..................................................................................25 2.4.5.4. Thu nhận EPS...................................................................................25 2.4.5.5. Thu nhận IPS ....................................................................................26 2.4.6. Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết.................................................26 2.4.6.1. Khả năng bắt gốc tự do ABTS .........................................................26 2.4.6.2. Khả năng bắt gốc tự do DPPH .........................................................26 2.4.6.3. Xác định năng lực khử .....................................................................27 2.4.6.4. Xác định khả năng bảo vệ DNA ......................................................27 2.4.6.5. Hoạt tính ức chế xanthine oxidase ...................................................27 2.4.6.6. Đánh giá hoạt tính kháng viêm ........................................................28
2.4.6.7. Hoạt tính ức chế α-glucosidase ........................................................28 2.4.6.8. Khảo sát khả năng gây độc tế bào ....................................................28 2.7. Định lượng selen trong nấm Cordyceps sinensis...........................................29 2.7.1. Phân tích selen tổng ..................................................................................29 2.7.2. Phân tích selen nguyên dạng ....................................................................29 2.7.3. Phân tích FT-IR ........................................................................................30 2.8. Thử nghiệm độc tính cấp của sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen 30 2.9. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................30 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..............................................................31 3.1 Về ảnh hưởng của selen đến sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis ........31 3.1.1 Ảnh hưởng của selen đến sự phát triển của tơ nấm Cordyceps sinensis ...31 3.1.2 Ảnh hưởng của selen đến sản xuất sinh khối của nấm Cordyceps sinensis ...............................................................................................................................33 3.1.3 Về nâng cao khả năng phát triển và sản xuất sinh khối của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường bổ sung selenate bằng phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến ...................................................................................................................36 3.2 Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy để nâng cao chuyển hóa selen trong sinh khối nấm Cordyceps sinensis ...............................................................41 3.2.1 Sàng lọc các thành phần môi trường ảnh hưởng đến sự sản xuất sinh khối và tích lũy selen của nấm Cordyceps sinensis ......................................................41 3.2.2 Tối ưu hóa thành phần môi trường ............................................................48 3.2.3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy ...................................................................52 3.2.4 Thảo luận ...................................................................................................57 3.3 Xác định thành phần hoạt chất và dạng selen chuyển hóa trong nấm Cordyceps sinensis ..................................................................................................................60 3.3.1 Thu nhận cao chiết từ sinh khối nấm và dịch nuôi cấy .............................60 3.3.2. Hàm lượng selen trong cao chiết ..............................................................61 3.3.3 Sự hiện diện của selen trong các cao chiết chứa polysaccharide ..............62 3.4 Về hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps sinensis giàu selen .......................64
3.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa ............................................................................64 3.4.1.1. Hoạt tính bắt gốc tự do ABTS .........................................................64 3.4.1.2. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH .........................................................66 3.4.1.3. Hoạt tính kháng oxy hóa thông qua năng lực khử ...........................67 3.4.1.4. Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bảo vệ tính nguyên vẹn của DNA........................................................................................................68 3.4.2. Khả năng ức chế xanthine oxidase ...........................................................69 3.4.3. Hoạt tính kháng viêm in vitro ...................................................................70 3.4.4. Hoạt tính ức chế α–glucosidase ................................................................72 3.4.5. Hoạt tính ức chế tăng sinh của tế bào ung thư..........................................73 3.4.6 Thảo luận chung về hoạt tính sinh học ......................................................76 3.5 Đề xuất quy trình nuôi cấy sản xuất nấm Cordyceps sinensis giàu selen ......81 3.5.1 Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm ..........................................81 3.5.2. Đánh giá độc tính cấp của sinh khối C. sinensis giàu Se trên chuột ........83 3.5.3 Đánh giá các chỉ tiêu an toàn thực phẩm ...................................................84 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................89 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .........................................................90 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .........................................................91 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................93 PHỤ LỤC ................................................................................................................104
i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt ABTS 2,2 - azinobis - (3- 2,2 - azinobis - (3- ethylbenzothiazoline - 6 - ethylbenzothiazoline - 6 - sulphonate) sulphonate) apoER2 apolipoprotein E receptor 2 apolipoprotein E receptor 2 BuOH Butanol Butanol BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bê CPT Camptothecin Camptothecin DCF 2’,7’-dichlorofluorescein 2’,7’-dichlorofluorescein DCFH Dichlorodihyddrofluorescein Dichlorodihyddrofluorescein DCFH-DA Dichloro-Dihydro- Dichloro-Dihydro- Fluorescein Fluorescein Diacetate Diacetate DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic acid DPPH 2,2 - diphenyl - 1 - 2,2 - diphenyl - 1 - picrylhydrazyl picrylhydrazyl ĐC Đối chứng EPS Exopolysaccharide Polysaccharide ngoại bào EtOAc Ethylacetate Ethylacetate EtOH Ethanol Ethanol FT-IR Fourier-transform infrared Quang phổ hồng ngoại spectroscopy
ii Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt Hep G2 Liver hepatocellular Tế bào ung thư gan Hep G2 carcinoma IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% ICP-MS Inductively coupled plasma Khối phổ plasma ghép cảm ứng Mass spectrometry Jurkat Jurkat Cell Line Dòng tế bào Jurkat IPS Intrapolysacharide Polysaccharide nội bào MeOH Methanol Metanol MT Môi trường MCF-7 Breast cancer cell line Tế bào ung thư vú NK cells Natural Killer cells Tế bào sát thủ tự nhiên NT Nghiệm thức nrSSU và The partial small subunit of Tiểu đơn vị nhỏ và tiểu đơn vị lớn dnrLSU rDNA (nrSSU) and the partial large subunit of rDNA (nrLSU) OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate buffer saline Đệm PBS PE Petroleum ether Ete dầu hỏa PGA Potato glucose agar Môi trường PGA PG Potato glucose Môi trường PG PS Môi trường PS PTN Phòng thí nghiệm ROS Reactive oxygen species Gốc oxy hóa
iii Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt RNI Recommended Nutrition Lượng dùng khuyến cáo hàng Intakes ngày cho người SOD Superoxide dismutase Superoxide dismutase SRB Sulforhodamin B assay Thử nghiệm độc tính SRB Se-EPS Seleno-exopolysaccharide Seleno-exopolysaccharide Se-IPS Seleno-intracellular Seleno-intracellular polysaccharide polysaccharide Se-Pr Seleno-protein Seleno-protein SeNPs Selenium nanoparticles Hạt nano selen Sul1p/Sul2p Kênh vận chuyển Sul1p/Sul2p MMP-2 Matrix Metalloproteinase-2 Matrix Metalloproteinase-2 MMP-9 Matrix Metalloproteinase -9 Matrix Metalloproteinase -9 uPA Urokinase-type plasminogen Urokinase-type plasminogen activator activator MAPK Mitogen-activated protein Mitogen-activated protein kinas kinas PDGF/ERK Platelet-derived growth Platelet-derived growth factor/Extracellular signal- factor/Extracellular signal- regulated kinase regulated kinase TGF-β1 Transforming growth factor Transforming growth factor beta 1 beta 1 ROS Reactive oxygen species Các chất oxy hóa mạnh PKA protein kinase A protein kinase A PKC protein kinase C protein kinase C
iv Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt TRAP The trp RNA-binding The trp RNA-binding attenuation attenuation protein protein T CD4+ T helper cells Tế bào hỗ trợ T IFNγ Interferon gamma Interferon gamma XO Xanthine oxidase Xanthine oxidase
v DANH MỤC HÌNH C. sinensis ngoài tự nhiên ...........................................................................3 Một số cấu trúc của seleno-đường .............................................................8 Sơ đồ chuỗi phản ứng giữa selente và glutathione ......................................8 Con đường biến dưỡng chuyển hóa thành những dạng hợp chất Se khác nhau ở Saccharomyces cerevisiae .............................................................................12 (A) Sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường PGA bổ sung selenite và selenate từ 0 đến 40 mgSe/L ở thời điểm 15 ngày. (B) Đường kính lan tơ của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường PDA có bổ sung selen từ 0 đến 40 mgSe/L sau 15 ngày. .................................................................................................32 (A) Sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường lỏng có bổ sung selenite và selenate ở nồng độ 30 mgSe/L sau 40 ngày. (B) Sinh khối nấm Cordyceps sinensis trên môi trường lỏng bổ sung selen từ 0 – 30 mgSe/L sau 40 ngày. Ba nguồn selen tương ứng là selenite, selenate và selenoure. ..................................35 (A) So sánh sự sản xuất sinh khối (cột) và hấp thụ selen (đường gạch nối) bởi nấm Cordyceps sinensis giữa hai phương pháp nuôi cấy truyền thống và cải tiến sau 40 ngày. (B) Hình thái sợi nấm phát triển trên môi trường thạch sau 14 ngày và (C) sự sản xuất sinh khối của nấm trên môi trường lỏng theo các nghiệm thức tương ứng sau 40 ngày.........................................................................................................37 So sánh hàm lượng các hợp chất chứa selen (µg/g) trong sinh khối nấm được nuôi bằng phương pháp truyền thống (PP1) và phương pháp cải tiến (PP2) ..39 Bề mặt đáp ứng của sinh khối nấm Cordyceps sinensis theo hai yếu tố ...51 Bề mặt đáp ứng của sinh khối C. sinensis theo hai yếu tố ........................55 So sánh hiệu suất chiết cao (%) giữa sinh khối nấm giàu selen (Se) và sinh khối nấm đối chứng không có selen (ĐC) ................................................................61 Hàm lượng selen trong các cao chiết từ nấm nuôi trên môi trường bổ sung selen ...............................................................................................................62 Kết quả phân tích FTIR của các hợp chất Se-EPS, Se-IPS .......................64
vi Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bắt gốc tự do ABTS .........65 Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bắt gốc tự do DPPH .........67 Kết quả bảo vệ DNA của các mẫu cao chiết ..........................................69 Hoạt tính kháng viêm dựa trên khả năng bảo vệ sự biến tính albumin bởi nhiệt độ ...........................................................................................................71 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư MCF7 ................................................74 Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết trên tế bào fibroblast...........76 Quy trình công nghệ nuôi cấy nấm C. sinensis giàu Se ..........................86
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps sinensis .........................................5 Bảng 1.2. Lượng Se cần thiết cho cơ thể hàng ngày .................................................10 Bảng 1.3. Một số thành phần môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps .........................14 Bảng 2.1. Các biến trong ma trận Plackett-Burman..................................................21 Bảng 2.2. Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman ........................................21 Bảng 2.3. Nồng độ các yếu tố sử dụng trong Box – Behnken ..............................22 Bảng 2.4. Thiết kế Box - Behnken ............................................................................22 Bảng 2.5. Thiết kế Box – Behnken ...........................................................................24 Bảng 2.6. Mức khảo sát của các yếu tố sử dụng trong D-optimal ............................24 Bảng 3.1. Trọng lượng sinh khối nấm của các nghiệm thức theo Plackett – Burman .. ...............................................................................................................44 Bảng 3.2. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình ..................................................45 Bảng 3.3. Lượng Se tổng trong sinh khối của các nghiệm thức theo Plackett - Burman ...............................................................................................................47 Bảng 3.4. Phân tích ANOVA về mức độ ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến lượng Se tổng trong sinh khối nấm......................................................................................48 Bảng 3.5. Sản lượng sinh khối nấm Cordyceps sinensis (g/L) của các nghiệm thức theo Box – Behnken. .................................................................................................49 Bảng 3.6. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình Box – Behnken ........................50 Bảng 3.7. Trọng lượng sinh khối C. sinensis ở các nghiệm thức theo D-optimal ....53 Bảng 3.8. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình D-optimal ................................54 Bảng 3.9. Hàm lượng Se ở các nghiệm thức (µg/g)..................................................55 Bảng 3.10. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình D-optimal ..............................56 Bảng 3.11. So sánh kết quả một số nghiên cứu về thành phần môi trường ..............58 Bảng 3.12. Giá trị ∆OD của các cao chiết tại nồng độ 2000µg/mL..........................68
viii Bảng 3.13. Giá trị IC50 trong khảo sát khả năng ức chế XO của một số cao chiết từ sinh khối nấm C. sinensis ..........................................................................................70 Bảng 3.14. Phần trăm ức chế α - glucosidase ở nấm C. sinensis ..............................73 Bảng 3.15. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Jurkat của các mẫu cao chiết tại nồng độ thử nghiệm 100g/mL...............................................................................................75 Bảng 3.16. Thành phần hoạt chất trong sinh khối nấm C. sinensis giàu selen .........82 Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống của sinh khối nấm ..............83 Bảng 3.18. Khối lượng (g) của chuột nhắt trên mô hình độc tính cấp ......................84 Bảng 3.19. Phân loại cấp độ độc dựa vào LD50 ........................................................84 Bảng 3.20. Các chỉ tiêu an toàn thực phẩm của nấm C. sinensis giàu Se .................85
1 MỞ ĐẦU Nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps sinensis (đồng tên: Ophiocordyceps sinensis) là loài nấm dược liệu quý được sử dụng phổ biến trong Y học cổ truyền Trung Hoa. Adenosine và cordycepin là hai dược chất quý được xem là chất chỉ thị về hoạt tính sinh học quan trọng cho loài nấm này. Các nghiên cứu hiện đại chứng minh các hoạt chất từ C. sinensis có khả năng tăng cường miễn dịch, chống lão hóa, kháng viêm, kháng ung thư và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến phổi, thận, và các bệnh mạn tính khác như đái tháo đường. Hiện nay, C. sinensis tự nhiên ngày càng hiếm do việc khai thác quá mức đi kèm với biến đổi khí hậu. Do đó, nghiên cứu nuôi cấy nhân tạo loại nấm quý này nhận được nhiều quan tâm trong vài thập kỷ qua. Sử dụng môi trường bán rắn tạo quả thể và môi trường lỏng nhân thu sinh khối loài nấm này là hai hướng tiếp cận phổ biến. Trong đó, nhân nuôi sinh khối nấm mang tính ứng dụng thực tiễn cao vì công nghệ này không chỉ sản xuất sinh khối nấm có thành phần các hoạt chất tương tự như tự nhiên, mà còn có thể triển khai sản xuất ở quy mô công nghiệp trong thời gian ngắn cùng với chi phí thấp hơn so với kỹ thuật nuôi cấy quả thể. Nhiều phương pháp nuôi cấy lỏng cải tiến được thử nghiệm để nâng cao giá trị hoạt chất và hoạt tính sinh học của sinh khối nấm C. sinensis. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguyên tố khoáng vi lượng đến khả năng sản xuất sinh khối và các hợp chất thứ cấp là một chủ đề nhận được nhiều quan tâm hiện nay. Trong đó, selen (Se) được xem là một tiền chất đầy tiềm năng trong việc nâng cao dược tính sinh học của nấm Đông trùng Hạ thảo này. Hơn thế nữa, Se là thành phần của acid amin 21 gọi là selenocysteine. Nguyên tố này còn tham gia vào cấu trúc của nhiều enzyme kháng oxy hóa như glutathione peroxidase, iodothyronine deiodinases và thioredoxin reductase có chức năng sinh lý quan trọng như kháng oxy hóa, kháng ung thư, tăng cường miễn dịch, ức chế HIV và chống lão hóa. Sự tham gia của Se trong hệ thống miễn dịch có thể được kết hợp với một số cơ chế, bao gồm cả các hoạt động gia tăng sản xuất tế bào miễn dịch NK (Natural killer cell), các tế bào lympho T, lympho B, interferon C và làm thụ thể có ái lực cao với interleukin-2, kích thích miễn dịch do vắc-xin gây ra. Bên cạnh đó, Se còn có vai trò quan trọng trong chuyển hóa iốt, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng
2 độ Se trong huyết thanh ở những trẻ bị bướu cổ thường thấp hơn so với trẻ có kích thước tuyến giáp bình thường. Như vậy, sự thiếu hụt Se có thể tác động xấu đến sức khỏe. Mặc dù nước ta có một số dược liệu chứa Se như: tỏi, nấm linh chi và quả nhàu nhưng hàm lượng Se trong các loại dược liệu này thường thấp và không ổn định. Từ năm 2003 – 2005, Bộ Y tế khuyến khích và định hướng những nghiên cứu sản xuất Se hữu cơ có khả dụng sinh học cao. Đề án “Chiến lược quốc gia về dinh dưỡng giai đoạn 2011-2020 và tầm nhìn đến năm 2030” (689/TH ngày 29/6/2011) nhấn mạnh phòng chống thiếu vi chất dinh dưỡng hiện nay, trong đó có liên quan đến Se. Chính vì lẽ đó, đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học” được thực hiện với: Mục tiêu tổng quát của nghiên cứu: Sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học được cải thiện và tạo nguồn Se có khả dụng sinh học cao. Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu: (1) Xây dựng quy trình lên men sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se. (2) Đánh giá một số hoạt tính sinh học của các hoạt chất chứa Se từ sinh khối nấm C. sinensis giàu Se. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của Se đến sự sản xuất sinh khối và hoạt tính sinh học của sinh khối nấm Cordyceps sinensis, khả năng tích lũy Se trong sinh khối nấm. Đồng thời, công trình này sẽ giúp hiểu rõ thêm các dạng Se hữu cơ trong nấm. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả tạo tiền đề cơ sở kỹ thuật nhằm chuyển giao công nghệ để sản xuất và ứng dụng sinh khối C. sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học cao trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm bổ sung, bảo vệ sức khỏe.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Nấm Cordyceps sinensis 1.1.1. Đặc điểm, phân bố Cordyceps sinensis là loài nấm kí sinh trên ấu trùng loài bướm đêm Thitarodes (Hepialus) armoricanus thuộc họ Hepialidae sống dưới đất (hình 1.1) [1]. Đây là loài nấm đặc hữu của vùng cao nguyên Tây Tạng và các vùng đồng cỏ núi cao xung quanh khu vực dãy Himalaya như Bhutan, Trung Quốc và Nepal ở độ cao 3500-5000 m so với mực nước biển [2]. Giá trị dược liệu của loài nấm này đã được ghi nhận cách đây 2000 năm ở Trung Quốc cũng như các nước phương Đông với những tác dụng như cải thiện chức năng gan thận, chữa đổ mồ hôi đêm, bệnh tiểu đường, máu nhiễm mỡ, các bệnh về tim, hồi phục sức khỏe, tăng tuổi thọ và nâng cao thể trạng cơ thể [3] [4]. C. sinensis ngoài tự nhiên. Hình có nguồn gốc từ công bố của Shrestha và cộng sự (2013) [5] Đến năm 2007, Sung và cộng sự đã tiến hành phân tích mối quan hệ giữa 162 loài Cordyceps bằng việc phân tích 5 - 7 locus bao gồm ribosome tiểu phần nhỏ và tiểu phần lớn (nrSSU và dnrLSU), nhân tố kéo dài 1α (tef1), hai tiểu đơn vị lớn nhất của RNA polymerase II (rpb1 và rpb2), β-tubulin (tub) và ti thể ATP6 (atp6) và xếp Cordyceps sinensis vào chi Ophiocordyceps và đổi tên là Ophiocordyceps sinensis
4 [6], tuy là cùng tên song C. sinensis vẫn được sử dụng phổ biến trong giới khoa học hiện nay. 1.1.2. Hoạt tính sinh học Với sự phát triển của khoa học hiện nay, người ta đã tìm ra được những hợp chất có trong nấm C. sinensis. Chính những hoạt chất này đóng vai trò quan trọng, quyết định giá trị dược liệu của loài nấm này, chúng gồm có: (i) Các hợp chất nitơ: adenine, adenosine, cordyceamides, cordycedipeptide, cordycepin, cordymin, cordysinin, dideoxyadenosine, guanine, guanosine, hypoxanthine, inosine, thymidine, thymine, uracil, uridine; (ii) Sterol: campesterol, cholesterol, daucosterol, ergosterol, sitisterol, stigmasterol; (iii) Polysaccharide và dẫn xuất: cordysinocan, glucan, heteroglycan, mannitol, mannoglucan; (iv) Các protein, acid amin: cadaverine, carboline, cordymin, flazin, methylpyrimidine, perlolyrine, putrescine, spermidine, spermine, tryptophan; (v) Acid phenolic: acetovanillone, acid hydroxybenzoic, acid protocatechuic, acid salicylic, acid syringic, acid vanillic; (vi) Isoflavone: daidzein, genistein, glycitein, orobol; (vii) Acid béo: acid docosanoic, acid lauric, acid lignoceric, acid linoleic, acid myristic, acid oleic, acid palmitic, acid palmitoleic, acid pentadecanoic, acid stearic, acid succinic; (viii) Các vitamin, các hợp chất bay hơi và các loại khoáng như Zn, Mg, Mn, Fe, Se, …. [7]. Y học hiện đại đã chứng minh nấm Cordyceps có các hoạt tính như điều hòa miễn dịch, kháng oxy hóa, ức chế hình thành khối u, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng di căn và tìm ra được một số cơ chế tác động chính lên các con đường sinh hóa của cơ thể. Do đó việc sử dụng Cordyceps không chỉ giới hạn trong tăng cường sức khỏe, mà còn được sử dụng trong phòng trị các bệnh về hô hấp, bệnh về thận, gan, tim mạch, tăng lipid máu, rối loạn miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư (bảng 1.1)